Summary
Detta protokoll ger en metod för att utföra kvantitativ, encelliga in situ analys av proteinuttryck för att studera härstamning specifikation mus preimplantatorisk embryon. De förfaranden som krävs för insamling av blastocyster, hela montering immunofluorescens detektion av proteiner, är avbildning av prov på en konfokalmikroskop och kärnsegmentering och bildanalys som beskrivits.
Abstract
Detta protokoll ger en metod för att utföra kvantitativ, encelliga in situ analyser av proteinuttryck för att studera härstamning specifikation i mus preimplantatorisk embryon. De förfaranden som krävs för embryosamlings, immunofluorescens, avbildning på en konfokalmikroskop och bildsegmentering och analys beskrivs. Denna metod tillåter kvantifiering av uttrycket av multipla kärnmarkörer och den rumsliga (XYZ) koordinaterna för alla celler i embryot. Det drar nytta av min, en bild segmentering verktyg speciellt utvecklat för analys av konfokala bilder av preimplantatorisk embryon och embryonala stamcells (ESC) kolonier. MIN utför obevakad kärnsegmentering över X, Y och Z dimensioner och ger information om cellposition i tredimensionell rymd, liksom kärn fluorescens nivåer för alla kanaler med minimal användarinmatning. Även om detta protokoll har optimerats för att analysera bilderav preimplantatorisk skede musembryon, kan det lätt anpassas till analys av andra prover som uppvisar en bra signal-brusförhållande och där hög nukleär densitets utgör ett hinder för bildsegmentering (eg., uttryck analys av embryonala stamceller (ESC ) kolonier, differentierande celler i odling, embryon från andra arter eller steg, etc.).
Introduction
Musen preimplantationsembryot är ett paradigm för att studera uppkomsten och upprätthållandet av pluripotens in vivo, samt en modell för studier av cell öde specifikation och de novo epitelbildning hos däggdjur. Preimplantationsperioden utvecklingsstadier däggdjur är avsedda för fastställandet av de tre cellinjer som utgör blastocysten, nämligen pluripotenta epiblast - som ger upphov till de flesta somatiska vävnader och könsceller - och två extraembryonic härstamningar, trophectoderm (TE) och primitiv endoderm (PRE) (Figur 1A) 1,2. Detta protokoll beskriver förfaranden för att (1) skörd och fixa preimplantatorisk skede musembryon, (2) utför immunofluorescens att märka proteiner av intresse, (3) utföra hela montering avbildning med en konfokalmikroskop med z-sektione kapacitet och (4) utföra kärnsegmentering av konfokala bilder och efterföljande kvantitativa bild analyser. Denna pipeline möjliggör than objektiva mätningar av proteinnivåer för tilldelning av cellidentiteter till karakterisera subpopulationer av celler in situ. Detta protokoll kan utföras i så lite som 3-4 dagar för en enda kull (i allmänhet upp till 10 musembryon), från embryosamlings till dataanalysen (Figur 1B). Samtidig analys av flera kullar skulle öka avbildning och dataanalys annan belastar, och därigenom förlänga den totala längden av protokollet.
Preimplantationsperioden steget musembryo är en experimentellt lätthanterligt system som, med tanke på dess ringa storlek och stereotypa morfologi 3, är väl lämpad för in toto avbildning av cellulära processer med encelliga upplösning. För att utföra en opartisk analys systemnivå av en statistiskt relevant antal embryon, är önskvärt en automatiserad, kvantitativ pipeline analys. Emellertid, tack vare den höga kärndensitet av den inre cellmassan (ICM) av blastocysten (
Rörledningen analys som presenteras här kretsar kring MATLAB-baserad bild segmentering verktyg Modular Interactive Nuclear Segmente (min) 4. MINS performs obevakad kärnsegmente på stora partier av konfokala Z-stackar efter att användaren har etablerat ett minimalt antal bildegenskaper, med hjälp av ett grafiskt användargränssnitt (GUI) (tabell 1) 4. Denna rörledning har visat sig vara effektiv för generering av hög kapacitet data om proteinuttryck och cell lokalisering i både vildtyp, experimentellt behandlade och genetiskt modifierade embryon och ESCs 5-7. I det nuvarande protokollet beskriver vi tillämpningen av minuter till segmentering av preimplantatorisk skede embryo bilder. För exempel på MINS prestanda på ESC hänvisas till 4,7. Den automatiserade kärnsegmente steg minskar avsevärt tiden bördan av cellidentifikationsprocessen, medan de rumsliga och fluorescensmätningar intensitet tillåter en opartisk bestämning av cellidentiteter och generering av tredimensionella kartor över genuttryck domäner och cellposition i embryot (Figur 1C 5,6. MIN är fritt tillgänglig på http://katlab-tools.org (programmet kräver en MATLAB licens).
Ingen metod utvecklats hittills tillåter alstring av sådana djupgående uppgifter om proteinuttryck och cell lokalisering i mus preimplantatorisk embryon. Alla försök hittills på att kvantifiera dessa typer av data har begränsats till den manuella bestämning och kvantifiering av cellantal för olika populationer i embryot (antingen helt manuellt eller mjukvaru assisterad) 9-19. Detta tillvägagångssätt (införliva MINS programvara) har skräddarsytts för och testats på mus preimplantatorisk embryon och ESC; ändå dess prestanda på andra system med hög nukleär densitets, men ännu oprövad, förväntas vara likvärdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla djur arbete, inklusive djurhållning, uppfödning och offer godkändes av Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), protokoll # 03-12-017.
1. embryosamlings
Obs: Alla djur arbete måste ha godkänts av institutionella och lokala myndigheter och överensstämma med lokala och institutionella regler.
- Mate en jungfru kvinnlig mus med en fertil avelshane av de önskade genotyper.
Obs: Om inrättande av naturliga parningar, väljer kvinnor i brunstfasen av Estral cykeln ökar risken för parning på önskat datum. Om inducera superovulation, hänvisas till de protokoll som beskrivs i 20. - Kontrollera förekomsten av en vaginalplugg på morgonen med ett trubbigt sond. Helst gör detta innan lunchtid (12:00), som copulation pluggar går förlorade under hela dagen. överväga noon för detektering av den vaginala pluggen embryonala dag (E) 0,5.
- På önskad dag och tid för embryonal utveckling, värma upp M2 eller spolning håller medium (FHM) till RT, eller företrädesvis 37 ° C. Obs: Antingen M2 eller FHM kan användas för spolning och hantering embryon. När den inte används, förvara dessa medier vid 4 ° C. Uppskatta användningen av ~ 2 ml medium för varje livmoder.
- Tina frysta 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller förbereda några färsk lösning. Uppskatta 500 pl 4% PFA lösning per brunn i en 4-brunnars platta. Fixa en kull på varje brunn i en 4-brunnars platta. Obs: Alternativt kan en 96-brunnar kan användas för att fixera och embryon butiks. Vid användning av en 96-brunnars platta, använda 100 | il av PFA-lösning per brunn.
- Dra ett glas pasteurpipett med hjälp av en öppen låga för att rita en kapillär ände i spetsen.
- Offra kvinnliga genom halsdislokation eller CO 2 inandning, eller i enlighet med lokala och institutionella regler. Det är ofta desirable för att bekräfta avlivning av djuret genom halsdislokation.
- Spraya magen av djuret med 70% etanol för att minimera hår shedding och utföra en buksnitt, först genom huden och därefter genom kroppsväggen (peritoneum) för att exponera inälvorna.
Obs: Följande steg beskriver proceduren att samla blastocyster från livmodern av en gravid kvinna mus i något skede mellan E3.25 och E4.5 (Figur 1A). För protokoll om insamling av preimplantatorisk embryon tidigare än E3.25, se 20. - Leta reda på livmodern och ta bort från djuret. Håll livmoderhalscancer änden av livmodern med en pincett, skär genom livmoderhalsen och dra upp försiktigt för att sträcka båda livmoderhornen.
- Trimma fett från livmodern, noga med att inte tränga igenom livmoderväggen. Detta kan göras enkelt vid tidpunkten för avlägsnande, samtidigt fäst vid kroppen hos djuret, eftersom livmodern kan sträckas ut. Alternativt är detkan ske senare, under ett dissektionsmikroskop, i RT PBS. För en mer detaljerad protokoll på dissekering av livmodern, se protokollen 5 och 8 20
- Klipp ovanför äggledarna, under äggstockarna, att frigöra hela livmodern, plats på en petriskål och täck med PBS.
Obs: Detta steg kan också tvätt av överflödigt blod eller annat skräp från livmodern, vilket underlättar efterföljande blastocyst skörd. - Separata både livmoderhornen genom att skära genom den proximala änden, på båda sidor av livmoderhalsen och kassera livmoderhalsen. Separera varje äggledare från livmodern genom att skära under näs som förbinder dem (Figur 1A). Överför de båda hornen till en droppe manipulation medium (antingen M2 eller FHM) för embryosamlings och manipulation.
- Enligt en dissektion mikroskop, skölj blastocyster ut ur livmodern och i mediet genom att tvinga 0,5 - 1 ml M2 eller FHM genom varje livmoderhorn från livmoderöppningen. Använd en 1ml spruta med en hypodermal nål. Notera: Nålen kan trubbiga med användning av ett arkiv sten för att undvika att riva uteri, även om detta är inte kritiskt. En detaljerat schema för livmoderspolning kan hittas i 21.
- Med hjälp av dissektion mikroskop, lokalisera blastocyster, som kommer att utspridda droppen av medium. Tillåter upp till 1 - 2 min för blastocyster att sjunka till botten av skålen efter spolning. Använda munnen styrda, glas pasteurpipett med en kapillär slut, samla alla blastocyster och överför till en ny droppe media.
- Skölj blastocyster genom att flytta dem genom 2 - 3 droppar av färskt M2 eller FHM. Flytta embryon i grupper om 5 - 10 blastocyster i taget.
Obs: Flytta större grupper vid någon tidpunkt kommer att påskynda processen, men det kommer också att öka chanserna att oavsiktligt förlora många embryon. Om outbildade i användningen av aptit kontrollerade pipetter, öva embryomanipulation och överföring bör övervägas innan beginning experimentet. - Ta Zona pellucida (ZP) från okläckta blastocyster (i allmänhet <E4.0) genom att kort tvätta dem i sur Tyrodes lösning. Så snart ZP är inte längre syns, överföra blastocyster tillbaka till manipulation media. Bara hålla embryon i syra Tyrodes så länge som är absolut nödvändigt för att förhindra skador på cellerna.
- Var försiktig vid hantering av avklädda blastocyster, om de iakttar mycket lätt till glas och plastytor. Manipulation mediet innehålla 4 mg / ml bovinserumalbumin (BSA) för att förhindra kvarstad, men syra Tyrodes eller PBS inte, därför, för att minska risken för skador eller förlust av embryon inte plocka upp mer än 2 - 5 avklädda blastocyster vid en tidpunkt då manipulera dem i BSA-fri eller serumfritt PBS eller syra Tyrodes.
Anmärkning: Alternativt belägga glaspipett med 1% BSA före användning för att minska vidhäftningen av de embryon som glasytan.
- Var försiktig vid hantering av avklädda blastocyster, om de iakttar mycket lätt till glas och plastytor. Manipulation mediet innehålla 4 mg / ml bovinserumalbumin (BSA) för att förhindra kvarstad, men syra Tyrodes eller PBS inte, därför, för att minska risken för skador eller förlust av embryon inte plocka upp mer än 2 - 5 avklädda blastocyster vid en tidpunkt då manipulera dem i BSA-fri eller serumfritt PBS eller syra Tyrodes.
- Belägga botten av varje brunnav en 4-brunnars vävnadsodlingsplatta med ett tunt skikt av 1% agar, till 0,9% NaCl förhindra embryon från att vidhäfta vid plasten. Alternativt, tillsätt 4 mg / ml av BSA till PBS (PBS-BSA).
- Fylla en brunn av den belagda 4-brunnars vävnadsodlingsplatta med 500 | il av RT PBS (eller PBS-BSA) och en annan brunn med 500 pl av 4% PFA i PBS.
- Skölj blastocyster i RT PBS och fixa i 4% PFA i PBS under 10 min vid RT. Överföra till PBS (eller PBS-BSA) efter fixering.
- Om embryon som inte kommer att behandlas omedelbart, täcka PBS innehållande embryon med ett lager av mineralolja för att förhindra avdunstning (som leder till uttorkning av provet) och förvara plattan vid 4 ° C.
Obs: Olika fixeringsmetoder och tider kan användas beroende på experimentet att epitoperna av intresse och antikropparna användas. Oavsett vilken metod som, vara konsekvent genom motsvarande experiment för att underlätta efterföljande jämförelse av färgningsresultaten.
Obs: Pauspoint: Embryon kan lagras vid 4 ° C i PBS för upp till flera veckor innan man går vidare till nästa steg. Se till PBS är steril och / eller tillfoga 100 U / ml av penicillin + 100 | ig / ml streptomycin (Pen-Strep) för att förhindra bakteriell kontaminering (speciellt vid användning av PBS-BSA) om att förutse långvarig lagring.
2. Immunofluorescens
- Utför immunofluorescens med användning av ett protokoll som tidigare har testats och visat sig vara robust för hela montering immunofluorescens. Obs: Vi rekommenderar de som beskrivs i 22 och 11. I denna artikel den förra kommer att beskrivas. Oavsett vilken metod som, vara konsekvent genom motsvarande experiment för att underlätta jämförelse av färgningsresultaten.
- Använda en flexibel, polyvinyl, fri, U-bottnad 96-brunnars platta för att utföra de sekventiella stegen i immunofluorescens-protokollet. Fyll varje brunn med 50 - 100 ^ lösning och flytta embryon från en lösningtill en annan med en L-formad mun pipett. Notera Denna metod minimerar användningen av reagens och underlättar spårning steg samt parallell färgning av flera experimentella grupper.
- Valfritt: Coat botten av brunnarna med ett tunt skikt av 1% agar, 0,9% NaCl för att förhindra vidhäftningen av embryon till plasten. Lägg inte till BSA till immunofluorescens lösningar.
- Förbereda PBX (0,1% Triton X-100 i PBS). Om förutse resultatet av flera immunofluorescens experiment, förbereda 50 ml PBX och förvara vid 4 ° C mellan experiment.
- Förbereda permeabilization lösning (0,5% Triton X-100, 100 mM glycin i PBS). Gör 1 ml (eller beroende på vilket belopp som krävs) färsk permeabilization lösning för varje experiment.
- Förbereda blockeringslösning (2% hästserum (HS) eller 20% fetalt bovint serum (FBS) med Pen-Strep i PBS). Förbered 10 ml och lagra vid 4 ° C mellan experiment.
- Inga skillnader har observerats mellan antingentyp av serum, emellertid inte överensstämma i valet av blockerande lösningen som används för motsvarande experiment.
- Skölj fasta embryon under 5 min vid RT i PBX (~ 100 | il).
- Permeabilize embryon under 5 min vid RT i permeabilization lösning (~ 100 | il).
- Skölj embryon under 5 min vid RT i PBX (~ 100 | il).
- Block embryon för 30 min till 1 h vid RT i ~ 100 | il blockeringslösning. Täck lösningen med ett skikt av mineralolja för att förhindra avdunstning eller hålla i en fuktig kammare.
Obs: Embryon kan blockeras i upp till O / N perioder vid 4 ° C utan märkbar förbättring eller nackdel jämfört med 30 min blockerande steg. - Inkubera embryon O / N vid 4 ° C i primär antikropp / antikroppar utspätt i blockeringslösning (~ 100 l). Täck lösningen med ett skikt av mineralolja för att förhindra avdunstning eller hålla i en fuktig kammare.
- Bestämma optimal utspädning för varje primär antikropp i förväg. se dISKUSSION och material sektion för testade utspädningar av ett antal antikroppar.
- Efter O / N inkubation, skölj embryon 3x under 5 minuter vardera vid rumstemperatur i PBX (~ 100 l).
- Block embryon för 30 min till 1 h vid RT i ~ 100 | il blockeringslösning. Täck lösningen med ett skikt av mineralolja för att förhindra avdunstning eller hålla i en fuktig kammare.
- Inkubera embryon för 1-2 timmar vid 4 ° C i sekundär antikropp / antikroppar späddes vid 4 ug / ml i ~ 100 | il blockeringslösning. Täck lösningen med ett skikt av mineralolja för att förhindra avdunstning eller hålla i en fuktig kammare.
- Skölj embryon 2x under 5 minuter vardera vid rumstemperatur i PBX.
- Flytta embryon till föredragna DNA-fläcken. Vid användning av Hoechst 33342, utspädd till 5 | ig / ml i PBS. Täck lösningen med ett skikt av mineralolja för att förhindra avdunstning eller hålla i en fuktig kammare.
Obs: Paus punkt: Om embryon inte som avbildas omedelbart, kan de hållas för up till flera veckor i nukleär färgning lösning. I detta fall, se till PBS är steril och / eller lägga till Pen-Strep eller natriumazid för att förhindra bakterietillväxt och föroreningar.
3. Confocal avbildning
Obs: Enskilda konfokalmikroskop konfigurationer kommer att kräva särskilda insamlingsparametrar justeras för system och programvara på plats. Ger emellertid följande avsnitt en rad allmänna regler att följa som bör gälla en viss installation.
- Med hjälp av en fin mun pipett göra mikrodroppar av PBS eller kärn fläck lösning på glasytan av en 35 mm glas nedre skålen och täck med mineralolja. Som ett alternativ, använda en vanlig täck med silikon separatorer för att undvika skador embryon och täck med ett glas objektglas. Obs: När du använder en vanlig täck, embryon kan inte därefter omplaceras eller återvinnas för genotypning, därför rekommenderar vi användning av glasbottendisk.
- Placera embryon i de mikrodroppar och ordna på ett konsekvent sätt, företrädesvis med ICM-kaviteten axel är parallell med glasytan. Ställ in skålen på mikroskop hållaren. Notera: Bilder som erhållits på laserskanning konfokala mikroskop lider Z-axeln-associerad förlust av fluorescensintensiteten. Därför är det viktigt för att jämföra intensiteter mellan motsvarande regioner på olika embryon konsekvens i arrangemanget.
- Ställ in referensparametrar som använder vildtyp embryon som inte har varit föremål för någon form av behandling som kan förändra genuttryck.
- Förvärva bilder med hjälp av en hög förstoring mål (dvs 40X eller högre) för att få fram data som underlättar korrekt segmentering med hjälp av MINS verktyget 4.
Obs: Använda den digitala zoomen på en 20X mål kommer inte att ge bilder med tillräcklig upplösning för segmentering med hjälp av min. Man bör också notera arbetsavståndet (WD) av målet, som det borde varatillräcklig för att tillåta förvärv av en Z-stack som upptar hela blastocyst, alltså en lång WD (~ 130-150 nm) mål är oftast nödvändigt. De bilder som visas i figurerna 2 - 4 förvärvades med hjälp av en 40X / NA 1,30 oljeimmersion mål med ett arbetsavstånd av 210 pm. - Använd lägsta laser utgång som ger en stark signal-brusförhållande utan blekning fluoroforerna.
- Justera förstärkning och offset för att få bredast dynamiska omfånget utan att överexponera provet. Utsätta bilderna för att täcka större delen av, eller spänner över hela, gråvärdesområde kommer att underlätta detektering av små skillnader i intensitet mellan bilderna.
- Använd en liten (1 pm) Z-steg, eftersom Z-axeln resolutionen avgörande för korrekt segmentering med min.
Obs: XY dimensioner påverkar inte kärnsegmenteringsprocessen, bara bildfilen. Generellt 512 x 512 bildpunkter är en tillräcklig XY upplösning för publicering bildkvalitet utan compromisjunga hårddiskutrymme. - Kritiskt steg: Håll avbildning parametrar konsekventa inom och mellan avbildning sessioner av samma experiment för att kunna jämföra proverna.
- Förvärva bilder med hjälp av en hög förstoring mål (dvs 40X eller högre) för att få fram data som underlättar korrekt segmentering med hjälp av MINS verktyget 4.
- Imaging partier av embryon:
- Bild sammanhängande grupper (kullar, experiment) i en enda session så är möjligt.
- Håll parametrar konsekventa inom och mellan avbildning sessioner för kopior av samma experiment.
- Bild embryon hela (hela Z-axeln) för att fånga varje cell.
Obs: Om så önskas kan embryo genotypning göras efter avbildning som beskrivs i 23. Behovet av innesluten PCR måste bestämmas empiriskt och beror på den plats, som skall analyseras och de primrar som används.
- Se till att kunna matcha embryon till bilderna i efterhand.
4. Bildbehandling och data Pre-processing
- Ladda ner och installera MIN 4 från http: // Katlab-tools.org (MATLAB licens krävs).
- Utför bildsegmentering:
- Följ det grafiska användargränssnittet (GUI) i minuter att ladda en konfokal bild eller en stapel från hårddisken, upptäcka kärnorna och segmentera bilden. Ladda hela Z-stack av rådata som genereras av mikroskop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Se tabell 2 för detaljer om varje steg och anvisningar som finns på http://katlab-tools.org och 4. När de är färdiga, se resultatet av varje steg genom att klicka på motsvarande "Visa" knappen. En gul tagg ovanför knappen visar operationen i processen, en grön tagg indikerar operationen avslutats.
Obs: MIN för närvarande inte stöder .czi filer, Tiff sekvenser eller flera positions filer - varje Z-stack måste vara en oberoende fil. - Efter tillfredsställande segmente, spara rörledningen skapas så att den kan användas direkt för andra embryon eller kullar.
- Följ det grafiska användargränssnittet (GUI) i minuter att ladda en konfokal bild eller en stapel från hårddisken, upptäcka kärnorna och segmentera bilden. Ladda hela Z-stack av rådata som genereras av mikroskop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Se tabell 2 för detaljer om varje steg och anvisningar som finns på http://katlab-tools.org och 4. När de är färdiga, se resultatet av varje steg genom att klicka på motsvarande "Visa" knappen. En gul tagg ovanför knappen visar operationen i processen, en grön tagg indikerar operationen avslutats.
- Batch-Mode segmente:
Notera: Single filer kan segment individuellt. Med tanke på att embryon inom en kull eller experiment är i allmänhet jämförbar skede kan MIN tillämpa segmente pipeline skapas för en enda bild till en grupp av dem utan tillsyn.- Från Batch-Mode Kör-menyn, klicka på "Lägg till filer" och ladda alla filer som ska behandlas på en gång. Obs: Filer från olika källor kan tillsättas till den segmenteskön.
- Klicka på "Starta Batch-Mode Run" och ge tid för programmet att bearbeta filerna. Notera: Segmente produktion kommer att sparas i samma katalog där de ursprungliga filerna där belägen.
- Segmente bedömning och manuell korrigering
Obs: min segment bilder med mycket hög noggrannhet (> 85%), kan dock kvaliteten på färgning och bildhantering, liksom scenen av embryot påverkar MINS prestanda. Generellt gäller att ju högre den nukleära densitet inom embryot, desto mer sannolikt segmente fel ta place (figurerna 2D, 3). Därför bör segmente noggrannhet utvärderas för varje prov och korrigeras manuellt om det behövs. Två typer av fel uppträder vanligen: översegmentering och undersegmentering.- Lösa över segmente:
- Identifiera falska positiva - apoptotiska vesiklar (Figur 3A a, b, d, asterisker) eller andra element som inte är intakta kärnor, men som kan ha identifierats som sådana av min.
Obs: I allmänhet sådana falska positiva har en mindre storlek än riktiga kärnor och kan i de flesta fall, lätt identifieras och sorteras på kalkylarket. Dock är visuell undersökning rekommenderas, som ofta kärnor kan endast delvis segmenterad, vilket resulterar i en mindre, men giltig segmenterad volym (Figur 3A B, pilspets). - Ta bort motsvarande poster för falska positiva från * statistics.csv filen. Bevara den ursprungliga * statistikCSV-fil för framtida referens och redigera endast en kopia av det.
- Om en kärna har översegmenteras och presenteras som 2 eller fler kärnor (figur 3A c, pil och pilspetsar), antingen sammanfoga posterna genom medelvärdes deras intensitetsnivå eller om liknande, hålla en av posterna för den cellen och kassera resten.
- Identifiera falska positiva - apoptotiska vesiklar (Figur 3A a, b, d, asterisker) eller andra element som inte är intakta kärnor, men som kan ha identifierats som sådana av min.
- Lösa undersegmentering:
- Identifiera händelser där MIN har misslyckats att detektera gränsen mellan två eller flera kärnor och därmed segmenterad dem som en enda kärna (Figur 3A d, pil och 3B). Notera: Detta utgör ett problem för en noggrann cellräkning, men ännu viktigare, för att kvantifiera proteinnivåer, som de nivåer som uppmätts kommer att vara genomsnittet för de celler som har varit felaktigt slås samman, och som kan tillhöra olika härstamningar.
- Identifiera händelser där MIN har misslyckats att detektera en kärna helt och hållet.
- I dessa fall (4.4.2.1 och 4.4.2.2), mäta den genomsnittliga grånivåerna feller varje kanal i över- eller un-segmenterad cell (s) med hjälp av ett alternativt verktyg, såsom ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), och ersätta den felaktiga posten med rätt nivå. Bevara den ursprungliga * statistics.csv fil för framtida referens och redigera endast en kopia av det. För att göra detta med hjälp av ImageJ, så här:
- Öppna relevant flerkanals stack på ImageJ och importera motsvarande * overlaid.tiff fil som genereras av MIN som en virtuell stack (Arkiv> "Importera"> "TIFF virtuell stack ...").
- Hitta en medial del av under- eller un-segmenterad kärna.
- Använda frihand markeringsverktyg beskriva omkretsen av under- eller un-segmenterad kärna på DNA fläcken kanalen.
- Tryck Crl + M (Cmd + M på en Macintosh) eller gå till Analysera menyn och välj "Mät". Denna åtgärd kommer att spela Mean grå värde för området som beskrivs och kommer att visa det på ett nytt fönster. Gå till "Analysera">9; Set mätningar ... "och se till att" Mean grå värde "väljs. Välj andra parametrar som skall mätas.
- Med användning av samma område beskrivs i steg 4.4.2.3.3, upprepa mätningen för var och en av de fluorescenskanaler av intresse. Resultaten kommer att läggas till den tidigare på mätningar "Resultat" fönster.
- Använd mätvärdena att ersätta de felaktiga poster i * statistics.csv filen. Om kärnan inte hade segmenterade, infoga en ny rad, tilldela den en ny cell-id och införa de värden som erhålls i ImageJ under motsvarande kolumnen för varje kanal. Denna cell kommer inte att ha spatiala koordinater (X, Y och Z-värden). Om kärnan hade undersegmented, duplicera sin rad, tilldela olika Cell-ID till varje ny cell och införa de värden som erhålls i ImageJ under motsvarande kolumn. I detta fall kommer båda cellerna dela rumsliga koordinater.
Obs: Om rumsfördelning ska analyseras, vi recommend exklusive XYZ-koordinaterna för dessa celler, eftersom de kommer att överlappa varandra. För detta ändamål, när du skapar nya poster, tilldela Cell-ID för dem som lätt kan särskiljas från de ursprungliga (till exempel icke-heltal).
- Score delande celler. Obs: MIN upptäcker mitotiska liksom interfas kärnor, men kan inte skilja mellan dem.
- Om mitotiska kärnor ska behandlas separat i analysen manuellt poäng dessa och lägga denna information till datafilen. För att spela in mitotiska celler, lägga till en ny variabel (kolumn) till * statistics.csv datafilen och tilldela olika värden till mitotisk och interfaskärnorna.
- Lösa över segmente:
- Data förbehandling.
Obs: När kalkylblad har korrigerats för över- och undersegmente de är redo att analyseras. Analysprocessen och datapresentation kommer att bero på den specifika experimentet. Men nedan är några allmänna uppgifter transformationerVi rekommenderar att utföra före analys:- Omvandla fluorescensintensitetsvärdena i deras logaritm eller kvadratroten för att minska spridningen av data. Detta hjälper också visualisering, såsom rådata tenderar att koncentreras nära axlarna för plot (se figur 4B, C).
- Korrigera Z associerade dämpning av fluorescens:
Obs: Fluorescence intensitet i laserskanning konfokalmikroskopi bilder minskar djupare på Z-axeln en skiva ligger (Figur 4E, F).- Om en av epitoperna som detekteras i proven är en allestädes närvarande och homogent uttryckt hushållning nukleär markör, normalisera fluorescensintensiteterna hos de andra epitoper genom att dividera deras värden i varje cell genom det motsvarande värdet av hushållning markör.
- I avsaknad av en sådan referensmarkör, kompensera Z-associerad förlust av fluorescens på följande sätt:
- Rita värdena för varje markör (Yaxeln i diagrammet) över Z-position (X-axeln i diagrammet) för att visualisera minskningen i intensitet över Z - tomt ihop värdena för all kontroll, vilda embryon typ (Figur 4F).
- Passa en linjär modell (regressionskurvan) till tomten som erhölls i föregående steg (intensitetsvärden över Z) för varje markör (Figur 4F).
- Rätta alla värden för varje markör med hjälp av följande formel:
log (ursprungliga värde) + Z * lutning av modellen (Figur 4D, G).
Obs: De särskilda åtgärder för att utföra denna korrektion kommer att bero på analys programvara som används (R, MATLAB, etc.). Om du använder R, kör följande formel för att passa en linjär modell till data:
> Lm (log (kanal) ~ Z, data = dataframe)
där, är kanal fluorescenskanalen rättas till, Z är Z-koordinaten och dataframe är tabellen som innehåller alla värden för den önskade embryot (s) (den * statistics.csv fil som genereras av minuter eller en modifiering av det).
Notera: Utsignalen från ovanstående formel kommer att ha följande format:
(Intercept) Z
4,76373 -0,01947
där, är värdet Z lutningen för regressionslinjen för den datamängd, som absolut värde bör användas för att ändra det ursprungliga värdet med den formel som ges i 4.5.2.2.3 (se figur 4G för ett exempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att underlätta tolkning av data och presentation, bör man inte skada embryona under insamling och hantering, så att alla celler och deras relativa position kan analyseras Figur 2A -. D visar exempel på intakta blastocyster i olika skeden med en utökad hålighet. Skulle skada inträffa, bör extra försiktighet iakttas vid analys och tolkning av resultaten.
Kvaliteten och tillförlitligheten hos de data som genereras med användning av detta protokoll är beroende av kvaliteten på den fixering och på förhållandet signal-till-brus av de antikroppar som används för att detektera proteinerna av intresse. Använd alltid färsk fixativ och testa nya antikroppar, med lämpliga positiva och negativa kontroller, innan en serie experiment. Figur 2A visar exempel på goda antikroppar för ett antal kärnproteiner. Figur 2B visar en example av en bra antikropp för ett cytoplasmiskt protein (DAB2). Figur 2C visar ett exempel på en dålig färgning, med lågt signal-till-brusförhållande, där provet fastställdes till endast 10 min. I detta fall, den antikropp som används för GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) kräver O / N fixering för att ge en stark signal (se 24 för förekomster av embryon fasta O / N och färgades med denna antikropp). Ökning av signalnivån vid efterbearbetning avslöjar en mycket brusig bild. Däremot den anti-GATA4 som används för figur 2A (sc-9053) ger hög signal-till-brus-förhållandet efter endast 10-min fixering. Mer information om dessa och andra robusta antikroppar finns i avsnittet Material.
De begränsande faktorerna för en bra MINS segmente är a) förstoringen av objektiv som används för avbildning, b) Z-upplösning och c) kvaliteten på det nukleära färgnings. Figur 2D visar exempel på embryon avbildas med en oil nedsänkning 40X objektiv med en NA på 1,30 och en 0,21 mm WD. Mellersta paneler visar förstoringar av ICM där enskilda kärnor och gränsen mellan dem kan urskiljas. Om du inte använder DNA färgning (dvs., Hoechst, DAPI, TO-PRO3 YO-YO1, etc.) fluorescensvärdena för kvantifiering, förvärvsparametrar kan justeras individuellt för att erhålla den bästa signalen. Bottenpaneler visar hur mer avancerat embryot, desto högre nukleär densitets och sålunda desto större är risken för segmente fel (pilspets och pil). Figur 3 visar exempel på fel som MINS kan begå, till exempel detektering av apoptotiska kärnor som levande celler ( asterisker i paneler i figur 3AA, Ab, Ad), översegmente (pil och pilspetsar i figur 3AC) eller under segmente (pilen i figur 3AD). Figur 3B visar en sekvens av Z-segment av en undersegmente händelse, där två celler har identifierats som en. Lägg märke till hur MINS segmente tar Z-axeln hänsyn till segment en volym som omfattar alla skivor när en viss cell är närvarande.
Slutligen kommer detaljerna i dataanalysen beror på den fråga som studien, därför riktlinjer för analysprocessen kan inte ges här. Emellertid har vi funnit vissa initiala data transformationer för att vara användbara figur 4B -.. D visar kurvor för fluorescensvärdena för markörer NANOG och GATA6 i ICM av embryot som visas i figur 4A Figur 4B visar de råa fluorescensvärdena erhållna från MINS (efter manuell korrigering av under- och översegmente). Figur 4C visar samma data efter en logaritmisk omvandling, som separerar de värden från tomten axlar (a kvadratrottransformering är också möjligt och ger en liknande diagram). Figur 4d visar samma data efter automatiskt correcting värdena för Z-associerade dämpningen i fluorescens, som förklaras i steg 4.5.2.2 i protokollet. Exempel på detta Z-associerad fluorescens sönderfall ges i bilden i fig 4E och kurvorna i 4F. Figur 4G visar effekten för dataomvandlings förklaras i 4.5.2.2. Färger som representerar antingen epiblast (röd, NANOG +, GATA6-) eller pre (blå, NANOG-, GATA6 +) identitet har lagts till i handlingen som en funktion av NANOG och GATA6 värden. I detta speciella exempel, celler där förhållandet av log [GATA6] / log [NANOG]> 1,25 ansågs Pre, celler där förhållandet av log [GATA6] / log [NANOG] <1 ansågs EPI, och celler med en mellanliggande förhållandet ansågs obekräftat (ingen i detta fall). Alla data transformationer och tomter har gjorts i Rstudio är dock inte kritisk valet av mjukvara och kommer att bero på slutanvändaren.
Figur 1. Embryo plats, Tidslinje och analys Pipeline. (A) Schematisk bild av en (av två) mus livmodern horn och stadier av preimplantatorisk utveckling, i linje med det område av horn var de ska hittas. (B) Experimentell tidslinje med timing för varje steg. Stegen i protokollet och paus punkterna (blå) anges. (C) Sammanfattning av bildinhämtning och analys rörledning med hjälp minuter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på immunofluorescens och Nuclear densitet. (A) Exempel på bra immunofluorescens resultat med testade antikroppar för kärn transcription faktorer. Anti-CDX2 detekterades med en Alexafluor 488 åsna anti-mus sekundär antikropp, anti-GATA6 med en Alexafluor 568 åsna anti-get, anti-NANOG med en Alexafluor 647 åsna-anti-kanin, anti-GATA4 (Santa Cruz, sc-9053 ) med en Alexafluor 488 åsna anti-kanin och anti-Oct4 med en Alexafluor 647 åsna anti-mus. Alla primära antikroppar listas i Material Tabell. Cytoplasmisk GATA4 kärnfärgning är ospecifik och visas även i GATA4 null embryon (visas ej). (B) Exempel på god immunofluorescens för ett cytoplasmatiskt protein, DAB2. Det har detekterats med användning av en Alexafluor 488 åsna anti-mus. (C) Exempel på dålig immunofluorescens, med en låg signal-till-brusförhållandet för en nukleär faktor. GATA4 har detekterats med en anti-GATA4 uppkommit i get (Santa Cruz, sc-1237; medan sc-9053 (kanin-anti-GATA4) användes i (A)) och en Alexafluor 568 åsna anti-get. (
Figur 3. Exempel på MINS fel. (A) Sekvens av enskilda Z-profiler från ett embryo som visar exempel på MINS segmente fel. Apoptotiska celler som ändå identifieras som kärnor är markerade med en asterisk (*) i paneler a, b och d. I panel b, ID # 39 (pilspets), om än mycket liten, inte identifiera den motsvarande kärnan och kan således lämnas okorrigerat. I panel C, ID # 66 (pil) omfattar två olika nuclei, som har i sin tur har identifierats separat (pilspetsar, ID # 65 # 54 och # 53). I panel d, har två celler (ID # 63) har identifierats som en enda (se pil markerar tunna gränsen) och denna post bör därför dupliceras för cellräkning ändamål. (B) MINS detekterar celler utmed Z-axeln. Bilderna visar en sekvens av Z-segment av två celler som har felaktigt skårade som en enda en (# 123). Notera hur det blå området avgränsar kärnorna är kontinuerlig längs Z. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på segmentering och Data transformationer. (A) Bilder av ICM celler i en blastocyst färgade för NANOG och GATA6 och ögonblicksbild av kärnsegmentering av sammaembryo med hjälp minuter på det nukleära färgnings kanal (Hoechst 33342). (BD) nanog och GATA6 fluorescensvärdena i ICM-celler mätta med MINS ritas som rådata (B), efter att ha utfört logaritmisk transformation (C) och efter att ha korrigerat värden för fluorescenssönderfallet utmed Z-axeln och automatiskt tilldela cellidentiteter som baseras på den korrigerade värden (D). (E - G) Exempel på uppgifter korrigering för fluorescens förfall längs Z-axeln. (E) Bilder av en blastocyst märkt med Hoechst och anti-CDX2 + Alexafluor 488 (AF488), visar fluorescens minskning längs Z-axeln. (F) Spridningsdiagram av fluorescensvärden längs Z-axeln för Hoechst och AF488 för en pool av embryon inklusive den som visas i (E). Grå linjen representerar regressionskurvan för varje uppsättning av värden. (G) Samma uppgifter som i F efter att kompensera fluorescens förfall för varje cellmed användning av följande faktor: Z-koordinat * lutningen hos den linjära modellen (se steg 4.5.2.2 i protokollet). Paneler E - G ursprungligen publicerad av författarna i noden (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Varje punkt representerar en cell. Skala = 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| indata från användaren |
| Ljusstyrka tröskel * (underlättar kärn upptäckt i dunkla bilder) |
| Relativ X / YZ upplösning |
| Kanal att segmentera |
| kärndiameter |
| Bild ljudnivå |
| MINS Utgång |
| Segmente Z-stack med NuclEI-ID: n |
| nukleär volym |
| XYZ-koordinater för varje kärna |
| Genomsnitt och summering av fluorescensvärdena för varje fluorescens kanal och kärna |
| fördelar |
| Exakt segmente (> 85%) av kärnor hela bunten - erkänner alla förekomster av en kärna i angränsande Z-profiler |
| Enda cell upplösning |
| Oövervakad segmentering av partier av embryon |
| Segmente rörledningar kan antingen sparas och återanvändas eller justeras för varje särskild embryo |
Tabell 1. MINS Funktioner
| belastning Image | Vid prompten införa Z relativa upplösning förbild. Det kan erhållas från metadata med standardläsaren eller tillämpning av följande formel: X (eller Y) upplösning / Z upplösning (alla i um). |
| Ange sekvensnumret (1-5) för den kanal som ska segmenteras. Användning av DNA-fläcken kanal för segmentering kommer att upptäcka alla celler i bilden, men andra kanaler kan segmenteras separat också. | |
| Ange ramen för att börja segmente på (en som standard). Gäller endast filer med flera tidsramar. | |
| Förbättra bild (tillval) | Den vita och svarta punkt i bilden kan justeras för att underlätta detektering. Generellt sänka vitpunkt och omskalning till 0-255 (för 8-bitarsbilder) eller 0-4096 (för 12-bitars bilder) kommer att göra bilden ljusare och lättare att upptäcka dunkla kärnor. |
| detektera Nuclei | Välj den uppskattade kärndiameter (i allmänhet mellan 30 och 40 px i blastocyster). |
| För bullriga bilder kan justeras ljudnivån. Annars kommer standardvärdet tillämpas. | |
| segmentet Nuclei | Använda standardparametrar. |
| Classify Nuclei | MIN kan skilja trophectoderm (TE) från inre cellmassan (ICM) celler i preimplantatorisk embryon baserade på position. Detta kan också göras manuellt eller baserad på fluorescensnivåer om en TE-markör användes. |
| export Resultat | Välj de filer som ska genereras: |
| - Segmentering överlagras över den kanal som används (TIFF sekvens fil) | |
| - Segmente bara (.tiff sekvens fil) | |
| - Kalkylblad med ID för alla celler upptäcks XYZ koordinater och fluorescens nivåer (genomsnitt och summan) för alla kanaler för varje cell (CSV-fil). | |
| Alla filer som exporteras som standard. Filer sparas i same katalog där bilderna finns. |
Tabell 2. MIN Segmente Pipeline
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att utföra en kvantitativ analys av hela montera immunofluorescens på preimplantatorisk skede musembryon. En robust immunofluorescens protokoll 22 följs av hög upplösning, hela montering konfokal avbildning och bildsegmentering med hjälp av en skräddarsydd mjukvara 4. Även valet av immunofluorescens-protokollet är inte kritisk, finner vi det som presenteras här 22 att vara snabb, pålitlig och att tillhandahålla robust signal för många av de antikroppar som vi har testat. Andra protokoll kan följas, förutsatt att deras tillämpning är konsekvent över motsvarande experiment. Medan många faktorer påverkar resultatet av varje enskild experiment, och direkta jämförelser mellan experiment är inte nödvändigtvis möjligt, har vi funnit att sträva efter överensstämmelse mellan repetitioner och utför tillräckliga tekniska replikat minskar kraftigt variabilitet. Därför, när optimerad, fixering och immunolabeling reagenser och protokoll, samt avbildningsbetingelser bör hållas konstant mellan motsvarande experiment.
De huvudsakliga problem som kan uppstå vid tillämpningen av detta protokoll kan delas in i två grupper: 1) dålig kvalitet färgning, med svag signal, och 2) suboptimal segmente, med många fel (dvs över- och undersegmentering). Låg kvalitet immunofluorescens är i allmänhet på grund av felaktig fixering av proverna eller antikropparna inte är lämplig för hela montering immunofluorescens. Se till PFA är färska (antingen nygjord eller upptinat till RT från -20 ° C inte längre än en vecka före). Med tanke på den begränsade storleken på preimplantation embryon, bör 10-min fixering i PFA räcka. Emellertid har vi funnit vissa antikroppar för att ge en starkare signal med längre fixering gånger (se Material). Om en antikropp som tidigare har testats ger svag signal, prova olika fixeringsprotokoll. Inte alla antikroppar utför kraftigt på hela montering IMMunofluorescence och valet av primära antikroppen är avgörande för resultatet av experimentet. Nya antikroppar bör testas på embryon och den optimala koncentrationen bestämmas empiriskt. I material diagrammet ger vi information om ett antal antikroppar som vi har testat och använder rutinmässigt. Se den publicerade litteraturen eller tillverkarens information när man överväger nya antikroppar. Observera att inte alla antikroppar som är lämpliga för Western blot arbete i hela montering immunofluorescens och koncentrationerna som krävs för immunofluorescens kan vara upp till en tiopotens högre. Kommersiella sekundära antikroppar i allmänhet fungerar bra ur lådan dock vara konsekvent i användningen av primär sekundära antikroppskombinationer under motsvarande experiment som kommer att jämföras.
Kvaliteten på bildsegmentering beror både kvaliteten på den nukleär färgning och på den nukleär densitets i ICM av embryot. strävar alltid för ljus,skarpa kärnor och använda en högupplösande objektiv (40X eller mer). Om den nukleära fläcken signalen är låg, använd en ny omgång eller ett nytt parti. Så länge kärn fläcken inte används för kvantifiering, kan förvärvet parametrar justeras för varje embryo för att spela in skarpa, ljusa kärnor. Likaså, om en annan person än nukleär färgning kanal används för segmentering, kommer förhållandet signal-till-brus av denna specifika kanal avgöra kvaliteten på den segmentering. Sent skede blastocyster (E4.0 och framåt) presenterar en mycket hög kärntätheten inom ICM. Därför är det vid dessa stadier att hög kvalitet färgning är mest kritisk. Ändå kommer segmente fel sker oftast vid dessa stadier. Inför den uppskattade kärndiameter och bildbrusnivån på MINS rörledningen, utforska resultatet av varje steg med hjälp av "Visa" knappen och justera parametrarna tills ett tillfredsställande resultat uppnås. Använd parametrar som producerar den bästa segmenteoch manuellt korrigera fel under databehandling. Observera att sena embryon stadium (~ E4.5) har en hög celltal och manuell datakorrigering blir tidskrävande.
Begränsningarna i detta protokoll bestäms av konfokalmikroskop system som används för bildtagning. Såsom diskuterats, använda en hög-förstoring mål, med ett arbetsavstånd som tillåter Z-axeln avbildning av hela embryot (preimplantation musembryon kan nå upp till 150-160 | j, m i diameter). På samma sätt kommer antalet epitoper som kan detekteras bestämmas genom antalet kanaler mikroskopet kan förvärva på en gång. Med hjälp av detta protokoll, kan tre olika epitoper förutom DNA (4 kanaler totalt) märkas samtidigt på varje prov. Säkerställa att instrumentet är kalibrerat för varje fluorescenskanalen, är grindnings optimeras och att laserutgången är konsekvent.
De metoder som beskrivs här gör det möjligt för analysen av cell position längsXYZ-axlarna samt kvantifiering av proteinexpressionsnivåer in situ för varje enskild cell i musblastocyster. I vår erfarenhet, kan alternativa metoder med hjälp av någon annan tillgänglig programvara inte den nivå på upplösning att ledningen tillämpas i detta protokoll kan (se 4 för en direkt jämförelse med andra verktyg). Den höga nukleär densitets hittas i ICM av blastocysten orsakar andra verktyg för att generera så många misstag att omfattningen av manuell korrigering som krävs gör deras användning opraktisk. Alternativt har manuella cellräknings och fluorescensmätningar använts tidigare för undergrupper av celler eller definierade områden av embryot 10,11,18,19,24. Emellertid skulle manuell räkning och mätning av alla fluorescenskanaler och cell läge, i alla XYZ axlarna, för tiotals celler som finns i varje embryo vara så tidskrävande att det inte gör det möjligt att med hög genomströmning analys som våra protokoll utformades . Dessutom manuell enEDÖMNING av fluorescensnivåer är benägen att bias, medan en rörledning såsom den som beskrivs här gör det möjligt för en objektiv mätning av fluorescensintensiteter för efterföljande bestämning av cellidentiteten. För att tilldela cellidentiteter, att utredaren bör upprätta ett standardkriterium tillämpas på alla prover för en viss experimentell inrättas. Med tanke på de olika faktorer - biologiska och tekniska - som kan påverka resultatet av immunmärkningen, bör detta kriterium bestämmas med hjälp av lämpliga kontrollexperiment och tidigare publicerade data i möjligaste mån. Vi föreställer oss en nära framtid där en algoritm kan utformas för automatisk bestämning av cellidentitet oberoende av experimentet. Dock kommer ett sådant verktyg bara komma från mer omfattande tillämpning och förbättring av den nuvarande metoden, troligen tillsammans med maskininlärning algoritmer.
Slutligen, med tanke på enkelheten i denna rörledning och stereotypa Morpholnik av mus preimplantatorisk embryon, är detta protokoll skalbar för analys av ett stort antal embryon, vilket möjliggör hög genomströmning analyser av noll fenotyper 5,6 eller någon annan experimentell manipulation 7. Slutligen, medan det nuvarande protokollet har utformats och optimerats för analys av preimplantatorisk musembryon och ESK kolonier, ser vi ingen anledning a priori varför det inte skulle kunna tillämpas på andra system med liknande egenskaper - nämligen hög kärn densitet. Vi uppmuntrar andra att experimentera och anpassa detta protokoll till andra scenarier och ge feedback för sin framtida förbättringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
