Summary
Her præsenterer vi en protokol til karakterisering af muse antral oocytter baseret på nucleolar organisation.
Introduction
Antrale fuldvoksne oocytter (GV, kimblære) isoleret fra antrale rum i æggestokkene rutinemæssigt anvendes til forskellige formål, såsom for eksempel undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer bag in vitro modning Til Metafase II fase.
På trods af deres smukke udseende mest antrale oocytter, men ikke alle, er i stand til at fuldføre meiose og nå blastocyst-stadiet; faktisk i mange pattedyrarter, herunder mennesker 1,2, ca. 30% af dem standse deres udvikling ved 2-celle stadiet, hvis befrugtning sker 3-5. Til dato anvendes få parametre til at skelne mellem oocytter stand til at opretholde den embryoniske udvikling fra dem i stand hertil.
For eksempel Cresyl blåfarvning (BCB) er en gyldig metode til at sortere oocytter baseret på aktiviteten af glucose-6-phosphat dehydrogenase skønt anvendeligheden af denne sorteringsmetode relateret til BCB + eller BCB- farvningen erstadig laboratorium afhængige 6-8.
En anden veletableret metode ligger i deres kromatin organisation: hvis farves med eventuelle DNA-interkalerende farvestoffer (som Hoechst33342), 70% af antrale oocytter viser et farvestof-positiv ring omkring nucleolus og kaldes Omgivet nucleolus (SN), mens de resterende 30% viser en mere plettet positive signaler og kaldes Ikke Omgivet nucleolus (NSN) 3-5. For nylig viste vi, at fraværet af cytoplasmatiske gitre 9 (cpls, vigtige lagringssteder for maternelle mRNA og ribosomer i både pattedyr oocyter og embryoner) 10 og nedregulering af MATER (afgørende for cpls dannelse 11), sammen med tilstedeværelsen af lipiddråber i deres cytoplasmaer 9,12, kan være andre årsager i forbindelse med NSN oocytter manglende evne til at gå ud over den 2-celle stadiet.
Desværre kan få teknikker anvendes til at sortere antral SN og NSN oocyter ogaf denne grund, kan udviklingen af en mindre invasiv metode (uden nuklear farvning, fikseringen eller manipulation med munden pipetter) bliver meget vigtigt at øge satserne for både udvikling af menneskelige og dyrs foster.
I dette papir, vi detalje den enkle og hurtige protokol, der bruges til at isolere annonce sortere SN og NSN antrale oocytter fra hunmus, og den er rettet til alle de forskere interesseret i studiet af kvindelige gametogenese, oocytmodning og udvikling foster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol gennemføres i overensstemmelse med de ledende principper for europæisk (EU 63/2010) og italiensk (26/2014) love, der beskytter dyr, der anvendes til videnskabelig forskning. Cervikal dislokation eutanasi bruges til æggestokke isolering og det udføres af ekspert og uddannede personer, der er opført i den godkendte protokol, der dækker denne undersøgelse.
1. Dyr
- Bevar voksen 3- til 6 uger gamle hunmus i et rum med kontrolleret temperatur og fugtighed (med faser 12L: 12D og fodres ad libitum).
- Injicere mus intraperitonealt med 2,5 IU drægtig hoppe-serum gonadotropin (PMSG) at stimulere follikelvækst ved at efterligne virkningerne af follikelstimulerende hormon (FSH). Isoler æggestokkene for antrale oocytter indsamling 48hrs senere. Aflive den kvindelige mus tidligere injiceret med PMSG, i henhold til dine institutionelle retningslinier.
- Fjern hurtigt æggestokkene fra kroppen hulrum og placere dem i petriskål fortsaining M2 medium til efterfølgende oocytter isolation (se afsnit 3).
- Lave et snit på huden, der dækker bugvæggen efterfulgt af et snit i peritoneum under anvendelse af sterile dissektion saks. Åbne snit for at blotlægge maven, flytte modet på den ene side anvendelse af sterile pincetter og lokalisere det æggeledere, danner en V-form startende fra blæren.
- Overhold æggestokkene placeret under nyrerne. Hold hvert rør med sterilt pincet og lave et lille snit i bunden af æggestokkene til at frigive dem. Overfør begge æggestokke i bunden af en petriskål indeholdende præ-ækvilibreret medium.
2. hormonpræparat
- Fortynd PMSG (fås i forskellige lager koncentrationer) med sterilt isotonisk saltopløsning for at opnå en arbejdsgruppe koncentration på 2,5 IU hormon per 0,1 ml efter en passende injektion volumen.
BEMÆRK: Hormon løsninger skal alikvoteret i 0,5 ml rør og opbevares ved -20 ° C, indtil den dag brug. Må ikke holde fortyndede prøver længere end tre måneder ved -20 ° C. Når optøet, hvis serielle injektioner udføres, gemme portioner af hormon-løsninger ved +4 ° C og bruge dem inden for 4 dage.
3. Antral Oocyter Isolation
For korrekt oocytter isolation:
- Ækvilibrere M2 medium 13 (M2) ved 5% CO2 og 37 ° C i mindst 1 time før start af oocytter isolation procedure. Forbered to petriskåle (35 mm x 10 mm), en med 1 ml M2 for ovarie punktering og den anden med små dråber (20 pi) i M2 dækket med mineralsk olie (~ 1,5 ml) til oocytter overførsel efter isolering fra ovarie (se 3,4-3,6). Hold begge petriskåle i inkubatoren ved 5% CO2 og 37 ° C, indtil klar til brug.
- Brug et stereomikroskop under oocytter isoleringsprocedurer.
- Forbered tynde mund glas pipetter til at indsamle oocytterne ved stræhing glas Pasteur-pipetter holdes vandret (holder enderne af pipetten med begge hænder), over en vertikal flamme kommer fra bunsenbrænder (figur 1).
- Når glasset begynder at smelte, tage pipette ud af flammen og udføre en hurtig trækbevægelse at opnå den ønskede pipette. Fast skære det overskydende glas tæt på den smalle punkt af pipetten med fingernegle for at justere længden og diameteren af det indre kapillær. Sikre, at den tynde kapillar har en indvendig diameter på ~ 100 um, lidt større end oocyt diameter (~ 80 pm).
- Til mund pipette, slutte den ene ende af sugerøret til den trukket pipette ved at bruge en passende spids og placer den anden ende i munden, sikre det med tænderne.
- Saml æggestokkene under anvendelse af sterile pincetter og deponere dem på bunden af en cellekultur petriskål (35 mm x 10 mm). Dække dem med 1 ml M2 tidligere ækvilibreret ved 37 ° Cog 5% CO 2 (figur 2).
- Forsigtigt punktere antrale follikler i æggestokkene med en steril kanyle insulin til frigivelse antrale oocytter i M2 (figur 3).
- Forsigtigt munden pipette oocytterne gennem en smal Pasteur pipette til fjernelse af follikelceller og anden mulig vævsrester (figur 4A) og derefter afvikle dem på bunden af små dråber (20 pi) i M2 dækket med mineralolie egnet til embryokultur (tidligere forberedt, figur 4B).
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne alle de cumulusceller knyttet til zona pellucida af oocytter ved kontinuerlig pipettering gennem flere og forskellige dråber M2. Udføre dette trin så hurtigt som muligt for at undgå ændringer i mediets pH.
4. Antral Oocyter Farvning med Hoechst33342
BEMÆRK: antral oocytter kan skelnes i SN (Omgivet nucleolus), NSN (Ikke omgivet nucleolus) elleri enhver anden mellemform, baseret på deres kromatin organisation efter farvning med supravital koncentration af Hoechst33342 (eller andre markører specifikke for baser ved 14). Faktisk SN oocytter viser en Hoechst-positive ring omkring nucleolus mens NSN ikke, deraf navnet.
For korrekt oocytter farvning:
- Overfør oocytterne ved hjælp af en pipette i munden dråber Hoechst33342 (20 pi) fortyndet i M2 på supravital koncentration på 50 ng / pl i 10 minutter i mørke.
- Efter inkubationen med Hoechst33342, overføre hver enkelt oocyt med en mundpipette nederst i små dråber (5 pi) af M2 dækket med mineralolie, til sortering baseret på kromatin organisation (SN eller NSN). Bruge enhver fluorescensmikroskop udstyret med Hoechst33342 filter (emissionsbølgelængde 486 nm) for at visualisere kromatin konfiguration af oocytter.
BEMÆRK: Afhængigt af hvilken type af fluorescens mikroskop bruges, jegt kan blive nødvendigt at bruge glasbund petriskål til billedoptagelse. Den konfokal mikroskopi Olympus FluoView Fv10i når udstyret med en prøve holder til 35 mm skål kræver kun glasbund-retter til billedoptagelse, med en 0,17 mm standard tykkelse og et område fra 0,13 til 0,21 mm acceptable. - Excite oocytter ikke længere end 5-10 sek, sandsynligvis tilstrækkelig tid til at visualisere tilstedeværelsen eller fraværet af en ring omkring nucleolus (figur 5).
- Efter sortering, kultur antrale SN og NSN oocytter i M2 på 5% CO2 og 37 ° C for at inducere in vitro modning eller holde dem i passende buffere til molekylære eller cellulære analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De følgende billeder viser den anvendte metode til at isolere antrale oocytter fra mus æggestokke, startende fra forberedelse pipetter til oocytterne 'sortering ved hjælp af Hoechst33342. Denne metode er ganske enkel og kan udføres i alle laboratorier udstyret med en CO2-inkubator, et stereomikroskop og et fluorescensmikroskop udstyret med den korrekte filter til observation af Hoechst33342 Figur 1 viser det indledende trin af pipette præparatet:. Som glasset begynder at smelte og bliver bløde, skal begge ender af pipetten trækkes fra hinanden, og på samme tid, skal pipetten tages ud af flammen. Alternativt kan kapillarrøret trækkes på samme måde eller ved hjælp af en mikropipette aftrækker, hvis de er korrekt kalibreret. Dette er et afgørende skridt, fordi det er meget vigtigt at have den rigtige mund pipette med den rigtige kapillær diameter: hvis det er for tyndt, kan oocytter være fragmenteret inden i small capIllary og dør i løbet af få minutter, hvis det er for stort, en ordentlig udsugning af mediet indeholdende oocytterne kan gå tabt, når de flytter oocytterne, for eksempel fra en dråbe til en anden. Figur 2 og 3 viser den mekaniske isolering af antrale oocytter fra antrale follikler anvendelse af en steril kanyle insulin. Det er ganske let at genkende disse follikler, fordi de er karakteriseret ved et hulrum eller antrum indeholder en væske, der er det medium, hvori de granulosaceller og oocyt bliver fundet og hvorigennem forskellige molekyler kan udveksles til og fra det ydre miljø. Når isolerede, antrale oocytter skal overføres fra en dråbe til en anden af M2-medium til fjernelse af somatiske celler, der omgiver oocytterne, som vist i figur 4A og B. Når "blottede", antrale oocytter er klar til klassificering. Figur 5 viser det sidste trin af denne protokol, der er farvningen af de isolerede antral oocytter med Hoechst33342 feller en hurtig sortering baseret på deres kromatin organisation. Denne markør pletter levende celler meget hurtigere end DAPI, for eksempel, og skal anvendes på supravital koncentration (50 ng / pl) for at bevare cellelevedygtighed. Cellefarvning til kromatin organisation er nok den mest kritiske trin i denne protokol: hvis oocytter er glade for lange de kan blive beskadiget og blive ubrugeligt for fremtidige essays. Samlet set hvis de anvendes på museoocytter, dette er en simpel metode, der ikke kræver særlige forholdsregler (undtagen de i metoden afsnit). Alle trin kan udføres ved stuetemperatur.
Figur 1. Udarbejdelse af en mund pipette hjælp af glas Pasteur pipetter og en bunsenbrænder. Klik her for at se en større version af this figur.
Figur 2. Intakte æggestokke i petriskål fyldt med forvarmet og afbalanceret M2 medium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Indledende isolering af antrale oocytter fra antrale follikler ved hjælp af en steril nål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Overdragelse af frisk isolerede oocyttermed en mund pipette fra petriskålen (A) til en anden petriskål indeholdende små dråber af forvarmet og afbalanceret M2medium (B) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Oocytter farves og sorteret med Hoechst33342. Enkelte billeder af NSN og SN oocytter taget på konfokal mikroskop Olympus FluoView Fv10i (forstørrelse 60X, bar: 10 pm, PhC: fase kontrast). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver den anvendte metode til at isolere og klassificere musen antrale GV oocytter. Der er ingen særlige kritiske skridt til at understrege, med få undtagelser. Første: Denne procedure skal udføres så hurtigt som muligt til: a) at bevare vitaliteten af oocytter og b) at undgå pH-ændringer i mediet anvendes. Andet: oocytter skal være kortvarigt ophidset (5-10 sek) til Hoechst33342 at undgå kromatin skader og efterfølgende død af oocytter, især hvis IVM og IVF er følgende trin. Til dato, dette er den hurtigste måde at sortere SN og NSN mus antrale oocytter.
Hochest33342 har vist sig at være en effektiv måde at karakterisere SN og NSN oocytter i hunmus (og andre pattedyr laboratorie-modeller), men det kan ikke være, desværre bruges til at sortere antrale oocytter i mennesker for frugtbarhed formål.
Men da in vitro modning af umodne oocytter rutinemæssigt anvendes i mennesker også, det woULD være yderst vigtigt at finde en ikke-invasiv måde at skelne de "gode" oocytter (dvs. SN) fra "dårlige" dem (dvs. NSN) for at øge succesen af in vitro-befrugtning og efterfølgende potentielle embryoner udvikling. Desuden kunne isolering og dyrkning af oocytter SN fra ovarievæv anvendes til fertilitet konservering hos kvinder i kræftbehandling eller lider af æggestokkene patologier.
Ved at udnytte denne naturlige fænomen, kunne vigtige data til rådighed for forståelsen af naturligt forekommende embryo præimplantations tab, som taler ikke kun til de interesserede i den grundlæggende biologi oocyt udvikling, men også til mennesker og dyr IVF klinikere.
Konsekvenserne af denne teknik for menneskers sundhed, er betydelige 15 biopolitik af embryoner og dyr reproduktion. At være i stand til at identificere og fjerne "life-uforenelige" oocytter villei høj grad øge det effektive niveau af IVF-teknikker, hvilket fører til banebrydende løsninger for vigtige udækkede kliniske behov.
I virkeligheden kunne det internationale videnskabelige samfund af gameter biologer bidrage til at søge de kritiske forbedringer er nødvendige for at anvende denne protokol til menneskelige IVF procedurer. Selvom protokollen ikke kan anvendes på mennesker (for klare sikkerhedsmæssige årsager), er det stadig holder en enorm kapacitet til at forbedre kendskabet til sammenhængen mellem kromatin organisation (dvs. genom arkitektur) og genekspression i løbet af de sidste faser af antral modning , en af de varme emner i den menneskelige forplantning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
