Summary
Nous présentons ici un protocole pour la caractérisation des ovocytes de souris antraux basés sur une organisation nucléolaire.
Introduction
Antraux ovocytes entièrement développés (GV, vésicule germinale) isolés du compartiment de l'antre de l'ovaire sont couramment utilisés à des fins différentes, tels que, par exemple, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires derrière la maturation in vitro jusqu'au stade métaphase II.
Malgré leurs belles apparence ovocytes plus antre, mais pas tous, sont en mesure de compléter la méiose et atteindre le stade de blastocyste; En fait, dans de nombreuses espèces de mammifères, dont les humains 1,2, environ 30% d'entre eux arrêter leur développement au stade 2 cellules, si la fécondation se produit 3-5. À ce jour, peu de paramètres sont utilisés pour distinguer entre les ovocytes capables de soutenir le développement embryonnaire de ceux qui sont incapables de le faire.
Par exemple, crésyle coloration au bleu (BCB) est une méthode valide pour trier les ovocytes sur la base de l'activité de glucose-6-phosphate déshydrogénase, bien que l'utilité de cette méthode de tri associées à la coloration ou + BCB est BCB-encore dépendants 6-8 laboratoire.
Une autre méthode bien établie réside dans leur organisation de la chromatine: si colorées avec des colorants intercalants de l'ADN (comme Hoechst33342), 70% des ovocytes antraux montre un anneau de colorant positive autour du nucléole et sont appelés Entouré Nucléole (SN), tandis que les 30% restants montrer un des signaux positifs plus tachetées et sont appelés pas entouré Nucléole (NSN) 3-5. Récemment, nous avons montré que l'absence de réseaux cytoplasmiques 9 (de CPL, sites de stockage importants pour l'ARNm et des ribosomes d'origine maternelle dans les deux ovocytes et des embryons de mammifères) 10 et la régulation à la baisse de MATER (essentiel pour la formation CPL 11), avec la présence de gouttelettes de lipides dans leur cytoplasme 9,12, peuvent être d'autres causes liées à l'incapacité des ovocytes NSN à aller au-delà du stade 2 cellules.
Malheureusement, quelques techniques peuvent être appliquées pour trier SN antre et ovocytes RSN et,pour cette raison, le développement d'une méthode moins invasive (sans coloration nucléaire, les procédures de fixation ou de manipulation aux pipettes bouche) pourrait devenir très important d'augmenter les taux de développement de l'embryon à la fois humaine et animale.
Dans cet article, nous détaillons le protocole simple et rapide utilisé pour isoler annonce SN de tri et RSN ovocytes antre de souris femelles et elle est adressée à tous les scientifiques intéressés par l'étude de la gamétogenèse femelle, la maturation des ovocytes et le développement de l'embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole est réalisée en conformité avec les principes directeurs du européenne (UE) 63/2010 et 26/2014) (lois italiennes de protection des animaux utilisés pour la recherche scientifique. Cervicale dislocation euthanasie est utilisé pour ovaires isolement et elle est effectuée par des experts et des personnes énumérées dans le protocole approuvé couvrant cette étude formé.
1. Les animaux
- Maintenir adultes 3- à des souris femelles de 6 semaines, âgé dans une salle à température contrôlée et l'humidité (avec des phases de 12L: 12D et nourris ad libitum).
- Injecter les souris par voie intraperitoneale avec 2,5 UI de gonadotrophine Pregnant Mare sérique (PMSG) pour stimuler la croissance folliculaire en imitant les effets de l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Isoler les ovaires pour les ovocytes antraux collecte de 48 heures plus tard. Euthanasier la souris femelle préalablement injecté avec PMSG, selon vos directives institutionnelles.
- Supprimer rapidement les ovaires de la cavité du corps et placez-les dans le plat de Pétri suiteaining milieu M2 pour l'isolation des ovocytes ultérieure (voir section 3).
- Faire une incision sur la peau recouvrant la paroi abdominale suivie par une incision dans le péritoine à l'aide des ciseaux de dissection stériles. Ouvrir l'incision pour exposer l'abdomen, le cran se déplacer d'un côté à l'aide des pinces stériles et localiser les trompes utérines, formant une forme en V à partir de la vessie.
- Respecter les ovaires situés sous les reins. Maintenez chaque tube avec pince stérile et faire une petite incision au bas des ovaires pour les libérer. Transfert des deux ovaires au fond d'une boîte de Pétri contenant le milieu pré-équilibrée.
2. Hormone Préparation
- Diluer PMSG (disponible en différentes concentrations sous licence) avec une solution saline isotonique stérile pour obtenir une concentration de travail de 2,5 UI d'hormone par 0,1 ml pour un volume d'injection approprié.
REMARQUE: Les solutions d'hormone doivent être aliquotées dans 0,5 ml tubes et conservés à -20 ° C jusqu'au jour d'utilisation. Ne gardez pas aliquotes dilué de plus de trois mois à -20 ° C. Une fois décongelé, si les injections sont effectuées en série, stocker les aliquotes de solutions d'hormones à +4 ° C et les utiliser dans les 4 jours.
3. Antral ovocytes Isolement
Pour l'isolement de bon ovocytes:
- Equilibrer milieu M2 13 (M2) à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant au moins 1 heure avant de procéder à l'isolement d'ovocytes. Préparer deux boîtes de Petri (35 mm x 10 mm), l'une avec 1 ml de M2 pour ponction des ovaires et l'autre avec de petites gouttes (20 ul) de M2 recouvert d'huile minérale (~ 1,5 ml) pour le transfert des ovocytes après isolement à partir de la ovaire (voir 3,4-3,6). Gardez les deux boîtes de Pétri dans l'incubateur à 5% de CO 2 et 37 ° C jusqu'à ce que prêt à être utilisé.
- Utilisez un stéréomicroscope pendant les procédures d'isolement de ovocytes.
- Préparer fines pipettes bouche de verre pour recueillir les ovocytes par la stretchhing pipettes Pasteur en verre maintenues horizontalement (en maintenant les extrémités de la pipette avec les deux mains), au cours d'une flamme verticale venant du brûleur Bunsen (figure 1).
- Une fois le verre commence à fondre, prendre la pipette de la flamme et effectuer un mouvement de traction rapide pour obtenir la pipette souhaitée. Fermement couper le verre dépassement proche de la pointe de la pipette avec les ongles pour ajuster la longueur et le diamètre du capillaire interne étroite. Assurez-vous que le capillaire mince a un diamètre interne de 100 um ~, légèrement plus grande que le diamètre de l'ovocyte (~ 80 um).
- Pour la bouche pipette, connectez une extrémité du tube d'aspiration à la pipette tiré par aide d'une pointe appropriée et placer l'autre extrémité dans la bouche, en le fixant avec les dents.
- Recueillir les ovaires en utilisant des pinces stériles et les déposer au fond d'une boîte de culture cellulaire de Petri (35 mm x 10 mm). Couvrir avec 1 ml de M2 préalablement équilibrées à 37 ° Cet 5% de CO 2 (Figure 2).
- Percer délicatement les follicules antraux des ovaires avec une aiguille insuline seringue stérile pour libérer ovocytes antraux en M2 (figure 3).
- Doucement bouche Déposer le ovocytes à travers une pipette Pasteur étroite pour éliminer les cellules folliculaires et tout autre débris de tissu possible (figure 4A), puis de les régler au fond de petites gouttes (20 pi) de M2 couverts avec de l'huile minérale approprié pour la culture d'embryons (précédemment préparé; figure 4B).
NOTE: Il est important d'enlever toutes les cellules du cumulus attachés à la zone pellucide des ovocytes par pipetage continu à travers plusieurs et différentes gouttes de M2. Effectuer cette étape aussi vite que possible pour éviter des modifications du pH du milieu.
4. Antral ovocytes coloration avec Hoechst33342
REMARQUE: ovocytes antraux peut être distinguée de SN (Entouré Nucléole), NSN (Non Entouré Nucléole) oude toute autre forme intermédiaire, en fonction de leur organisation de la chromatine après coloration avec la concentration de supravital Hoechst33342 (ou d'autres marqueurs spécifiques pour les bases AT) 14. En fait, les ovocytes SN montrent un anneau Hoechst positif autour de la nucléole tandis que le NSN ne le font pas, d'où son nom.
Pour la coloration de ovocytes appropriée:
- Transférer les ovocytes en utilisant une pipette en bouche gouttes de Hoechst33342 (20 pi) dilué dans M2 à la concentration supravital de 50 ng / ul pendant 10 min dans l'obscurité.
- Après l'incubation avec Hoechst33342, transférer chaque ovocyte unique avec une pipette de la bouche au bas de petites gouttes (5 pi) de M2 couverts avec de l'huile minérale, pour le tri sur la base organisation de la chromatine (SN ou NSN). Utilisez toute microscope à fluorescence équipé d'un filtre Hoechst33342 (d'onde d'émission 486 nm) pour visualiser la configuration de la chromatine des ovocytes.
REMARQUE: Selon le type de microscope à fluorescence utilisé, it peut devenir impératif d'utiliser à fond de verre boîte de Pétri pour l'acquisition d'image. La microscopie confocale Olympus Fluoview Fv10i lorsqu'il est équipé d'un porte-échantillon pour boîte de 35 mm nécessite verre seulement bas-plats pour l'acquisition d'image, avec une épaisseur standard 0,17 mm et une gamme de 0,13 à 0,21 mm acceptables. - Exciter les ovocytes pour pas plus de 5-10 secondes, probablement assez de temps pour visualiser la présence ou l'absence d'un anneau autour de la nucléole (Figure 5).
- Après le tri, la culture de la SN de l'antre et ovocytes RSN en M2 à 5% de CO 2 et 37 ° C pour induire la maturation in vitro ou les conserver dans des tampons appropriés pour des analyses moléculaires ou cellulaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les images suivantes montrent la méthode utilisée pour isoler les ovocytes antraux à partir d'ovaires de souris, à partir de pipettes préparation au tri des ovocytes au moyen d'Hoechst33342. Cette méthode est assez simple et peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire équipé d'un incubateur à CO 2, un stéréomicroscope et un microscope à fluorescence équipé du filtre adapté à l'observation de la Hoechst33342 La figure 1 représente l'étape initiale de préparation de la pipette. Comme le verre commence à fondre et à devenir souple, les deux extrémités de la pipette doivent être séparés et, en même temps, la pipette doit être retiré de la flamme. En variante, capillaire de verre peut être tiré de la même façon ou en utilisant un extracteur micropipette, si bien calibré. Ceci est une étape cruciale, car il est très important d'avoir la pipette de la bouche droite avec le diamètre capillaire droite: si elle est trop mince, les ovocytes peuvent être fragmentés à l'intérieur du petit bonnetIllary et mourir en quelques minutes, si elle est trop grande, une aspiration appropriée du milieu contenant les ovocytes peut être perdue lors du déplacement des ovocytes, par exemple, à partir d'une goutte à l'autre. Les figures 2 et 3 montrent l'isolation mécanique des ovocytes antraux à partir de follicules antraux aide d'une aiguille stérile de l'insuline. Il est assez facile de reconnaître ces follicules car ils sont caractérisés par une cavité ou antre contenant un fluide, qui est le milieu dans lequel se trouvent les cellules de la granulosa et des ovocytes et à travers laquelle des molécules différentes peuvent être échangées vers et depuis l'environnement extérieur. Une fois isolés, les ovocytes antraux doivent être transférés d'une goutte à l'autre du milieu M2 pour éliminer les cellules somatiques entourant les ovocytes, comme indiqué dans les figures 4A et B. Une fois "dénudées", les ovocytes antraux sont prêts pour la classification. La figure 5 montre la dernière étape de ce protocole, qui est la coloration des ovocytes antraux isolés avec Hoechst33342 fou d'un tri rapide basée sur leur organisation de la chromatine. Ce marqueur taches cellules, vivant beaucoup plus rapidement que DAPI par exemple, et doivent être utilisés à la concentration supravital (50 ng / ul) afin de préserver la viabilité des cellules. Cellule coloration pour organisation de la chromatine est probablement l'étape la plus critique de ce protocole: si les ovocytes sont excités trop longtemps, ils peuvent être endommagés et deviennent inutilisables pour les essais futurs. Dans l'ensemble, si elle est appliquée à des ovocytes de souris, ceci est une méthode simple qui ne nécessite pas de précautions particulières (à l'exception de ceux indiqués dans la section de la méthode). Toutes les étapes peuvent être effectuées à température ambiante.
Figure 1. Préparation d'une pipette de bouche à l'aide de pipettes Pasteur en verre et un bec Bunsen. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de this figure.
Figure 2. ovaires intacts dans boîte de Pétri remplie de milieu M2 préchauffé et équilibrée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. isolement initial d'ovocytes antre de follicules antraux au moyen d'une aiguille stérile. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Transfert des ovocytes fraîchement isolésavec une pipette de la bouche de la boîte de Pétri (A) pour un plat différent de Pétri contenant de petites gouttes d'préchauffé et équilibrée M2medium (B) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. ovocytes colorées et triés avec Hoechst33342. Images uniques de RSN et SN ovocytes prises au microscope confocal Olympus Fluoview Fv10i (grossissement 60X; bar: 10 pm; PhC: contraste de phase). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit la méthode utilisée pour isoler et classer l'antre de la souris ovocytes GV. Il n'y a pas des étapes cruciales notamment pour souligner, à quelques exceptions près. Premièrement: cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible à: a) maintenir la vitalité des ovocytes et b) d'éviter les changements de pH dans le moyen utilisé. Deuxièmement: ovocytes doivent être brièvement excité (5-10 sec) pour Hoechst33342 pour éviter les dommages de la chromatine et la mort subséquente des ovocytes, surtout si l'IVM et FIV sont les étapes suivantes. À ce jour, est le moyen le plus rapide pour trier SN et NSN souris ovocytes antre.
Hochest33342 a été prouvé être un moyen efficace pour caractériser SN et RSN ovocytes chez les souris femelles (et d'autres modèles de laboratoire de mammifères), mais il ne peut pas être, malheureusement, utilisée pour trier les ovocytes antre chez les humains à des fins de fertilité.
Cependant, depuis la maturation in vitro d'ovocytes immatures est couramment utilisé chez l'homme aussi, il woULD être extrêmement important de trouver un moyen non invasif de distinguer les «bons» ovocytes (c.-à-SN) des «mauvaises» (c.-à-NSN) pour augmenter le succès de la fécondation in vitro et le développement ultérieur des embryons potentiels. En outre, l'isolement et la culture des ovocytes SN à partir de tissu ovarien pourraient être utilisés pour la conservation de la fécondité chez les femmes subissant des traitements du cancer ou souffrant de pathologies de l'ovaire.
En exploitant ce phénomène naturel, les données importantes pourraient être fournis pour la compréhension de l'embryon préimplantatoire pertes qui ne parle pas seulement de ceux qui sont intéressés dans la biologie de base du développement de l'ovocyte, mais aussi pour les cliniciens de FIV humaines et animales d'origine naturelle.
Les implications de cette technique pour la santé humaine, la biopolitique d'embryons et de la reproduction animale sont significatifs 15. Etre capable d'identifier et d'éliminer les ovocytes "la vie serait incompatible"élever considérablement le niveau efficace des techniques de fécondation in vitro, conduisant à des solutions de pointe pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits importants.
En fait, la communauté scientifique internationale de biologistes de gamètes pourrait contribuer à rechercher les améliorations essentielles nécessaires pour appliquer ce protocole à des procédures de FIV humaines. Même si le protocole ne peut pas être appliquée à l'homme (pour des raisons de sécurité claires), il garde encore une énorme capacité à améliorer la connaissance du lien entre l'organisation de la chromatine (par exemple, l'architecture du génome) et l'expression des gènes au cours des dernières étapes de la maturation de l'antre , l'un des sujets d'actualité dans la reproduction humaine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A.
