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DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

Published: January 27, 2016 doi: 10.3791/53620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

우리는 높은 처리량 시퀀싱 (DamID-SEQ)에 DNA 아데닌의 메틸화 식별 (DamID)을 결합하여 여기에 분석을 설명합니다. 이 개선 된 방법은 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 제공하며, 허용 등과 칩 서열, RNA-SEQ 같은 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와 함께 DamID-서열 데이터 분석

Introduction

아데닌 DNA 메틸화 식별 (DamID) -1,2-는 생체 내에서 DNA 단백질 상호 작용을 검출하는 방법이며 염색질 면역 (칩) 3로 대체 방법이다. 그것은 세포의 상대적으로 적은 양을 사용하고, DNA 또는 고도로 특이 항체와 단백질의 화학적 가교 결합을 필요로하지 않는다. 표적 단백질은 DNA 느슨하게 또는 간접적으로 연결된 경우 후자는 특히 유용하다. DamID 성공적 핵막 단백질 4-10, 11-13 염색질 관련 단백질, 염색질 변형 효소 14, 전사 인자 및 15-18 공동 인자와의 RNAi 기계 (19)를 포함하는 단백질의 다양한 결합 부위를 매핑하는데 사용되어왔다. 이 방법은 S. 등 다양한 유기체에서 적용 할 수있다 cerevisiae의 13, S. pombe 7, C. 엘레 9,17, D. melanogaster의 5,11,18,20, A. (21, 22)뿐만 아니라 마우스와 인간의 세포 라인 6,8,10,23,24 장대.

DamID 분석법의 개발은 내인성 아데닌 2 메틸화 결여 진핵 세포에서 아데닌 메틸화 DNA 단편의 특정 검출에 기초 하였다. 관심 E.의 DNA 결합 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현, 콜라이 DNA 메틸화 된 아데닌 (DAM)은 공간적 인접 (가장 크게 1킬로바이트 내의 최대 약 5킬로바이트까지)이다 게놈 2 단백질의 결합 부위에 GATC 서열의 아데닌 염기를 메틸화 할 수있다. 개질 된 DNA 단편은 특별히 관심 1,25,26의 단백질의 유전자 결합 부위를 검출하는 마이크로 어레이 혼성화 및 증폭 될 수있다. 이것은 원래 DamID 방법은 마이크로 어레이의 프로브 가용성 및 소정의 밀도에 의해 제한되었다. 따라서 우리는 높은 처리량 시퀀싱을 통합 한DamID 10이고 DamID-SEQ와 같은 방법을 지정. 짧은의 많은 수의 DamID-SEQ에서 생성 된 읽기 게놈 전체 단백질 DNA 상호 작용의 정확한 위치 파악을 할 수 있습니다. 우리는 DamID-서열이 게놈 핵 라미 (NL) 협회 (10) 유학을위한 마이크로 어레이에 의해 DamID보다 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 한 것으로 나타났습니다. 이 개선 된 방법은 유전자 구조 (10) 내에 연관 NL 프로빙 수 있으며 이러한 칩 서열 및 RNA-SEQ 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와의 비교를 용이하게한다.

여기에 설명 된 DamID-SEQ 프로토콜은 초기에 매핑 게놈 NL 협회 (10)을 위해 개발되었다. 우리는 E.에 마우스 또는 인간 라민의 B1을 테 더링하여 융합 단백질을 생성 대장균의 DNA 메틸화 된 아데닌과 C2C12 마우스 (데이터가 공개되지 않음) (10)과 IMR90 인간의 태아 폐 섬유 아 세포를 근육 모세포, 3T3 마우스 배아 섬유 아세포에서 프로토콜을 테스트했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 C로 시작벡터 및 포유류 세포 onstructing 24 렌티 바이러스 감염에 의한 댐 연결형 융합 단백질을 발현. 다음으로, 우리는 아데닌 메틸화 DNA 단편을 증폭하고 다른 생물에 적용되어야 서열 라이브러리의 제조 상세한 프로토콜을 설명한다.

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Protocol

1. 생성 및 융합 단백질 및 무료 댐 단백질의 발현

  1. DamID 벡터에 관심 복제 단백질.
    1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 관심 (POI)의 단백질 원하는 높은 충실도 DNA 중합 효소를 사용하고 적절한 프라이머의 cDNA를 증폭. 실험적 인서트의 적절한 증폭을 위해 최적의 증폭​​ 조건을 결정한다.
    2. 아가 로스 젤을 실행하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트에 의해 POI의 증폭 된 cDNA를 정화.
    3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 BP Clonase II를 사용하여 pDONR201 벡터에 POI의 클론의 cDNA.
    4. POI 융합의 원하는 방향에 따라, 제조자의 프로토콜에 따라 LR Clonase II를 사용 pLGW-RFC1-V5-EcoDam 대상 벡터 또는 pLGW-EcoDam-V5-RFC1 대상 벡터 (27)로 전자 공여체 벡터로부터 POI의 cDNA를 복제 N 말단 또는 일 행E.의 전자 C- 말단 콜라이 DNA 메틸화 된 아데닌 (EcoDam) 27.
    5. 복제 된 cDNA를에서 프레임 융합 EcoDam에 올바른 순서와 형태를 가지고 순서에 의해 확인합니다.
  2. 렌티 바이러스 주식을 생성합니다.
    1. 렌티 바이러스 발현 시스템을 이용하여 댐-V5-POI와 (pLGW-V5-EcoDam 벡터 27) V5-댐을 표현 렌티 바이러스 주식을 생성합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 앞으로 형질 전환 절차를 사용하십시오.
      1. 형질에 대한 제조 업체의 프로토콜에 따라 렌티 바이러스 주식을 생성하는 293T 세포와 리포 펙을 사용합니다.
      2. 0.45 μm의 PVDF 필터 단계를 포함합니다.
  3. 렌티 바이러스와 세포를 감염.
    1. 감염 (0 일) 전날, 항생제없이 동일한 성장 배지를 사용하여 6 웰 조직 배양 플레이트에이 세포의 종류에 적합한 성장 배지에서 배양 부착 세포를 전달할감염 일에 50 % 합류점을 달성한다. 37 ° C 배양기에 넣어 세포.
    2. 감염 (1 일)의 날에서 댐-V5-POI 및 V5-댐 두 렌티 바이러스 상층 액의 2 크리오 바이알 (cryovial)를 제거 -80 C의 냉동고 및 장소 ° 해동 할 수있는 37 ° C의 물을 욕조에.
      1. 세포에서 성장 미디어를 제거하고 항생제없이 신선한 성장 미디어 0.5 ㎖로 대체합니다.
      2. 각 웰 (V5-댐 2 우물과 댐-V5-POI 2 우물)에 해동 렌티 바이러스의 1 ML을 추가합니다. 나머지 2 항생제없이 성장 매체의 1 ML을 추가 우물-이 음성 대조군이 될 것입니다. 조심스럽게 혼합하고 37 ° C 배양기 O / N 다시 배치 할 6 웰 플레이트를 흔들.
    3. 감염 (2 일) 다음날은 세포에서 바이러스 현탁액을 제거하고 항생제없이 2 ml의 성장 용지로 교체합니다. 다시 48 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에 넣어 세포.
  4. gDNA를 격리.
    1. 각 웰과 드에서 대기음 미디어250 μL 0.05 % 트립신 EDTA를 사용하여 타코미터 세포. 2 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    2. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 각 웰에 1 ml의 성장 매체와 피펫 세포 판 떨어져 세포를 씻으십시오. RT에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛.
    3. 실온에서 2 분 동안 200 XG에서 펠렛 500 μl의 PBS로 세포와 원심 분리기를 씻으십시오.
    4. 200 μL PBS의 펠렛 세포를 재현 탁.
    5. 제조 업체의 프로토콜에 따라 혈액 및 조직 키트에 의해 gDNA를 격리. 용출 완충액 200 μL 및 AE에서 gDNA를 분광 광도계 260 OD를 측정하여 농도를 결정한다.
      참고 : gDNA를을 감염되지 않은 또는 모의 감염된 세포에서 부정적인 컨트롤로 분리 할 수​​있다. 장기 보관 용으로 gDNA를 높은 농도를 침전.
      1. 100 % 에탄올 3 권, 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)의 0.1 볼륨을 추가하고 튜브에게 4-6 번 반전 섞는다.
      2. -20 ° CO / N 스토어.
      3. 16,000 X 원심 분리기4 ℃에서 15 분 동안 G.
      4. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 16,000 XG에 70 % (부피 / 부피) 에탄올과 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오.
      5. 조심스럽게 실온에서 3 분 동안 건조 공기 펠렛을 에탄올을 제거 할 수 있습니다.
      6. / μL 약 1 μg의에 T (10) E 0.1 (PH 7.5)에 gDNA를 녹인다. 각 시험 물질 또는 대조군과 농도를 측정에서 gDNA를 풀. -20 ℃에서 보관하십시오.

2. 증폭 아데닌 - 메틸화 DNA 조각

  1. 단지 아데닌 - 메틸화 GATCs 인하 DpnI와 다이제스트 gDNA를.
    1. 2.5 μg의 gDNA를, 1 μL 10 배 버퍼, 0.5 μL DpnI (20 U / μL)와 얼음에 반응을 설정하고 10 μL의 총 부피에 H 2 O 채우기. 두 개의 W (0.5 μL H 2 O와 DpnI 교체, "아니오 DpnI") DpnI없이 한 - 각 gDNA를 샘플의 경우, 세 가지 반응을 준비( "DpnI와") i 번째 DpnI.
    2. 다이제스트 O / 37 ℃에서 N, 20 분 동안 80 ° C에서 DpnI을 비활성화한다.
  2. DamID 어댑터를 결찰.
    1. DamID 어댑터를 준비합니다.
      1. 100 μM의 최종 농도로 H 2 O에 두 DamID 어댑터 올리고 (24)의 각각을 재현 탁.
      2. 두 DamID 어댑터 올리고 같은 부피를 결합 혼합하고 밀폐 된 튜브에 배치합니다. 파라 필름으로 튜브를 밀봉, 90 ℃에서 물이 가득 비커에 랙과 장소에 앉아있다. 튜브의 뚜껑 아래의 수위를 유지하지만 올리고 믹스의 표면 위 (튜브 들어가는 물을 방지하기 위해).
      3. 그래서 어댑터 어닐링 천천히 RT에 물이 식도록.
      4. -20 ° C에서 열처리 어댑터 (50 μM) 및 저장 나누어지는.
    2. 얼음에 반응을 설정합니다. 2.1.2 각 관에서, 6.2 μL의 H 2 O, 2 μL 10 배 내고 버퍼, 0.8 μL 50 μm의 DamID 광고를 추가aptors (얼음 해동) 1 μL T4 DNA 리가 아제 (5 U / μL). 총 부피는 20 μL이다. . 관 "DpnI와"두 중 하나에서, 1 μL의 H 2 O ( "아니오 리가")와 리가 아제를 교체 각 gDNA를 샘플은 두 개의 음성 대조군이 있습니다 - "아니오 DpnI"와 "아니오 리가"를.
    3. 결찰 된 O / 16 ℃에서의 N과 10 분 동안 65 ° C에서 리가 아제를 불활.
  3. DpnII와 다이제스트 DNA를 메틸화 GATCs를 포함하는 조각을 파괴합니다.
    1. 얼음에 반응을 설정합니다. 2.2.3 각 관에서 24 μL의 H 2 O, 5 ㎕의 10 배 DpnII가 버퍼 1 μL DpnII (10 U / μL)를 추가합니다. 총 부피는 50 μL이다.
    2. 2-3 시간 동안 37 ° C에서의 다이제스트와 20 분 동안 65 ° C에서 DpnII 불활.
  4. 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편을 증폭.
    1. 2.3.2에서, 5 μ을 소화 DpnII 5 μL 얼음에 반응을 설정L 배 PCR 완충액 12.5 ㎕를 5 μM DamID PCR μL 된 10 mM의 dNTP 믹스 프라이머 24 (4), 1 ㎕의 50X 중합 효소 믹스 22.5 μL H 2 O. 총 부피는 50 μL이다.
    2. 다음과 같이 PCR을 실행하여 68 ° C를 10 분 동안; 1 분 94 ° C, 5 분 동안 65 ℃, 15 분 동안 68 ° C; 1 분, 1 분 65 ° C, 10 분 동안 68 ° C ~ 94 ° C의 4주기; 1 분, 1 분, 2 분 68 ° C ~ 65 ° C ~ 94 ° C의 17주기.
    3. 1 % 아가 로스 겔에서 각 5 μL 반응에서 PCR 산물을 분석한다. PCR 제품은 0.2에서 2킬로바이트 (그림 2)에 이르기까지 얼룩으로 나타납니다. "아니오 DpnI"와 "아니오 리가"컨트롤이없는하거나 명확하게 적은 증폭한다.
    4. 단계 2.4.3에서 결과가 양호하면, 실험 샘플에 대한 두 개 또는 세 개의 반응 및 음성 대조군의 각각에 대한 하나의 반응 단계를 반복 2.4.1-2.4.3.
    5. 풀에서 같은 PCR 산물을 정제하고제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 고체 단계 가역 고정화 (SPRI) 구슬을 사용하여 실험 샘플. "더 DpnI"또는 "아니오 리가"컨트롤을 정화하지 마십시오. 버퍼 EB와 DNA를 용출.
    6. 약 0.1 μg의 / μL 이상이어야 분광 광도계를 사용하여 OD (260)을 측정함으로써 정제 된 DNA의 농도를 측정한다. 각 샘플 10 μg의 DNA의 최소를 수집합니다. PCR 정제 키트를 사용하는 경우, 하나의 컬럼으로 각 50 μL PCR 제품을 정화 30 μL 버퍼 EB에 용출하고 용출액을 풀.
  5. DpnII와 다이제스트 DNA는 염기 서열되는 DamID PCR 프라이머를 방지합니다.
    1. 2.4.6 5 μg의 정제 된 DNA와 얼음에 반응, 5 ㎕의 10 배 DpnII 버퍼, 1 μL DpnII (10 U / μL)을 설정하고 50 μL의 총 부피에 H 2 O 채우기. 각 샘플에 대한 두 개 또는 세 개의 반응을 준비합니다.
    2. 2-3 시간 동안 37 ° C에서 다이제스트20 분 동안 65 ° C에서 DpnII 불활.
    3. 수영장 제조 업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 SPRI 구슬 같은 시료에서 소화를 정화합니다. 버퍼 EB와 DNA를 용출.
    4. 약 0.06 μg의 / μL 이상이어야 정제 된 DNA의 농도를 측정한다. 각 샘플에 대한 6 μg의 DNA를 최소를 수집합니다. PCR 정제 키트를 사용하는 경우, 30 μL 버퍼 EB에 용출, 각 50 μL 하나의 컬럼으로 소화 정화 용출액을 풀.

높은 처리량 시퀀싱 3. 도서관 준비

  1. 조각의 DNA
    1. 실험적으로 dsDNA Fragmentase의 새 배치에 대한 적절한 소화 시간을 결정합니다. 효소 활성은 시간의 경과에 따라 감소 될 수 있으므로, 새로운 실험을 수행하기 전에 테스트를 반복한다. 실제 조각화 2.5.4에서 DNA를 저장하려면, 이전 experime에서 2.4.6 또는 추가 DNA로부터 정제 된 메틸 PCR 제품을 사용이 단계에서 NTS.
      1. 6 μg의 DNA를 가진 마스터 믹스 12 μl의 10 배 Fragmentase 버퍼를 설정하고 114 μL의 총 부피에 H 2 O 채우기.
      2. 소용돌이 3 초 동안 Fragmentase 스톡 바이알, 마스터 믹스에 6 μl를 추가하고 3 초 동안 마스터 믹스를 소용돌이. 총 부피는 120 μL이다.
      3. 분취 5 새로운 튜브 각각 마스터 믹스의 20 μL. 10 분의 증가에서 5 분 55 37 ° C에서 모두 6 튜브를 품어. 반응을 정지 5 ㎕의 0.5 M EDTA를 추가합니다.
      4. 12.5 μL 각 반응 (0.5 μg의 DNA)뿐만 아니라 아가 로스 젤에 0.5 μg의 소화되지 않은 DNA (그림 3) 소화 분석합니다. 약 0.2 킬로에 스미어의 대부분을 소화하는 데 필요한 최소한의 시간 (T의 0.2kb)를 결정합니다. 실제 조각 평등 증분 (5 분 및 T의 0.2kb 포함) 5 분 및 T의 0.2kb 사이의 6 시간 지속 시간을 선택합니다.
    2. 실제 fragmen을 설정테이션으로 3.1.1.1-3.1.1.3에 설명. 3.1.1.4에서 결정된 지속 시간 37 ℃에서 반응을 배양한다.
    3. 수영장 6 반응과 PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 다이제스트을 정화. 51 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 50 μL이다.
  2. 수리는 조각난 DNA 끝
    1. 3.1.3에서 용출액을 25 μL의 H와 얼음에 반응을 설정 2 O, 10 ㎕의 10 mM의 ATP와 10 배 T4 DNA 리가 아제 버퍼, 4 μL 10 밀리미터의 dNTP 믹스, 5 μL T4의 DNA 중합 효소 (3 U / μL) 1 μL 클레 나우 DNA 폴리머 라 아제 (5 U / μL), 5 ㎕의 T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제. 총 부피는 100 μL이다. 피펫과 잘 섞는다. 거품과 거품을 피하십시오.
    2. 30 분 동안 20 ° C에서 품어.
    3. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 33 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 32 & #입니다181; L.
  3. ""오버행 추가
    1. 3.2.3에서 용출 물과 얼음에 반응, 5 ㎕의 10 배 클레 나우 버퍼, 10 ㎕의 1 밀리미터의 dNTP, 3 μL 클레 나우 (3 '→ 5'엑소) (5 U / μL)을 설정합니다. 총 부피는 50 μL이다. 피펫과 잘 섞는다. 거품과 거품을 피하십시오.
    2. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    3. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 22 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 21 μL이다.
  4. 결찰 시퀀싱 어댑터
    1. 시퀀싱 어댑터 (28)를 준비합니다.
      1. 10 mM 트리스 - CL (PH 7.8), 0.1 mM의 EDTA (PH 8.0) 및 50 mM의 NaCl을 100 μM의 농도로 각 어댑터 올리고을 재현 탁.
      2. 유니버설 어댑터 (28)와 인덱스 어댑터 (28)의 동일한 볼륨을 섞는다.
      3. 다음으로 열 자전거 타는 사람에 어댑터를 어닐링프로그램 : 2 분 95 ° C; 30 초 95 ° C에서 시작하여 0.5 ° C 매 사이클에 의해 감소​​ 140주기; 4 ° C에서 개최.
      4. 나누어지는 어댑터 및 저장 -20 ° C에서.
    2. 3.4.1.4 2.5 μL의 T4 DNA 리가에서 (얼음 해동) 3.3.3에서 용출액 얼음에 반응, 25 μL 배 내고 버퍼, 시퀀싱 어댑터를 어닐링 1.5 μL 50 μm의를 설정합니다. 피펫과 잘 섞는다. 거품과 거품을 피하십시오. 다중화 순서가 요구되는 경우, 각 샘플에 대해 상이한 인덱싱 된 어댑터를 사용한다.
    3. 1 시간 동안 실온에서 품어.
    4. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 24 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 23 μL이다.
  5. DNA 단편 크기를 결정하는 단계 (28)를 정확하게 있도록 dsDNA에 Y 자형 어댑터 변환
    1. 3.4.4에서 용출액, 12.5 μL의 H 2 O와 얼음에 반응을 설정1 ㎕의 25 μM 프라이머 1 (28), 1 ㎕의 25 μM 프라이머 2 (28), 1.5 μL의 10mM의 dNTP, 10 ㎕의 PCR 완충액 5 배와 1 μL의 DNA 중합 효소 (1 U / μL).
    2. 다음과 같이 PCR을 실행하여 95 ° C를 3 분 동안; 15 초, 30 초 동안 63 ° C, 30 초, 72 ° C ~ 98 ° C의 5주기; 1 분 72 ° C; 보류 4 ° C.
    3. PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA를 정화. 11 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 10 μL이다.
  6. 크기는 라이브러리를 선택
    1. 1X TAE 완충액으로 2 % 아가 로스 겔을 제조. 에 티듐 브로마이드 (주의!) 500 ng를 추가 / ㎖의 최종 농도로 용해 TAE 아가 로스 용액에 티듐 브로마이드의 흡입을 피하기 위해 냉각되면. 모든 샘플의 DNA 사다리와 빈 차선에 대한 충분한 차선을해야합니다.
    2. 3.5.3에서 용출액 8 μL 6 배 로딩 염료를 추가합니다.
      3. <리> 1킬로바이트 플러스 1의 비율로 DNA 래더 (1.0 μg의 / μL), 6X 로딩 염료 및 H 2 O를 혼합하여 DNA 래더 준비 : 1 : 4.
    3. DNA 래더 μL 부하 (6)에서 분리 된 레인과 인접하는 샘플 / 사다리로부터 적어도 하나의 빈 레인 3.6.2에서 샘플과 다른 6 μL의 DNA 사다리 각.
    4. 60 분 동안 120 V에서 젤을 실행합니다.
    5. UV transilluminator가에의 겔보기 (UV에 노출 시간을 최소화). 보안경과 안면 보호구를 착용 할 것. 확인 DNA 사다리 중 적어도 하나는 300 bp의 400 bp의 밴드 사이 (3 겔 조각을 절제 충분히) 적절한 간격을 잘 실행합니다. 넓은 간격이 절제 젤 조각의 볼륨을 증가하는 동안 좁은 간격은, 여러 젤 조각을 절제에 어려움을 증가시킨다.
    6. 새로운 메스 또는 각 레인에 대한 면도날을 사용합니다. 소비세 (300) 및 각 레인에서 400 bp의 사이에 세 개의 얇은 젤 조각 (그림 4)과 microcentrifuge 관에서 그들을 각각 배치합니다. 각 겔의 부피를 유지가능 (<100 μL)의 낮은 이가.
    7. 각 겔 슬라이스 (1 μL 겔은 약 1 mg의 무게)의 양을 측정 QG 버퍼 6X 볼륨을 추가하고, 50 ℃에서 배양한다.
    8. 겔 조각이 완전히 용해 될 때까지 QG - 겔 혼합물마다 2 ~ 3 분 소용돌이. 이소프로판올의 2 배 젤 볼륨을 추가하고 혼합한다.
    9. 이 단계에서, 젤 추출 키트의 프로토콜을 따르십시오. 51 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 최종 용출액 ~ 50 μL이다.
  7. 시퀀싱 어댑터 수정 된 DNA 단편을 풍성
    1. 29 PCR 사이클 수를 최적화한다.
      1. 3.6.10에서 1 μL 용출, 1 μL 25 μm의 프라이머 1 (28), 1 μL 25 μm의 프라이머 2 (28), 7 μL의 H 2 O 10 μL SYBR 녹색 수퍼 믹스와 얼음에 반응을 설정합니다. 총 부피는 20 μL이다.
      2. 다음과 같이 qPCR에 실행 : 95 ° C를 3 분 동안; 30 초 동안 95 ° C의 20주기, 30 초 동안 63 ° C, 730 초 동안 2 ℃ 접시, 읽기.
      3. qPCR의 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 각 시료에 대한 정량주기 CQ () 또는 역치 사이클 (CT)을 결정한다. 최종 PCR 사이클 수 (N PCR)으로 (다음으로 높은 정수로 반올림) Cq와 / 코네티컷 ≤ 14.이 샘플 최대 Cq와 CQ (0) 마이너스 1 계속합니다.
      4. 다른 샘플은 PCR 사이클의 동일한 수를 실행 한 후 거의 동일한 양으로 증폭되도록 DNA 템플릿의 수량을 조절한다. 가장 높은 Cq와 CQ (0)와 시료 8 μL 템플릿을 사용하여, 다음과 같은 식에 다른 샘플 템플릿 볼륨을 계산합니다 :
        부피 I = 8 × 1.8 Cq와 내가 0 -cq
    2. 1 μL 25 μm의 프라이머 1 (28), 1 μL 25 μm의 프라이머 2 (28), 1.5 : 3.7.1.4에서 계산 된 템플릿 볼륨과 얼음에 PCR 반응을 설정μL 10 밀리미터의 dNTP, 10 μL 5 배 버퍼, 1 μL의 DNA 중합 효소 (1 U / μL) 50 μL의 총 부피에 H 2 O 채우기.
    3. 다음과 같이 PCR을 실행하여 95 ° C를 45 초 동안; N PCR주기는 15 초, 30 초 동안 63 ° C, 30 초, 72 ° C ~ 98 ° C의 (3.7.1.3에서 결정) 1 분 72 ° C; 보류 4 ° C.
    4. 2 % 아가 로스 겔 (도 5a)에 5 ㎕의 PCR 생성물을 분석한다. 분명 "하나의"밴드가 증폭 된 DNA 단편은 좁은 길이 범위 내에서 DNA 라이브러리는 추가 분석의 대상이 될 수 있다는 것을 나타냅니다.
    5. 선택된 샘플에 대한 하나의 반응을 반복하고 동일한 샘플로부터 증폭 된 DNA 라이브러리를 풀.
    6. 순서에 대한 선택의 DNA 라이브러리를 정화.
      1. 프라이머 / 어댑터 이량 체는 3.7.4에 표시되지 않는 경우, PCR 정제 키트 또는 제조사의 프로토콜에 따라 SPRI 구슬 DNA 라이브러리를 정화. 21 μL 버퍼 EB에서 DNA를 용출. 그만큼최종 용출액 ~ 20 μL이다. 사용자의 시퀀싱 기능이 용출 완충액 최종 부피 등의 특정의 지시가있는 경우, 그에 따라 샘플을 준비한다.
      2. 프라이머 / 어댑터 이량 체는 3.7.4에서 명확하게 볼 수 있습니다 경우 다음과 같이 라이브러리를 정화.
        1. 2 %의 프리 캐스트 아가 로스 젤에서 3.7.5에서로드 DNA와 DNA 사다리입니다. 부피를 감소 3.7.6.1에 기재된 또는 다중 웰에로드 될 수있는 샘플은 정제 될 수있다. 적절한 전력 시스템에 아가로 오스 겔을 놓습니다. 겔을 15 분 동안 실행할 수 있습니다.
        2. 적절한 transilluminator가를 사용하여 각 샘플에 대한 깨끗한 메스 / 면도기로 원하는 밴드를 잘라 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 겔 슬라이스를 배치합니다.
        3. 두 개의 수정을 제조 업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리 : 37 ° C에서 열 믹서에 버퍼 QG - 겔 혼합물을 배양하고 30 분 동안 1,000 rpm으로, 이소프로판올의 2 배 젤 볼륨을 추가합니다.
  8. . 시퀀싱 시설에 정제 된 DNA 라이브러리를 제출하는 모든 시설 지침을 따르십시오.
    주 : Bioanalyzer (도 5b)에 의한 품질 분석은 정확한 크기 범위 및 DNA 라이브러리의 농도를 결정하기 위해 이전의 시퀀스로 수행되어야한다.

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Representative Results

댐-V5-LmnB1 융합 단백질은 면역 형광 염색법에 의한 내인성 라민 B 형 단백질 (그림 1)과 협력 지역화 것으로 확인되었다.

아데닌 메틸화 DNA 단편의 성공적인 PCR 증폭 DamID-SEQ위한 중요한 단계이다. 노 또는 명확하게 덜 증폭 (그림 2)가 발생한다 (리가없이 또는 PCR 템플릿없이, DpnI없이) 음성 대조군 동안 2킬로바이트 - 실험 샘플은 0.2의 얼룩을 증폭한다.

NGS 라이브러리 소망 인서트의 크기가 200 내지 300 염기쌍에있는 동안 메틸화 된 DNA 단편을, 0.2 내지 2 KB의 범위에있다. 따라서, 적절한 크기 범위로 메틸 PCR 제품을 단편화하는 것이 필수적이다. 그럼에도 불구하고, 동시에 적당한 크기로 큰 DNA 단편을 분해하는 것은 비실용적 인 것으로 밝혀졌다S 및 단일 분할 구간에서 그대로 작은 DNA 단편의 대부분을 유지한다. 따라서, 시간 경과 실험 BP 200 (도 3)을 중심으로 도말 표본의 단편 1 μg의 DNA에 필요한 최소의 시간 (T의 0.2kb)를 결정하기 위해 수행되었다. 그런 다음 동일한 단위로 6 지속 시간은 실제 조각 5 분, T의 0.2kb 사이에 선정되었다. 이중 가닥 DNA Fragmentase의 효소 활성은 일괄 배치에 따라 다를 수 있으며, 시간 경과에 따라 감소 될 수 있습니다, 그래서 그것은 Fragmentase의 새로운 배치 또는 일정 기간 동안 저장 한 후이 단계를 반복하는 것이 좋습니다.

원하는 삽입 크기는 아가 로스 겔 (300) 및 (121 bp의 염기 서열을 포함한 어댑터) 400 bp의 DNA 단편 사이에 대응하는 200 내지 300 염기쌍이다. 이 범위 내에서 세 얇은 조각 라이브러리의 크기 범위를 좁힐 수있는 가능성을 증가시키기 위해 각각의 실험 샘플로부터 적출적어도 하나의 규정 된 순서 라이브러리 (도 4)을 취득.

각 증폭 된 DNA 라이브러리의 5 μL의 분취 시퀀싱을받을 수있는 라이브러리 판별 아가 로스 겔상에서 분석 하였다. 도 5a에 도시 된 바와 같이, 절제 겔 슬라이스와 동일한 크기의 단일 밴드는 분명 아가 로스 겔 (단계 3.7.4)에 표시한다. 다음에, 선택된 라이브러리 시퀀싱 전에 정확한 크기 범위 및 농도를 결정하기 Bioanalyzer (도 5b)에 의해 검사 하였다. 필요하다면, 증폭 된 DNA 라이브러리는 직접 겔 분석없이 Bioanalyzer에 의해 검사 될 수있다. 여러 라이브러리가 좋은 품질의 경우, 비슷한 크기의 라이브러리 샘플 (V5-댐을 발현하는 세포) 실험 (DAM-V5-POI를 발현하는 세포) 및 제어의 쌍에 대한 범위를 시퀀싱하는 것이 좋습니다.

짧은은에 의해 생성 된 읽기시퀀싱 시스템이 최초로 해당 게놈에 매핑되었다. 고유 후속 분석에 전달 된 읽기 정렬됩니다. 짧은 처리 파이프 라인은 게놈 NL 상호 작용지도를 생성하고 유전자 NL 협회가 10 일 이전에 상세히 설명 된 분석 읽는다. 대표 결과는 그림 6에 표시됩니다.

그림 1
면역 형광 염색으로 융합 단백질의 subnuclear 지역화 검증도 1은. IMR90 인간 폐 섬유 모세포는 일시적 댐-V5-LmnB1 발현 플라스미드로 형질 감염시키고 항 라민 B (적색), 항 V5 (B로 염색 녹색). (C) A와 B의 이미지로 병합 T의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그의 그림.

그림 2
아데닌 메틸화 DNA 단편을 PCR 증폭도 2. 각각의 PCR 반응으로부터 5 μL의 분취 물을 1 % 아가 로스 겔상에서 분석 하였다. 0.2에서 2킬로바이트에 이르기까지 스미어 각 실험 샘플에서 증폭 되었으나 증폭 음성 대조군에서 관찰되지 않았다 (2.1 단계에서 더 DpnI, 단계 2.2, 또는 전혀 PCR 템플릿에는 리가). 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전을 볼 수 없습니다 이 그림의.

그림 3
그림 3. 최적의 분열 기간을 결정. 정제 된 메틸 PCR 제품은 10 분 증가에서 5 ~ 55 분에 지속 시간에 대한 분할의 대상이되었다 (소화되지 않은 DNA를 "0 분")로 표시. 1 DNA 사다리 μg의 DNA 단편화 각 샘플의 0.5 μg의은 아가 로스 겔상에서 분석 하였다. 약 200 bp의에 DNA 스미어의 대부분을 소화하는 최소 시간은 5, 35 분 (5 및 35 분 포함) 사이에 여섯 균등 지속 시간은 실제의 단편화를 수행하기 위해 선택되며, 따라서 약 35 분으로 측정 하였다. 주세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4 사이즈 단계 3.6 2 % 아가 로스 겔상에서 실행 하였다부터. 댐-V5-LmnB1과 V5-댐의 DNA 샘플을 DNA 라이브러리를 선택하고 세 동일한 크기 겔 슬라이스 (L, M 및 H는 로우에 대응하는, 중간 노란색 선으로 도시 된 바와 같이) 크기 높은 300 및 400 bp의 사이에 절제했다. OM / 파일 / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
아가 로스 겔에서 분석하여도 높은 스루풋 시퀀싱 5. 증폭 DNA 라이브러리. (A) 증폭 된 DNA 라이브러리. PCR 템플릿이 그림 4에 표시된 젤 조각에서 정제 하였다. (B) V5-댐 (L) 샘플 (A)에 밑줄 된 댐-V5-LmnB1 (L) 샘플의 Bioanalyzer 결과. 이 두 라이브러리는 유사한 좁은 크기 범위를 가지고 있었고, 높은 처리량 시퀀싱 따라서 자격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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UCSC 게놈 브라우저. 마우스 염색체 1 번에서도 6 NGS 데이터는 예로서 도시된다. 시퀀스 데이터는 마우스의 C2C12 근육 아세포 (10)로부터 제조 하였다. 각각 댐-V5-LmnB1 및 V5-댐을 발현하는 세포의 데이터에 대응하는 트랙 "MB.LmnB1.w2k"와 "MB.Dam.w2k"는, 플롯 정규화 읽기 밀도 (만 유일하게 읽고, 또는 RPKM 매핑 당 킬로 당 읽기 ) 염색체를 따라 비 중복 연속 2킬로바이트 창에서. 추적 "MB.log2FC.w2k"플롯 게놈 NL 협회, 즉 LOG2 2킬로바이트 해상도 댐 위에 LmnB1의 RPKM 비율. 시퀀싱 기반의 얇은 판 관련 도메인 (sLADs, 통계적 유의성에 댐을 통해 LmnB1 높은 읽기 밀도가 즉 게놈 영역) 흰색에서 회색과 예측할 수없는 지역에서 블랙, 비 sLADs에 페인트 "MB.sLADs"를 추적 할 수 있습니다. 여기를 클릭하십시오 downloa이 파일을 거라고.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems Life Technologies K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) QIAGEN 69506 or 69504  
Gateway pDONR 201 Life Technologies 11798-014
293T cells American Type Culture Collection CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies 25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-065
Fetal Bovine Serum Sigma F4135
Tris brand not critical
EDTA brand not critical
200 Proof EtOH brand not critical
Isopropanol brand not critical
Sodium Acetate brand not critical
DpnI New England Biolabs R0176 supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase Roche Life Science 10481220001 supplied with buffer
DpnII New England Biolabs R0543 supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England Biolabs N0446 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix Clontech 639201 supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787018 1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit QIAGEN 28004 or 28006 for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880 apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB QIAGEN 19086
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348 supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210
T4 Polynuleotide Kinase New England Biolabs M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) New England Biolabs M0212 supplied with buffer
sequencing adaptors Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200 used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2 Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit Kapa Biosystems KK2101 or KK2102 supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose Sigma Aldrich A4679
ethidium bromide Sigma Aldrich E1510-10ML 10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725121 or 1725122
Spectrophotometer brand not critical
0.45 μm PVDF Filter brand not critical
25 ml Seringe brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates brand not critical
6-well Tissue Culture Plates brand not critical
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories for qPCR
Vortex Mixer brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer brand not critical
Microcentrifuge brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply brand not critical
Magnet stand for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator brand not critical
E-gel electrophoresis system Life Technologies G6400, G6500, G6512ST

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References

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분자 생물학 문제 (107) DNA의 아데닌 메틸화 식별 (DamID) DamID-SEQ 차세대 시퀀싱 높은 처리량 시퀀싱 단백질 DNA 상호 작용을 핵 얇은 판
DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑
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Wu, F., Olson, B. G., Yao, J. DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments. J. Vis. Exp. (107), e53620, doi:10.3791/53620 (2016).

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