Summary
Här presenterar vi ett protokoll för karakterisering av mus antrala oocyter baserade på nukleolär organisation.
Introduction
Antrala fullvuxna oocyter (GV, germinal vesikel) isolerade från antral utrymmet i äggstocken används rutinmässigt för olika ändamål, såsom, till exempel, studier av de molekylära och cellulära mekanismerna bakom in vitro-mognad to Metaphase II stadium.
Trots deras vackra utseende mest antral ägg, men inte alla, har möjlighet att slutföra meios och nå blastocyststadiet; i själva verket i många däggdjursarter, inklusive människor 1,2, ungefär 30% av dem gripa deras utveckling vid 2-cellstadiet, om befruktning sker 3-5. Hittills har några parametrar som används för att skilja mellan äggceller kunna upprätthålla den embryonala utvecklingen från de som inte kan göra det.
Till exempel är Cresyl blåfärgning (BCB) en giltig metod för att sortera oocyterna baserade på aktiviteten av glukos-6-fosfat-dehydrogenas fastän användbarheten av denna sorteringsmetod relaterat till BCB + eller BCB- färgningen ärfortfarande beroende 6-8 laboratorium.
En annan väl etablerad metod ligger i deras kromatin organisation: om färgas med någon DNA interkalerande färgämnen (som Hoechst33342), 70% av antral oocyter visar en färg positiv ring runt kärnsystemet och kallas Omgiven kärnsystemet (SN), medan resterande 30% visar en mer prickiga positiva signaler och kallas inte Omgiven kärnsystemet (NSN) 3-5. Nyligen visade vi att frånvaron av cytoplasmiska gitter 9 (CPLS, viktiga lagringsplatser för maternella mRNA och ribosomer i både däggdjurs oocyter och embryon) 10 och nedreglering av MATER (väsentliga för cpls formation 11), tillsammans med förekomsten av lipiddroppar inom sina cytoplasmor 9,12, kan finnas andra orsaker relaterade till NSN oocyter oförmåga att fortsätta bortom två-cellstadiet.
Tyvärr kan några tekniker användas för att sortera antral SN och NSN ägg ochAv denna anledning, kan utvecklingen av en mindre invasiv metod (utan nukleär färgning, fixeringsförfaranden eller manipulation med mun pipetter) blir mycket viktigt att öka andelen både människors och djurs embryoutveckling.
I detta papper, vi detalj snabbt och enkelt protokoll som används för att isolera annons sortera SN och NSN antral oocyter från honmöss och det riktar sig till alla de forskare som är intresserade av att studera kvinnliga gametogenes, oocytmognad och embryoutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll genomförs i enlighet med de vägledande principerna för den europeiska (EU 63/2010) och italienska (26/2014) lagar som skyddar djur som används för vetenskaplig forskning. Halsdislokation dödshjälp används för äggstockar isolering och den utförs av expert och utbildad personer som anges i den godkända protokoll som omfattar denna studie.
1. Djur
- Behåll vuxen 3- till 6 veckor gamla honmöss i ett rum med kontrollerad temperatur och luftfuktighet (med faser av 12L: 12D och utfodras ad lib).
- Injicera möss intraperitonealt med 2,5 IE Gravida mare serum gonadotropin (PMSG) att stimulera follikeltillväxt genom att efterlikna effekterna av follikelstimulerande hormon (FSH). Isolera äggstockarna för antral oocyter insamlings 48 timmar senare. Avliva den kvinnliga musen tidigare injicerats med PMSG, enligt dina institutionens riktlinjer.
- Snabbt ta bort äggstockarna från kroppen hålighet och placera dem i petriskål fortsaining M2 medium för efterföljande ägg isolering (se avsnitt 3).
- Gör ett snitt på huden som täcker bukväggen följt av en incision i peritoneum genom användning av sterila dissektion sax. Öppna snittet för att exponera buken, flytta innanmätet på en sida med användning av sterila pincetter och lokalisera äggledarna, som bildar en V-form med början från blåsan.
- Observera äggstockarna placerade under njurarna. Håll varje rör med steril pincett och göra ett litet snitt i botten av äggstockarna att släppa dem. Överför båda äggstockarna på botten av en petriskål innehållande förekvilibrerats mediet.
2. hormonpreparat
- Späd PMSG (finns i olika lager koncentrationer) med steril isoton koksaltlösning för att få en arbetskoncentration av 2,5 IU hormon per 0,1 ml under en lämplig injektionsvolym.
OBS: Hormon lösningar måste alikvoteras i 0,5 ml rör och lagrades vid -20 ° C tills användningsdagen. Förvara inte utspädda prover längre än tre månader vid -20 ° C. När tinats, om serie injektioner utförs, lagra alikvoter av hormonlösningar vid 4 ° C och använda dem inom 4 dagar.
3. Antral Oocyter Isolering
För korrekt äggceller isolering:
- Jämvikta M2-medium 13 (M2) vid 5% CO2 och 37 ° C under minst en timme innan oocyterna isoleringsförfarandet. Bered två petriskålar (35 mm x 10 mm), en med 1 ml M2 för äggstock punktering och andra med små droppar (20 l) av M2 täckt med mineralolja (~ 1,5 ml) för äggceller överföring efter isolering från äggstock (se 3,4-3,6). Förvara både petriskålar i inkubator vid 5% CO2 och 37 ° C tills den ska användas.
- Använd ett stereomikroskop under oocyter isoleringsförfaranden.
- Förbered tunna mun glaspipetter att samla in ägg med stretchHing glas Pasteur pipetter hålls horisontellt (som håller ändarna av pipetten med båda händerna) över en vertikal flamma som kommer från bunsenbrännare (Figur 1).
- När glaset börjar smälta, ta pipetten ut ur flamman och utför en snabb dragande rörelse för att erhålla den önskade pipetten. Fast skär den överskjutande glas nära den smala punkten av pipetten med naglarna att justera längden och diametern av den inre kapillären. Se till att den tunna kapillären har en inre diameter på ~ 100 | im, är något större än oocyten diameter (~ 80 | im).
- Till mun pipett anslut ena änden av sugröret till drog pipetten genom att använda en lämplig spets och placera den andra änden i munnen, säkra den med tänderna.
- Samla äggstockarna med användning av sterila pincetter och deponera dem på botten av ett cellodlingspetriskål (35 mm x 10 mm). Täcka dem med 1 ml M2 som tidigare ekvilibrerats vid 37 ° Coch 5% CO2 (figur 2).
- Punktera försiktigt antrala folliklar av äggstockarna med en steril insulinspruta nål för att frigöra antral ägg i M2 (Figur 3).
- Försiktigt munnen Pipettera oocyterna genom en smal pasteurpipett för avlägsnande av follikelceller och alla andra möjliga vävnadsrester (Figur 4A) och sedan sedimentera dem på botten av små droppar (20 | il) av M2-täckt med mineralolja som är lämplig för embryokultur (tidigare förberedd, figur 4B).
OBS: Det är viktigt att ta bort alla cumulusceller knutna till zona pellucida av oocyter genom kontinuerlig pipettering genom flera och olika droppar M2. Utföra detta steg så snabbt som möjligt för att undvika förändringar i pH för mediet.
4. Antral Oocyter färgning med Hoechst33342
OBS: antral oocyter kan urskiljas i SN (Omgiven kärnsystemet), NSN (Ej Omgiven nucleolus) elleri någon annan mellanform, baserat på deras kromatin organisation efter färgning med supravital koncentration av Hoechst33342 (eller andra markörer specifika för baser AT) 14. I själva verket, den SN oocyter visar en Hoechst-positiv ring runt kärnsystemet medan NSN inte, därav namnet.
För korrekt äggceller färgning:
- Överför oocyter med användning av en mun pipett till droppar Hoechst33342 (20 | il) utspädd i M2 på den supravital koncentration av 50 ng / ul i 10 min i mörker.
- Efter inkubering med Hoechst33342, överföra varje enskild oocyt med en mun pipett på botten av små droppar (5 | il) av M2-täckta med mineralolja, för sortering baserad på kromatin organisation (SN eller NSN). Använd någon fluorescensmikroskop utrustat med Hoechst33342 filter (emissionsvåglängd 486 nm) att visualisera konfigurationen kromatinet av ägg.
OBS: Beroende på vilken typ av fluorescensmikroskop används it kan bli nödvändigt att använda glas botten petriskål för bildtagning. Den konfokalmikroskopi Olympus Fluoview Fv10i när den är utrustad med en provhållare för 35 mm maträtt kräver endast glas botten-rätter för bildtagning, med 0,17 mm standardtjocklek och ett område från 0,13 till 0,21 mm acceptabla. - Excite oocyter längre än 5-10 sekunder, troligen tillräckligt med tid att visualisera närvaron eller frånvaron av en ring runt kärnsystemet (Figur 5).
- Efter sortering, kulturen antral SN och NSN oocyter i M2 vid 5% CO2 och 37 ° C för att inducera in vitro mognad eller behålla dem i lämpliga buffertar för molekylära eller cellulära analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande bilder visar den metod som används för att isolera antral ägg från mus äggstockar, utgående från pipetter förberedelse till oocyterna "sortering genom Hoechst33342. Denna metod är ganska enkel och kan utföras i något laboratorium utrustat med en CO-2-inkubator, ett stereomikroskop och ett fluorescensmikroskop utrustat med rätt filter för observation av Hoechst33342 Figur 1 visar det första steget i pipett preparatet:. Som glaset börjar smälta och blir mjuk, måste båda ändarna av pipetten dras isär och, på samma gång, måste pipetten tas ut ur flamman. Alternativt kan glaskapillär dras på samma sätt eller med hjälp av en mikropipett avdragare, om det är korrekt kalibrerad. Detta är ett viktigt steg eftersom det är mycket viktigt att ha rätt mun pipett med rätt kapillärdiameter: om det är för tunn, kan oocyter fragmenteras inne i småbolagIllary och dör i några minuter, om den är för stor, en korrekt sugning av mediet innehållande oocyterna kan förloras vid förflyttning oocyterna, exempelvis från en droppe till en annan. Figurerna 2 och 3 visar den mekaniska isoleringen av antrala oocyter från antrala folliklar med hjälp av en steril insulin nål. Det är ganska lätt att känna igen dessa folliklar eftersom de kännetecknas av en hålighet eller antrum innehållande en fluid, som är det medium i vilket de granulosaceller och oocyt hittas och genom vilken olika molekyler kan växlas till och från den yttre miljön. När isolerade, antral oocyter måste överföras från en droppe till en annan av M2-medium för att avlägsna somatiska celler som omger oocyter, som visas i figurerna 4A och B. Once "utblottad", antral ägg är redo för klassificering. Figur 5 visar det sista steget av detta protokoll, är att färgning av de isolerade antral ägg med Hoechst33342 feller en snabb sortering baserat på deras kromatin organisation. Denna markör fläckar levande celler mycket snabbare än DAPI, till exempel, och måste användas vid supravital koncentration (50 ng / l) för att bevara cellviabilitet. Cellfärgning för kromatin organisation är förmodligen den mest kritiska steget i detta protokoll: om ägg är glada för länge de kan skadas och bli oanvändbart för framtida essäer. Sammantaget, om de tillämpas på musoocyter, är det här en enkel metod som inte kräver särskilda försiktighetsåtgärder (med undantag för de som anges i metoddelen). Alla steg kan utföras vid rumstemperatur.
Figur 1. Beredning av en mun pipett använda glas Pasteur pipetter och en bunsenbrännare. Klicka här för att se en större version av this siffra.
Figur 2. Intakt äggstockar i petriskål fylld med förvärmd och jämvikt M2-medium. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Första isolering av antral äggceller från antrala folliklar med hjälp av en steril nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Överföring av de nyligen isolerade oocytermed en mun pipett ur petriskål (A) till en annan petriskål med små droppar av förvärmd och jämvikt M2medium (B) klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Oocyter färgas och sorteras med Hoechst33342. Enstaka bilder från NSN och SN oocyter tagna vid konfokalmikroskop Olympus Fluoview Fv10i (förstoring 60X, bar: 10 m; PhC: faskontrast). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver den metod som används för att isolera och klassificera mus antrala GV-oocyter. Det finns inga särskilda viktiga steg för att understryka, med några få undantag. Först: denna procedur bör utföras så snabbt som möjligt för att: a) upprätthålla livskraften i oocyterna och b) att undvika pH-förändringar i det medium som används. För det andra: oocyter bör vara kort upphetsad (5-10 sek) till Hoechst33342 att undvika kromatin skador och efterföljande död oocyterna, särskilt om IVM och IVF är följande steg. Hittills är detta det snabbaste sättet att sortera SN och NSN mus antrala oocyter.
Hochest33342 har visat sig vara ett effektivt sätt att karakterisera SN och NSN ägg i honmöss (och andra däggdjurslaboratorie modeller), men det kan inte vara, tyvärr, som används för att sortera antral ägg i människor för fertilitetsändamål.
Eftersom in vitro mognad av omogna oocyter används rutinmässigt på människor också, wo detuld vara oerhört viktigt att hitta en icke-invasiv metod för att skilja de "goda" ägg (dvs, SN) från de "dåliga" ettor (dvs NSN) för att öka framgången för provrörsbefruktning och efterföljande potentiella embryon utveckling. Dessutom kan isolering och odling av SN ägg från äggstocksvävnad användas för fertilitetsbevarande hos kvinnor som genomgår cancerbehandling eller lider av äggstocks patologier.
Genom att utnyttja denna naturfenomen, skulle viktiga data lämnas för förståelsen av naturligt förekommande embryo preimplantatorisk förluster som talar inte bara till dem som är intresserade i den grundläggande biologi oocytutveckling utan också för människor och djur IVF kliniker.
Konsekvenserna av denna teknik för människors hälsa, biopolitik av embryon och djur reproduktion är betydande 15. Att kunna identifiera och eliminera "livs oförenligt" oocyter skullekraftigt höja den faktiska nivån på IVF-teknik, vilket leder till banbrytande lösningar för viktiga kliniska behov.
I själva verket kan det internationella forskarsamhället av könsceller biologer bidra att söka kritiska förbättringar som krävs för att tillämpa detta protokoll till humana IVF. Även om protokollet inte kan tillämpas på människor (tydliga säkerhetsskäl), fortfarande håller den en enorm förmåga att förbättra kunskapen om sambandet mellan kromatin organisation (det vill säga, genom arkitektur) och genuttryck under slutskedet av antral mognad , en av de heta ämnen i mänsklig reproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
