Biz yüksek verimlilik sıralama (DamID seq) DNA adenin metiltransferaz kimlik (DamID) bağlanması burada bir tahlil açıklar. Bu geliştirilmiş bir yöntem daha yüksek çözünürlüğü ve daha geniş bir dinamik aralığı ve karşılaştırın vb ChIP-SEQ RNA-SEQ gibi diğer yüksek verimli sekanslama verileri ile birlikte DamID seq verileri analiz
The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.
DNA adenin metiltransferaz tanımlaması (DamID) 1,2 in vivo protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için bir yöntem olup, kromatin, immüno-çökeltme (chip) 3 için alternatif bir yöntemdir. Hücrelerin nispeten düşük bir miktarda kullanılır ve DNA ya da yüksek ölçüde spesifik bir antikor, proteinin kimyasal olarak çapraz-bağlanmasını gerektirmez. Hedef protein gevşek veya dolaylı olarak DNA ile ilişkili olduğunda ikincisi özellikle yararlıdır. DamID başarılı bir şekilde çekirdek zarı proteinlerinin 4-10, kromatin ilişkili proteinler 11-13, kromatin değiştirici enzimler 14, transkripsiyon faktörleri ve 15-18 ko-faktörler ve RNAi makine 19 de dahil olmak üzere bir çok protein bağlanma sitesi eşlemek için kullanılmıştır. Yöntem S. dahil olmak üzere birden organizmalarda uygulanabilir cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. 21,22 yanı sıra, fare ve insan hücre hatları 6,8,10,23,24 thaliana.
DamID deneyinin geliştirilmesi endojen adenin metilasyonu 2 eksikliği ökaryotik hücrelerde adenin-metillenmiş DNA fragmanlarının spesifik olarak saptanması dayanıyordu. Ilgi ve E, DNA bağlama proteini aşağıdakilerden oluşan bir füzyon proteini, coli DNA adenin metiltransferaz (Baraj), mekansal yakınlık (en önemlisi 1 kb içinde ve yukarı yaklaşık 5 kb) olan genom 2 protein bağlanma sitelerine GAİK dizileri adenin baz metillenmesi olabilir. Tadil edilmiş DNA fragmanları, özellikle ilgi 1,25,26 proteinin genomik bağlanma bölgelerini tespit etmek için microarrays yükseltilir ve hibridize edilebilir. Bu orijinal DamID yöntemi mikrodizilerinin kullanılabilirliği ve önceden belirlenmiş prob yoğunluğu ile sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, yüksek verimli sekanslamayı entegre etmişDamID 10 ve DamID-SEQ olarak yöntem belirlenmiş. Kısacası çok sayıda DamID-seq oluşturulan okur genom protein-DNA etkileşimleri hassas yerelleştirme sağlar. Biz DamID seq genom nükleer lamina (NL) dernekleri 10 çalışmak için mikrodizi tarafından DamID daha yüksek çözünürlük ve daha geniş bir dinamik aralık sağlanan bulundu. Bu geliştirilmiş bir yöntem gen yapıları 10 içinde NL dernek sondalama izin verir ve bu ChIP-seq ve RNA-seq gibi diğer yüksek verim sıralama verileri ile karşılaştırmalar kolaylaştırır.
Burada anlatılan DamID seq protokol başlangıçta haritalama genom NL dernekler 10 için geliştirilmiştir. Bu E. fare ya da insan Lamin B1 hayvan zinciri ile bir füzyon proteini oluşturulur coli DNA adenin metiltransferaz ve C2C12 fare (veri yayınlanmadı) 10 ve IMR90 insan fetal akciğer fibroblastlar miyoblastların, 3T3 fare embriyonik fibroblast protokolü test. Bu protokol, biz c ile başlayanvektörleri onstructing ve memeli hücrelerinde 24 lentiviral enfeksiyon Barajı-gergin füzyon proteinleri ifade. Sonra, adenin-metillenmiş DNA fragmanları amplifiye ve diğer organizmalarda uygulanabilir olmalı dizileme kitaplıkları hazırlama ayrıntılı protokolleri açıklar.
Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of …
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
Tris | brand not critical | ||
EDTA | brand not critical | ||
200 Proof EtOH | brand not critical | ||
Isopropanol | brand not critical | ||
Sodium Acetate | brand not critical | ||
DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow Fragment (3’ -> 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 11.2; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5X KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10mM dNTP mix |
agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
Spectrophotometer | brand not critical | ||
0.45 um PVDF Filter | brand not critical | ||
25 ml Seringe | brand not critical | ||
10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
Vortex Mixer | brand not critical | ||
Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
Microcentrifuge | brand not critical | ||
Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
UV transilluminator | brand not critical | ||
E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |