Vi beskriver her en analyse ved kobling DNA adenin metyltransferase identifikasjon (DamID) til høy throughput sekvensering (DamID-seq). Denne fremgangsmåte gir en høyere oppløsning og et større dynamisk område, og gjør det mulig å analysere DamID-seq data i forbindelse med andre høy gjennomstrømning sekvenseringsdata, for eksempel chip-seq, RNA-seq, etc.
The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.
DNA adenin metyltransferase identifikasjon (DamID) 1,2 er en metode for å påvise protein-DNA interaksjoner in vivo og er en alternativ tilnærming til kromatin immunoutfelling (chip) 3. Den bruker en forholdsvis lav mengde av celler og krever ikke kjemisk kryssbinding av proteiner med DNA eller et høyt spesifikt antistoff. Sistnevnte er spesielt nyttig når målproteinet er løst eller indirekte er assosiert med DNA. DamID har blitt brukt for å kartlegge bindingssteder for en rekke proteiner inkludert atom envelopeproteiner 4-10, kromatin forbundet proteiner 11-13, kromatin modifisering enzymer 14, transkripsjonsfaktorer og co-faktorer 15-18 og RNAi machineries 19. Metoden er anvendelig i flere organismer inkludert S. cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 samt mus og menneskelig cellelinjer 6,8,10,23,24.
Utviklingen av DamID analysen var basert på spesifikk påvisning av adenin-metylerte DNA-fragmenter i eukaryote celler som mangler endogen adenin metylering 2. Et uttrykt fusjonsprotein som består av den DNA-bindende protein av interesse og E. coli DNA adenin metyltransferase (Dam), kan metylat den adenin base i GATC-sekvenser som er i romlig nærhet (mest signifikant i løpet av 1 kb og opp til omtrent 5 kb) til bindingssetene av proteinet i genomet 2. De modifiserte DNA-fragmenter kan være spesielt forsterkes og hybridisert til microarray for å detektere de genomiske bindingsseter av proteinet av interesse 1,25,26. Denne originale DamID metoden er begrenset av tilgjengeligheten av mikromatriser og tettheten av forutbestemte prober. Vi har derfor integrert høy gjennomstrømming sekvensering itil DamID 10 og betegnet den fremgangsmåte som er DamID-seq. Det store antallet kort leser generert fra DamID-seq muliggjør presis lokalisering av protein-DNA interaksjoner genom-wide. Vi fant ut at DamID-seq gitt en høyere oppløsning og større dynamisk omfang enn DamID av microarray for å studere genom-atom plate (NL) assosiasjoner 10. Denne forbedrede metoden gjør sondering NL foreninger innenfor genet strukturer 10 og muliggjør sammenligninger med andre high throughput sekvense data, for eksempel ChIP-seq og RNA-seq.
Den DamID-seq protokollen beskrevet her ble opprinnelig utviklet for kartlegging av genom-NL foreninger 10. Vi ga en fusjonsprotein med tethering musen eller menneskelig Lamin B1 til E. coli DNA adenin metyltransferase og testet protokollen i 3T3 mus embryonale fibroblaster, C2C12 mus myoblaster 10 og IMR90 humane foster lungefibroblaster (data ikke publisert). I denne protokollen, starter vi med constructing vektorer og uttrykker Dam-tethered fusjonsproteiner etter lentiviral infeksjon i pattedyrceller 24. Deretter beskriver vi de detaljerte protokoller forsterke adenin-metylert DNA-fragmenter og forbereder sekvense bibliotekene som bør være aktuelt i andre organismer.
Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of …
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
Tris | brand not critical | ||
EDTA | brand not critical | ||
200 Proof EtOH | brand not critical | ||
Isopropanol | brand not critical | ||
Sodium Acetate | brand not critical | ||
DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow Fragment (3’ -> 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 11.2; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5X KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10mM dNTP mix |
agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
Spectrophotometer | brand not critical | ||
0.45 um PVDF Filter | brand not critical | ||
25 ml Seringe | brand not critical | ||
10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
Vortex Mixer | brand not critical | ||
Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
Microcentrifuge | brand not critical | ||
Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
UV transilluminator | brand not critical | ||
E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |