Summary
Здесь мы приводим протокол для характеристики мыши антральных ооцитов, основанных на ядрышек организации.
Introduction
Антральных полностью выращенные ооциты (GV, зародышевый пузырек), выделенные из антрального отделения яичника обычно используются для различных целей, таких как, например, изучение молекулярных и клеточных механизмов за созревание в пробирке до стадии II Метафаза.
Несмотря на их красивый внешний вид наиболее антральных ооцитов, но не все, могут завершить мейоза и достичь стадии бластоцисты; В самом деле, во многих видов млекопитающих, включая человека 1,2, примерно 30% из них задержать их развитие на этапе 2-клеточной, если происходит оплодотворение 3-5. На сегодняшний день, несколько параметров используются для различения между ооцитов, способных выдержать эмбрионального развития от тех, кто не сделать.
Например, Cresyl синий окрашивание (BCB) является допустимым методом для сортировки ооциты на основе активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, хотя-полезность этого метода сортировки, связанные с BCB + или BCB- окрашиванияпо-прежнему зависит 6-8 лаборатория.
Другой хорошо признанным методом заключается в их организации хроматина: если окрашивали либо интеркалирующих ДНК красителей (как Hoechst33342), 70% из антральных ооцитов показать кольцо красителя-положительных вокруг ядрышка и называются окружении ядрышка (SN), а оставшиеся 30% показать более пятнистых позитивные сигналы и называются не окружены Ядрышка (NSN) 3-5. Недавно мы показали, что отсутствие цитоплазматических решеток 9 (CPLS, важных мест хранения матерински полученных мРНК и рибосом в обоих ооцитов млекопитающих и эмбрионов) 10 и вниз регулирование MATER (важно для формирования CPLS 11), вместе с наличием липидов капли в цитоплазме их 9,12, могут быть и другие причины, связанные с невозможностью ооцитов NSN, чтобы продолжить за пределы стадии 2-клеток.
К сожалению, мало методы могут быть применены для сортировки антрального SN и NSN ооцитов и,по этой причине, развитие менее инвазивных методов (без ядерного окрашивания, процедуры фиксации или манипуляции с рот пипетками) может стать очень важно повысить ставки как эмбрионального развития человека и животных.
В этой статье мы подробно простой и быстрый протокол, используемый для выделения объявления сортировки SN и NSN антральных ооцитов из самок мышей и оно адресовано всем заинтересованным ученым в изучении женской гаметы, созревание яйцеклетки и развития зародыша.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол ведется в соответствии с руководящими принципами европейской (ЕС 63/2010) и итальянских (26/2014) законов, защищающих животных, используемых для научных исследований. Шейки дислокации эвтаназия используется для изоляции яичников и осуществляется экспертом и обучение лиц, перечисленных в утвержденном протоколе, охватывающий это исследование.
1. Животные
- Поддержание взрослый 3- до 6-недельных самок мышей в комнате с регулируемой температурой и влажностью (с фазами 12L: 12D и кормили вволю).
- Вводите мышей внутрибрюшинно 2,5 МЕ Беременные кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG), чтобы стимулировать рост фолликулов, имитируя эффект фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Изолировать яичники для антральных ооцитов сбора 48 часов позже. Эвтаназии женский мышь ранее введенный с ГСЖК, в соответствии с вашими институциональных принципов.
- Быстро удалить яичники из полости тела и поместить их в чашку Петри продолжениеAining M2 среду для последующего выделения ооцитов (раздел 3).
- Сделать надрез на коже покрывающей брюшную стенку с последующим разрез в брюшной полости с помощью ножниц рассечение стерильные. Откройте разрез, чтобы обнажить живот, двигаться кишки на одной стороне с использованием стерильных пинцетов и локализовать маточные трубы, образуя V-образную форму, начиная от мочевого пузыря.
- Соблюдайте яичники, расположенные ниже почек. Удерживайте каждую трубку стерильной пинцета и сделать небольшой надрез в нижней части яичников, чтобы освободить их. Передача обоих яичников в нижней части чашку Петри, содержащую предварительно уравновешенную среду.
2. Гормон Подготовка
- Развести PMSG (доступный в различных концентрациях фондовых) с стерильного раствора изотонический солевой раствор, чтобы получить рабочую концентрацию 2,5 МЕ гормона в 0,1 мл в течение соответствующего объема впрыска.
Примечание: Гормон растворы должны быть аликвоты в 0,5 мл пробирки и хранили при -20 ° С до дня применения. Не держите разводненной аликвоты дольше, чем три месяца при -20 ° C. После оттаивания, если выполняются последовательные инъекции, хранить аликвоты гормонов решений при +4 ° С и использовать их в течение 4 дней.
3. Антраль Ооциты Изоляция
Для правильной изоляции ооцитов:
- Равновесие M2 среду 13 (М2) в 5% CO 2 и 37 ° C в течение не менее 1 часа перед началом процедуры выделения ооцитов. Приготовьте два чашки Петри (35 мм х 10 мм), в одной из 1 мл м2 для яичников прокалывания и второй с мелких капель (20 мкл) М2, покрытого минеральным маслом (~ 1,5 мл) для передачи ооцитов после выделения из яичников (см 3,4-3,6). Держите обе чашки Петри в термостате при 5% CO 2 и 37 ° С до готовности, которые будут использоваться.
- Используйте стереомикроскопа во время процедуры изоляции ооцитов.
- Подготовка тонких стеклянных пипеток рот, чтобы собрать ооциты стретчHing стекла пипетки Пастера хранится в горизонтальном (удерживая концы пипетки с обеих рук), по вертикальной пламени, выходящего из горелкой Бунзена (рисунок 1).
- После того, как стекло начинает плавиться, принимать пипетки из пламени и выполнять быстрое движение вытягивания, чтобы получить желаемый пипетки. Плотно сократить избыточное стекло близко к узкой точки пипетки с ногтями, чтобы отрегулировать длину и диаметр внутренней капилляра. Убедитесь, что тонкая капиллярная имеет внутренний диаметр ~ 100 мкм, несколько большую, чем диаметр ооцита (~ 80 мкм).
- Для рот пипеткой, подключите один конец трубки аспиратора в выдвинутом пипетки с помощью соответствующего наконечник и поместите другой конец в рот, закрепив его с зубами.
- Сбор яичников с использованием стерильных пинцетов и хранение их на дне для культивирования клеток Петри (35 мм х 10 мм). Покрытие их с 1 мл М2, предварительно уравновешенную при 37 ° Си 5% СО 2 (рисунок 2).
- Осторожно проколоть антральных фолликулов яичников с помощью стерильного шприца инсулина иглы, чтобы освободить антральных ооцитов в М2 (рис 3).
- Осторожно рот пипеткой ооциты через узкий пипетки Пастера, чтобы удалить фолликулярных клеток и любую другую возможную мусора тканей (фиг.4А) и затем разрешать их в нижней части мелких капель (20 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, подходящей для культивирования эмбрионов (ранее подготовлен; 4В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы удалить все кучевые клетки, прикрепленные к пеллюцида ооцитов непрерывным отбором через несколько различных и капель М2. Выполните этот шаг как можно быстрее, чтобы избежать изменения в рН среды.
4. Антраль Ооциты Окрашивание Hoechst33342
ПРИМЕЧАНИЕ: антрального ооциты можно выделить SN (Окруженный ядрышка), NSN (не окружен ядрышко) илив любой другой форме промежуточного, на основе их организации хроматина после окрашивания прижизненной концентрации Hoechst33342 (или любой другой маркеров, специфических для баз в) 14. В самом деле, ооциты SN показывают Hoechst-положительный кольцо вокруг ядрышек, а не НСН, следовательно, его имя.
Для правильной окрашивания ооцитов:
- Передача ооцитов с использованием рот пипеткой в капли Hoechst33342 (20 мкл) разводили в М2 в прижизненной концентрации 50 нг / мкл в течение 10 мин в темноте.
- После инкубации с Hoechst33342, передавать каждый отдельный ооцит с рот пипеткой в нижней части мелких капель (5 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, для сортировки основан на организации хроматина (SN или НСН). Используйте любой флуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтром Hoechst33342 (длина волны излучения 486 нм), чтобы визуализировать конфигурацию хроматина ооцитов.
Примечание: В зависимости от типа используемого флуоресцентного микроскопа, ят может стать обязательным для использования со стеклянным дном чашки Петри для получения изображения. Конфокальная микроскопии Olympus Fluoview Fv10i, оснащена держателем образцов для 35 мм блюдо требует только стекло снизу блюда на приобретение изображений, с толщиной 0,17 стандартного мм и в диапазоне от 0,13 до 0,21 мм приемлемых. - Excite ооциты не более чем на 5-10 сек, вероятно, достаточно времени, чтобы визуализировать наличие или отсутствие кольца вокруг ядрышка (рис 5).
- После сортировки, культура антральный SN и NSN ооцитов в М2 в 5% СО 2 и 37 ° C, чтобы вызвать созревание в пробирке или держать их в соответствующих буферов для молекулярных или клеточных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следующие фотографии показывают метод, используемый для выделения ооцитов антральных из яичников мышей, начиная от подготовки к пипетки сортировки ооцитов »с помощью Hoechst33342. Этот метод достаточно прост и может быть выполнена в любой лаборатории, оборудованной СО 2 инкубаторе, стереомикроскопа и флуоресцентный микроскоп оснащен правильной фильтр для наблюдения за Hoechst33342 Рисунок 1 показывает начальный этап подготовки пипетки:. В качестве стекла начинает плавиться и стать мягкой, оба конца пипетки должны быть разъединены и, в то же время, пипетка должны быть выведены из пламени. Кроме того, стеклянный капилляр можно вытянуть таким же образом или с помощью микропипетки съемник, если правильно откалиброван. Это важный шаг, поскольку это очень важно иметь правильный рот пипеткой с правой капиллярной диаметром: если она слишком тонкая, ооциты могут быть фрагментированы внутри малой капитализацииIllary и умирают в течение нескольких минут, если он слишком большой, надлежащее всасывание среде, содержащей ооциты могут быть потеряны при перемещении ооциты, например, от одной капли к другой. фиг.2 и 3 показывают механическую изоляцию антральных ооцитов от антральных фолликулов с использованием стерильной иглой инсулина. Это довольно легко признать эти фолликулы, поскольку они характеризуются полости или антрума, содержащей жидкость, то есть среда, в которой зернистые клетки и ооциты найдены и через которые различные молекулы могут быть обменены на и от внешней среды. После того, как изолированные, антральных ооциты должны быть переданы от одной капли к другой М2 среды для удаления соматических клеток, окружающих яйцеклетки, как показано на фиг.4А и Б. Как только "оголенный", антральных ооциты готовы для классификации. Рисунок 5 показывает последний шаг этого протокола, то есть окрашивание изолированных антральных ооцитов с Hoechst33342 Fили быстро сортировки, основанный на их организации хроматина. Этот маркер пятна живых клеток намного быстрее, чем DAPI, например, и должен быть использован в прижизненной концентрации (50 нг / мкл), чтобы сохранить жизнеспособность клеток. Сотовый окрашивание организации хроматина, вероятно, наиболее важным шагом этого протокола: если ооциты рады слишком долго, они могут быть повреждены и стать непригодными для будущих очерков. В целом, если применяется к ооцитов мыши, это простой метод, который не требует особых мер предосторожности (для тех, которые указаны в разделе метода, кроме). Все стадии могут быть осуществлены при комнатной температуре.
Рисунок 1. Подготовка полости рта с использованием пипетки Пастера стекла пипетки и горелку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию Тхис фигурой.
Рисунок 2. Интактные яичников в чашке Петри, наполненной подогретого и уравновешенной M2 среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Начальная изоляции антральных ооцитов антральных фолликулов из посредством стерильной иглой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Передача свежевыделенных ооцитовс рот пипеткой из чашки Петри (A) на другую чашку Петри, содержащую небольшие капли подогретого и уравновешенной M2medium (B) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Яйцеклетки окрашенных и сортируются с Hoechst33342. Холост изображения NSN и SN ооцитов, принятых на конфокальной микроскопии Olympus Fluoview Fv10i (увеличения 60X; бар: 10 мкм; ФП: фазовый контраст). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод, используемый, чтобы изолировать и классифицировать мыши антральных GV ооцитов. Там нет особых важных шагов, чтобы подчеркнуть, с несколькими исключениями. Во-первых: эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы: а) поддерживать жизнеспособность ооцитов и б) избежать изменения рН в среде, используемой. Во-вторых, ооциты должны быть кратко возбужден (5-10 сек), чтобы Hoechst33342, чтобы избежать повреждения хроматина и последующей гибели ооцитов, особенно если IVM и IVF следующие шаги. На сегодняшний день, это самый быстрый способ сортировки SN и NSN мыши антральных ооцитов.
Hochest33342 было доказано, чтобы быть эффективный способ охарактеризовать SN и NSN ооцитов у самок мышей (и других млекопитающих лабораторных моделей), но это не может быть, к сожалению, используется для сортировки антральных ооцитов у человека в целях рождаемости.
Однако, поскольку созревание в пробирке незрелых ооцитов обычно используется в людях тоже, шоУльд быть чрезвычайно важно найти неинвазивный способ отличить «хорошие» яйцеклетки (то есть, SN) от "плохих" (т.е., NSN), чтобы увеличить успех экстракорпорального оплодотворения и последующего развития перспективных эмбрионов. Кроме того, изоляция и культура SN ооцитов из ткани яичников может быть использован для сохранения фертильности у женщин, перенесших рак или лечения страдающих яичников патологии.
Эксплуатируя это природное явление, важные данные могут быть предоставлены для понимания естественных потерь эмбрионов предимплантационной что говорит не только тех, кто заинтересован в фундаментальной биологии развития ооцитов, но и для человека и животных ЭКО врачей.
Последствия этой техники для здоровья человека, биополитика эмбрионов и репродукции животных являются значительными 15. Будучи в состоянии выявить и устранить "жизни несовместимые" ооцитов бызначительно повысить эффективный уровень методов ЭКО, что приводит к передовых решений для важных неудовлетворенных клинических потребностей.
На самом деле, международное научное сообщество гамет биологов может способствовать искать критические необходимых улучшений, чтобы применить этот протокол в порядке, человека ЭКО. Даже если протокол не может применяться к людям (по понятным причинам безопасности), она по-прежнему сохраняет огромное потенциала для улучшения знаний о связи между организацией хроматина (т.е. геном архитектура) и экспрессии генов в течение последних стадиях созревания антрального , одной из горячих тем в репродукции человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A.
