Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Published: February 12, 2016 doi: 10.3791/53658
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3
1Ischemia Research Unit, Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Fraunhofer Research Institution for Marine Biotechnology, University of Lubeck, 3Department of Neurology, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Abstract

السكتة الدماغية تستهل الاستجابة الالتهابية قوية أن يبدأ في حجرة داخل الأوعية الدموية وينطوي على تفعيل السريع للخلايا المقيمين الدماغ. آلية رئيسية من هذه الاستجابة الالتهابية هي هجرة تعميم الخلايا المناعية إلى الدماغ الدماغية سهلت الإفراج chemokine وزيادة التعبير جزيء التصاق الخلايا البطانية. ومن المعروف جيدا كريات الدم البيضاء-غزو الدماغ المساهمة في مرحلة مبكرة الإصابة الدماغية الثانوية، ولكن تم مؤخرا لاحظت أهميتها لإنهاء الالتهاب وإصلاح الدماغ في وقت لاحق فقط.

هنا، يتم توفير بروتوكول بسيط للعزلة كفاءة الخلايا المناعية من مخ الفأر الدماغية. بعد نضح transcardial، يتم تشريح نصفي الدماغ وفصلها ميكانيكيا. ويتبع الهضم الأنزيمي مع Liberase من التدرج الكثافة (مثل Percoll) الطرد المركزي لإزالة المايلين والحطام الخلية. واحد الميزة الرئيسية لهذا ط بروتوكولق طبقة واحدة الإجراء التدرج الكثافة التي لا تتطلب وقتا طويلا إعداد التدرجات ويمكن أن يؤديها بشكل موثوق. النهج غلة عدد الخلايا استنساخه للغاية في نصف الكرة المخ ويسمح لقياس عدة لوحات التدفق الخلوي في تكرار البيولوجي واحدة. التوصيف المظهري وتقدير من الكريات البيض، تغزو المخ بعد السكتة الدماغية التجريبية يمكن أن تسهم في فهم أفضل لأدوار متعددة الأوجه في الإصابة الدماغية والإصلاح.

Introduction

السكتة الدماغية الدماغية يتسبب في الاستجابة الالتهابية المتواصلة التي تبدأ بسرعة بعد وقف تدفق الدم المحلي ويشمل تقريبا جميع أجزاء من الجهاز المناعي. واحدة سمة هامة من هذه الاستجابة الالتهابية هي تدفق الوقت المناسب من الخلايا المناعية إلى الدماغ الذي يحركه تنشيط الخلايا البطانية الدماغ، إفراز chemokine كبير وزيادة تدفق متعاطفة 1-3. اعتبر تسلل خلية التهابات سابقا ضارة في السكتة الدماغية، ومع ذلك، فشلت عدة محاكمات العلاج يهدف إلى منع عشوائيا الكريات البيض الخروج إلى الدماغ للحث على فائدة سريرية قابلة للقياس (4). وفي الآونة الأخيرة، أصبح واضحا أن الخلايا المشتقة من الوحيدات تشترك في بادئ الأمر في تطور الضرر نقص تروية 5 قد تلعب أيضا دورا محوريا لقرار من التهاب الأنسجة واللاحقة إصلاح 6.

بفضل تحديد المظهرية وfunctiعدم التجانس بين اونال وحيدات الضامة، وسعت بشكل كبير من المعرفة حول دور البالعات وحيدات النوى في التنمية وحل التهاب. في الفئران، وحيدات تعميم يمكن تصنيفها إلى قسمين على الأقل فرعية متميزة وظيفيا وفقا لتعبير سطحها من اللمفاويات مستضد 6 مجمع (لي-6C) 7. في حين كانت لي-6C monocytes''inflammatory عالية يظهر ذلك بوضوح على أنها ضرورية لمكافحة الالتهابات البكتيرية 8، ودورها في الإصابة العقيمة هو أكثر إثارة للجدل. في السكتة الدماغية، أدى الاجتثاث الانتقائي للحيدات عالية CCR2 + لي-6C في النزفية احتشاء التحول 6. ومع ذلك، تحسنت المنهج التجريبي نفس الإعاقة الحادة بعد نزيف داخل المخ 9. وبالمثل، يعتقد أن مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T لممارسة إما ضارة 10 أو وقائية الإجراءات 11 في إصابات الدماغ الدماغية، ومع ذلك، البيانات controversiآل 12،13 ومذكرات مزيد من التحقيقات. ونظرا لهذا التعقيد المتزايد، يصبح من الواضح أن تعميق معرفة دور كل من الخلايا المناعية المتنوعة في الإصابة الدماغية وإصلاح أمر حاسم لترجمة النتائج التجريبية في العلاجات التي تستهدف التهاب آخر السكتة الدماغية.

اليوم، أقوى أداة لتحليل الاستجابات المناعية الخلوية متعدد الألوان التدفق الخلوي. وهو يتيح للتحديد وتقدير من مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية في موقع الالتهاب دون الحاجة إلى انحياز النظام في الجسم الحي العلامات أو التلاعب الجيني 14. تلطيخ وقت واحد من علامات سطح الخلية مع الأجسام المضادة ضد السيتوكينات داخل الخلايا 15 أو النسخ عوامل 16 بالإضافة إلى ذلك يوفر معلومات حول حالة الوظيفية الفردية خلايا، حدد ظاهريا. كما عيب رئيسي واحد، يطلب تعليق خلية واحدة لفحوصات تدفق cytometric، وبالتالي حصول على معلومات حول الموضعيتم فقدان alization من تتسرب الخلوية. ومع ذلك، في حين أن الأنسجة مثالية للحصول على معلومات المكانية، ويقتصر من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لوصف أنواع فرعية الخلايا المناعية في أنسجة معينة. اليوم، هناك حاجة إلى الجمع بين وجود وعدم وجود علامات سطح مختلفة لتحديد بشكل لا لبس فيه نادرة فرعية الخلايا المناعية، وخاصة متميزة السكان خلية الوحيدات المستمدة أثناء التهاب 17.

هنا، نحن تصف بروتوكول كفاءة لعزل أعداد كبيرة من الكريات البيض من مخ الفأر تال للإقفار باستخدام بسيط طبقة واحدة التدرج الكثافة. تعليق خلية تم الحصول عليها يمكن أن يكون إما عن طريق تحليل تدفق متعدد الأبعاد الخلوي أو مزيد من إثراء فرز تدفق cytometric أو اختيار immunomagnetic لإجراء تحليلات المصب محددة للغاية. تفاصيل طريقة نضح transcardial، وإزالة نصفي الدماغ، تفكك الأنسجة الدماغية في المعل خلية واحدةensions، والكثافة الطرد المركزي التدرج لإزالة النخاعين وكذلك تلوين الأجسام المضادة لتحليل تدفق cytometric.

Protocol

ويجب على جميع التجارب على الحيوانات تتفق مع المعايير وفقا لرعاية الحيوانات (على سبيل المثال، دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية الأميركية للصحة، المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، منقحة 1996)، ويجب أن تتم الموافقة عليها من قبل سلطة الدولة المناسبة.

1. إعداد الكواشف

  1. عازلة الهضم (1 مل ​​لكل نصف الكرة الأرضية): حل خليط موحد من الانزيمات الهاضمة تنقيته، على سبيل المثال، Liberase مع تركيز thermolysin منخفضة (TL) إلى تركيز 2U / مل في هانكس المتوازن محلول الملح (HBSS) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (المغنيسيوم)
  2. غسل العازلة مع الدناز: تذوب أنا الدناز إلى تركيز 666U / مل في HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة) التي تحتوي على 10٪ من مصل العجل الجنين (FCS)
  3. غسل عازلة دون الدناز: HBSS (كا / المغنيسيوم مجانا) تحتوي على 10٪ من FCS
  4. كثافة متوسطة الانحدار (5 مل لكل نصف الكرة الأرضية): إعداد الأوراق المالية متساوي التوتر التدرج الكثافة0؛ المتوسطة (SIP؛ 100٪) عن طريق خلط تسعة أجزاء من التدرج الكثافة المتوسطة مع جزء واحد 1.5 M كلوريد الصوديوم. تمييع SIP إلى كثافة 25٪ عن طريق إضافة كمية مناسبة من HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة) التي تحتوي على 3٪ من FCS
  5. التدفق الخلوي (FC) المخزن المؤقت: إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 3٪ من FCS

2. عابر الأوسط انسداد الشريان الدماغي

ملاحظة: عابر وسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO) عن طريق تقنية خياطة داخل اللمعة تم تنفيذ كما هو موضح سابقا 18 في 12 أسابيع من العمر من الذكور C57BL / 6 الفئران.

  1. باختصار، تخدير الفئران مع 2.0٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36.5 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية عن طريق جهاز التدفئة التحكم في ردود الفعل.
  2. بعد ربط الشريان السباتي المشترك والشريان السباتي الخارجي، وإدخال موحدة السليكون المطاط المغلفة حيدة في الشريان السباتي المشترك والتقدم إلى أصل ج الوسطىالشريان erebral.
  3. بعد 45 دقيقة إزالة خيوط للسماح ضخه. في الحيوانات الشام التي تديرها، الانسحاب فورا خيوط بعد تسد الشريان الدماغي الأوسط لتجنب نقص التروية.

3. Transcardial الإرواء والدماغ تشريح

  1. إعداد مضخة نضح تحوي من تخبط واحدة من نهاية الأنابيب في الجليد الباردة HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة). إصلاح حادة 23 G الإبرة إلى الطرف الآخر من أنبوب نضح والتبديل على مضخة لملء تماما أنابيب مع HBSS (كا / المغنيسيوم الحرة).
  2. تخدير عميق الفأر مع 4٪ الأيزوفلورين والموت ببطء بواسطة CO 2 الاستنشاق.
  3. وضع ظهريا الماوس على لوحة تشريح جزءا لا يتجزأ من علبة من البلاستيك. الصدارة انتشار والكفوف الخلفيتين على أوسع نطاق ممكن واصلاحها على لوحة تشريح مع 20 الإبر G.
  4. الاستيلاء على جلد البطن مع على التوالي 1 × 2 أسنان ملقط واستخدام مقص القزحية الحاد إلى إجراء شق الجانبي من خلال إهاب وجدار البطن وفضحكبد.
  5. رفع القص وشق الحجاب الحاجز مع شفرة حادة من مقص حاد قزحية / حادة. مواصلة قطع القفص الصدري الوحشي في كلا الجانبين في اتجاه وcaudocranial. احرص على عدم إصابة الرئة والقلب والشرايين الصدرية.
  6. رفع رفرف الجلد مع ملقط كليلة ويعلقون عليه على متن تشريح. استخدام ملقط كليلة نهاية ومقص لفصل بعناية القلب من النسيج الضام.
  7. عقد القلب مع ملقط كليلة نهاية وإدراج غيض من كليلة 23 إبرة G مع أنبوب نضح تعلق في قمة البطين الأيسر. ملاحظة: لا تدخل الإبرة بعيدا جدا في البطين الأيسر لتجنب إصابة الحاجز بين البطينين. إذا لزم الأمر، وتحديد قنية في مكان مع ملقط حادة على التوالي.
  8. شق الأذين الأيمن مع مقص القزحية الحاد وتتحول فورا على مضخة (معدل التدفق: 8 - 10 مل / دقيقة).
  9. تواصل نضح حتى يظهر الكبد لون القهوة الخفيفة (~ 30 مل من HBSS). طوالنضح، وتجنب بعناية أي تشكيل فقاعة الهواء في الأنبوب.
  10. قطع رأس الفأر مع المقص مباشرة الجراحية خلف الجمجمة. استخدام مقص القزحية إلى إجراء شق خط الوسط من فروة الرأس لفضح الجمجمة.
  11. ضع طرف واحد من مقص القزحية الحاد في الثقبة العظمى وقطع أفقيا في الجمجمة. كرر على الجانب الآخر.
  12. استخدام مقص القزحية حادة لقطع بعناية من نفس تجويف يصل خط الوسط نحو الأنف. محاولة للحفاظ على نهاية مقص سطحية قدر الإمكان لتجنب إصابة الدماغ.
  13. استخدام ملقط غرامة لقشر بلطف عظام الجمجمة من كل نصف الكرة المخ. ملاحظة: الأنسجة محتشية أن تنضم إلى السحايا أو الجمجمة. تأكد من عدم فقدان أنسجة المخ بسبب تشريح غافل
  14. رفع الدماغ مع ملعقة واستخدام مقص القزحية الحاد لتشريح بعناية الألياف العصبية الدماغية التي إصلاحه في الجمجمة. وضع الدماغ في أنبوب 15 مل مليئة 10 مل من HBSS (+ كا / المغنيسيوم) والحفاظ على قhortly على الجليد.

4. تفكك النسيج الدماغي في تعليق خلية واحدة

  1. إزالة بعناية جذع المخ والمخيخ بشفرة حلاقة نظيفة. استخدام شفرة حلاقة نظيفة لhemisect الدماغ وقطع كل نصف الكرة الأرضية على طول الطائرة الاكليلية إلى ثلاث قطع متساوية الحجم تقريبا.
  2. تشريح اللحم المفروم النسيج من كل نصف الكرة الأرضية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون باستخدام نهاية المكبس من حقنة 5 مل. باستمرار شطف مصفاة الخلية مع الجليد الباردة HBSS (+ كا / ملغ). تخزين عينات متجانسة على الجليد.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 286 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق، تجاهل بعناية طاف. resuspend الكرية في 1 مل من العازلة الهضم ونقل تعليق في أنبوب 2 مل. احتضان تعليق تحت دوران مستمر بطيء عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. تعليق خلية غربال خلال 70 ميكرومتر مصفاة الخلية وشطف جيدا مع 3 مل من غسل العازلة التي تحتوي على الدناز تليها 15 مل من غسل العازلة خالية الدناز. أجهزة الطرد المركزي في 286 x ج و 18 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. ملاحظة: ملاحظة: استخدام الدناز يزيل المخاط الحمض النووي الناجم عن تحلل الخلايا التي قد تؤدي إلى تراكم الخلايا المساس بقاء الخلية.

5. التدرج الكثافة الطرد المركزي لإزالة المايلين والحطام خلية

  1. بيليه الخلية resuspend في 5 مل من 25٪ متوسطة الكثافة التدرج وماصة للتعليق على أنبوب 15 مل. مزيج دقيق من قبل pipetting المتكررة ولطيف تجنب تشكيل فقاعة. ملاحظة: يجب استخدام التدرج الكثافة المتوسطة في RT لمنع تكتل الخلية.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 521 x ج و 18 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدام أدنى الشخصي التسارع من الدوار ويسمح الدوار لوقف دون فرامل. إزالة بلطف الأنابيب من أجهزة الطرد المركزي دون أن تهتز. نضح بعناية طبقة المايلين وطاف مع الحفاظ على الخلية بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. ملاحظة: تأكد من إزالة طبقة المايلين بأسره أي بقايا سوف impaiص تحليل تدفق cytometric.
  3. Resuspend وبيليه في 10 مل من غسل العازلة خالية الدناز وماصة للتعليق على أنبوب 15 مل الجديد. ملاحظة: هذه الخطوة غسل حاسمة منذ الاطاحة كافية من الكثافة التدرج المتوسطة يساهم إلى حد كبير في كمية ونوعية العينة خلية النهائية.
  4. مرة أخرى في 286 x ج و 10 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي تجاهل طاف. و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة غسل الباردة وتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء من خلال استبعاد التريبان الأزرق في عدادة الكريات. تخزين العينات في 4 درجات مئوية، وعملية أخرى منها بسرعة.

6. تلوين الأجسام المضادة لتحليل تدفق Cytometric

  1. قبل وضع العلامات الأجسام المضادة، واحتضان تعليق الخلية في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع CD16 مكافحة الفئران / CD32 FC-مستقبلات حجب كاشف (تركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل، وتخفيف عامل 1: 200) لمنع ملزم غير محددة.
  2. إضافة الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق في لتركيز ppropriate (كما هو مبين في الجدول رقم 1) إلى تعليق خلية واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. ملاحظة: لا يتم ملطخة عينات مراقبة مع الأجسام المضادة الأولية، ولكن تعامل إلا نفسه.
  3. غسل الخلايا مع 2 مل من العازلة FC وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج و 10 درجة مئوية لمدة 7 min.Carefully نضح طاف و resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة FC. تخزين المواد مؤقتا في 4 درجات مئوية في الظلام حتى تحليل تدفق cytometric.

7. الكمي المطلق من الخرز عد

  1. باتجاهين معاكسين ماصة 40 ميكرولتر من العازلة FC و 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب العد تحتوي على العدد المعروف من الخرز الفلورسنت. ملاحظة: انتبه أن الماصات يتم معايرة لتقديم بالضبط 10 ميكرولتر من العينة كما يشير حساب لاحق من التهم الكريات البيض إلى هذا المجلد.
  2. احتضان تعليق الخلية مع FITC المسمى CD45 الأجسام المضادة (تركيز النهائيمن 5 ميكروغرام / مل، وتخفيف عامل 1: 100) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  3. باتجاهين معاكسين ملء أنبوب العد مع 200 ميكرولتر من العازلة FC دون أي خطوة الغسيل وتسجيل مباشرة CD45 + الخلايا في قياس التدفق الخلوي.

8. تدفق Cytometric اكتساب

ملاحظة: لتحليل لوحة الأجسام المضادة المقترحة، لابد من تجهيز الكريات المناسب مع الأزرق (488 نانومتر) والأحمر (635 نانومتر)، والبنفسجي (405 نانومتر) الليزر والمرشحات لFITC، PE، PerCP Cy5.5، PECy7، APC-Cy7 وAmCyan.

  1. ضبط الأمام (FSC) وsideward (SSC) مبعثر باستخدام خلايا غير ملوثين من نصف الكرة الدماغية. تميز الحلل من الخلايا وحيدة في مؤامرة نقطة تظهر المنطقة وارتفاع FSC.
  2. عرض جميع الخلايا وحيدة في رسوم بيانية-معلمة واحدة لكل قناة مضان المستخدمة وضبط أنبوب مضخم (PMT) الفولتية بحيث يتم عرض الخلايا واحد في أقصى اليسار من الرسم البياني.
  3. استخدام CD45-FITC احدعينة الملون للتحقق مبعثر وPMT إعدادات خلايا الفائدة بمقدار backgating CD45 الخلايا المناعية عالية في كل الرسم البياني والتشرذم مؤامرة. ملاحظة: تكييف الفولتية PMT من FITC بحيث CD45 السلبي، وسيطة (الباحث) والخلايا معربا عالية يمكن أن تكون متمايزة عن بعضها البعض.
  4. استخدام الأجسام المضادة القبض على حبات تعويض لأداء تعويضات متعددة الألوان. تعيين بوابات للالخلايا الدبقية الصغيرة (CD45 كثافة العمليات) والكريات البيض (CD45 عالية)، وبعد ذلك تحديد الفئات السكانية الكريات البيض وفقا لاستراتيجية النابضة المعروضة في الشكل 1.

Representative Results

وبدأ نقص التروية الدماغية في 12 أسابيع من العمر من الذكور C57BL / 6 الفئران عن طريق انسداد خيوط عابرة من الشريان الدماغي الأوسط الأيسر (MCAO). لعملية صورية تم إدراج خيوط لانسداد الشريان الدماغي الأوسط اليسار وسحب على الفور للسماح ضخه لحظة. الأهم من ذلك، neuroinflammation الخلوية يختلف بشكل كبير بين نماذج السكتة الدماغية تطبق عادة 19. هذا يجب أن يوضع في الاعتبار خاصة عند استقراء النتائج من الدراسات على الحيوانات إلى الفيزيولوجيا المرضية غير متجانسة من السكتة الدماغية الإنسان.

تم التضحية الفئران 24 ساعة بعد MCAO لتحليل أوائل غزو الخلايا المناعية إلى الدماغ الدماغية. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من نصف الكرة الدماغية (MCAO IPSI، 0.95 ± 0.25 س 10E6) بعد ان التدرج الكثافة الطرد المركزي مماثلة لتلك التي من نصف الكرة الأرضية المقابل (MCAO كونترا، 1.09 ± 0.30 س 10E6) والمماثلنصف الكرة الأرضية من الفئران الشام التي تديرها (IPSI صورية، 1.12 ± 0.18 س 10E6، في اتجاه واحد أنوفا، ع = 0.524). وكان بقاء الخلايا المعزولة تقاس الأزرق الاستبعاد التريبان عالية ولم تختلف اختلافا كبيرا بين المجموعات (صورية 96.85 ± 0.60٪، MCAO كونترا 97.12 ± 1.18٪، MCAO IPSI 95.68 ± 2.04٪، في اتجاه واحد أنوفا، ع = 0.253 ).

تكوين الدماغ التسلل 24 ساعة بعد أن تقرر MCAO عن طريق تحليل تدفق cytometric الشكل 1 يوضح استراتيجية النابضة تخطيطي (A) وحيوان السكتة الدماغية التمثيلي (B). وقد تم تحديد الكريات البيض-اختراق الدماغ خلايا عالية CD45 التي يمكن أن تكون متباينة من الخلايا الدبقية الصغيرة CD45 كثافة العمليات. داخل السكاني المرتفع CD45، تم تحديد العدلات النوى (السوداء) من خلال التعبير لي-6G، في حين يرسم اللمفاويات التائية كما CD45 CD3 عالية + الخلايا. ثم تم تمييز الخلايا عالية CD45 المتبقيةإد بواسطة CD19 (الخلايا الليمفاوية B) والتعبير CD11b. وقد subcategorized جزء CD11b + الى مزيد من لي-6C عالية `monocytes` التهابات ولي-6C السكان المنخفض التي تشمل حيدات، والخلايا الجذعية (DC) والضامة.

في المرحلة الحادة من السكتة الدماغية، والخلايا المناعية الدم النخاعي تهيمن التسلل الدماغ 3،20. العدلات تدخل الدماغ بسرعة بعد انسداد الأوعية وتعزز تسرب من وحيدات التهابات 21. يعرض الشكل 2A نسبة الزيادة من Ly6-G + العدلات في نصف الكرة الدماغية 24 ساعة بعد MCAO مقارنة المقابل نصف الكرة الأرضية وصورية جراحة. على النقيض من ذلك، فإن نسبة من الخلايا CD3 + T في نصف الكرة الدماغية هي (نسبيا) أقل مما كانت عليه في الدماغ السليم. بين السكان CD11b +، نقص تروية الدماغ يحول التوازن نحو رجحان قوية من لي-6C حيدات التهابات عالية (الشكل2B).

بالإضافة إلى التوزيعات النسبية، تم استخدام أنابيب عد لتحديد الأعداد المطلقة للمجموعات فرعية الخلايا المناعية في العينات على أساس CD45 الأحداث الإيجابية (الشكل 3). أنابيب عد تحتوي على بيليه مجفف بالتجميد التي تصدر العدد المعروف من الخرز الفلورسنت. يمكن تحديد العدد المطلق للخلايا إيجابية في العينة عن طريق ربط الأحداث الخلوية إلى حبة الأحداث. لحساب عدد الكريات البيض عالية CD45 في نصف الكرة كانت تستخدم المعادلة التالية: CD45 الخلايا عالية في نصف الكرة الأرضية = (CD45 الأحداث عالية س الكلي الخرز العد / أحداث عينة حبة) س (الحجم الكلي تعليق (100 ميكرولتر) / حجم العينة (10 ميكرولتر )). 24 ساعة بعد MCAO، وقد زاد العدد الكلى الكريات البيض في نصف الكرة احتشاء بشكل ملحوظ بالمقارنة مع المقابل نصف الكرة الأرضية وصورية جراحة (الشكل 3D، في اتجاه واحد أنوفا، ع = 0.0004). التهم الواردة في دي stinct فرعية الخلايا المناعية (السوداء، خلايا تي، الخلايا البائية، لي-6C عالية ولي-6C حيدات منخفضة) يمكن حسابها بسهولة عن طريق ضرب التردد النسبي مع مجموع CD45 عدد الكريات البيض عالية من عينة منها.

الشكل 1
الشكل 1. استراتيجية المحاصرة لالتدفق الخلوي. (A) توضيح تخطيطي لاستراتيجية المحاصرة. (ب) ويظهر تحليل تدفق cytometric من الكريات البيض معزولة عن تمثيلية مخ الفأر 24 ساعة بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط. FSC مبعثر إلى الأمام، PMN العدلات النوى، منها الخلايا الجذعية الكلاسيكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
الشكل 2. تمايز مجموعات فرعية الخلايا المناعية. التوزيع النسبي للي-6G + -neutrophils (A)، وخلايا CD3 + T (A) ومجموعات فرعية الوحيدات التي حددها التعبير التفاضلية من لي-6C (ب) في المماثل (IPSI) والجانب المقابل ( كونترا) نصف الكرة الأرضية 24 ساعة بعد انسداد المتوسطة الدماغية الشريان (MCAO) أو عملية جراحية صورية منها. يشار إلى نسبة مئوية من كل السكان في البوابة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الكمي من الدماغ الكريات البيضاء التي عد الخرز. (A) يدل على بوابة حبة نقرا مزدوجا إيجابية للغاية. بين السكان خلية واحدة (ب) الخلايا الدبقية الصغيرة CD45 كثافة العمليات يمكن أن تكون متباينة من كريات الدم البيضاء عالية CD45 (C). لالكمي، وكان عدد من الأحداث عالية CD45 بوابات طبيعية للأحداث حبة فرزها. لاحظ أن الكريات البيض الإجمالية هي زيادة (CD45 عالية) التهم بشكل ملحوظ في (IPSI) نصف الكرة المماثل مقارنة المقابل (كونترا) نصف الكرة الأرضية وصورية جراحة 24 ساعة بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO). ** ف <0.01 ***، ف <0.001 من قبل في اتجاه واحد أنوفا وTukey`s اللاحق متعددة مقارنات اختبار. ن = 4-6 في المجموعة. FSC مبعثر إلى الأمام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تألقي FITC PE PerCP PC7 V500
(Cy5.5)
مولد المضاد CD45.2 CD3 لي-6G CD19 لي-6C CD11b
التركيز النهائي [ميكروغرام / مل] 5 1 0.2 0.2 1 1
عامل التخفيف 1/100 1/200 1/1000 1/1000 1/200 1/200
استنساخ 104 145-2C11 1A8 6D5 AL-21 M1 / 70

كوكتيل الجدول 1. الأساسية الأجسام المضادة للالمناعي تحديد الخلايا في الدماغ الدماغية.

Discussion

هنا، نحن تصف طريقة بسيطة وفعالة لعزل الكريات البيضاء من الدماغ الفئران بعد السكتة الدماغية التجريبية. النهج غلة موثوق عدد الخلايا استنساخه للغاية في نصف الكرة المخ مما يسمح لقياس تدفق وحات مختلفة في تكرار البيولوجي واحدة.

على ما يبدو، وعلى إزالة غير كاملة من الدم بما في ذلك الخلايا المناعية تؤدي إلى النظرة المشوهة على المبلغ الفعلي من الخلايا الالتهابية التي دخلت الدماغ الدماغية. وهكذا، عند استخدام هذا البروتوكول إيلاء اهتمام خاص لنضح transcardial شامل لمنع التلوث من الخلايا المناعية تسلل مع الكريات البيض غير التهابية المتداولة. من الخبرة، واستخدام الإبر حادة لالأيسر ثقب البطين يقلل من خطر إصابة الحاجز بين البطينين التي من شأنها تجاوز نضح من الدورة الدموية. ظهور السائل نضح من فتحتي الأنف هو علامة على أن نضح pressureis مرتفعة للغاية، وبالتالي، لمعدلات تدفق باطلة> 10 مل / دقيقة. شاحب للون الأبيض من أنسجة المخ يشير نضح جيد في حين ردي اللون هو علامة ضعف التروية.

خطوة أخرى حاسمة من هذا البروتوكول هو التفكك الفعال للأنسجة المخ والتي تضم تجزئة الميكانيكية وكذلك الهضم الأنزيمي. تنميق الأنسجة من خلال مصفاة الخلية أمر بالغ الأهمية لتوفير وتحسين فعالية البروتياز. ومع ذلك، عندما المجانسة الأنسجة، وتجنب الضغط المفرط كما البالعات وحيدات النوى هي عرضة للانحلال ذاتي 22. لعملية الهضم الأنزيمي Liberase TL ينصح التي هي مزيج من نظافة كولاجيناز الأول والثاني يحتوي على تركيزات منخفضة من thermolysin البروتيني محايدة. المقارنة المباشرة مع بروتوكولات العزلة التي سبق وصفها 14،22،23 كشف الانتعاش أعلى بكثير من خلايا قابلة للحياة عن طريق العلاج Liberase TL (KM بيانات غير منشورة). مقارنة كولاجيناز وهي كثيرا ما تستخدمد لعزل الخلايا المناعية من الدماغ، Liberase TL يحتوي على مستويات ضئيلة من الذيفان الداخلي. ولهذا الأمر أهمية خاصة إذا كان يتم فرز الخلايا لتحليل المصب لمستويات عالية من الذيفان الداخلي قد تغيير حالة تنشيط الخلايا المناعية 24 وبشدة يضعف زراعة الخلايا نتائجها 25. عيب آخر من كولاجيناز التقليدية غير هامة الاختلافات الكثير إلى الكثير في أنشطة الانزيم الذي يعرض للخطر استنساخ نتائج ويتطلب تحديد تركيز العمل لكل دفعة 26.

في الدماغ الكبار، وإزالة المايلين بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج خطوة لا غنى عنها لتطبيقات المصب مثل التدفق الخلوي أو إجراء المزيد من الدراسات على الجين أو البروتين التعبير. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هو الإجراء كثافة طبقة واحدة والتي لا تتطلب وقتا طويلا إعداد التدرجات. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول الفصل تنتج نتيجة موثوقةق حتى عندما يقوم بها المجربون عديم الخبرة إلى حد ما. وهي خالية من التدرجات الطبقات ذات الكثافة قريبة من بعضها البعض التي يصعب ماصة دون إزعاج واجهة بينهما.

واستنادا إلى التعبير عن سطح علامة CD45، بروتوكول غلة ثلاث فئات رئيسية خلية في الدماغ الدماغية. الغالبية العظمى من خلايا تنتمي إلى CD45 السكان السلبية التي تتكون من الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا، البطانة العصبية والخلايا البطانية. ويعزى السبب في وجود وفرة في التدرج كثافة طبقة واحدة والتي تهدف في المقام الأول إلى المايلين كفاءة وإزالة الأنقاض. بالإضافة إلى ذلك، يبلغ عدد سكانها CD45 كثافة العمليات تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة 27 يمكن أن تكون متباينة من السكان CD45 العالية التي يحتوي أساسا التسلل الكريات البيض دموية المنشأ. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة قد تعتمد النمط الظاهري ووظيفة خلايا الدم النخاعي المولد الدم. وهكذا، المحنك فقط تطبيقتقنيات د مثل تعايش التصاقي 28، ونخاع العظام الوهم 29 أو تحليل الخرائط مصير 30 يسمح للتمييز واضح بين هؤلاء السكان اثنين أثناء الالتهاب.

تحليل البيانات في التدفق الخلوي غالبا ما يقتصر على التوزيع النسبي للسكان خلية معينة. ومع ذلك، عند مقارنة احتشاء نصف الكرة إلى أنسجة المخ غير محتشية هذه المعلومات يمكن أن تكون مضللة لأنها لا تعتبر العدد الكلى الكريات البيض الدماغ التي يتم تغييرها من قبل الإصابة الدماغية. وهكذا، لرسم صورة كاملة عن حجم والنمط الظاهري للتتسرب التهابات بعد ويجب أن يستكمل توزيع السكتة الدماغية النسبي للمجموعات فرعية الخلايا المناعية التي كتبها أعداد الخلايا المطلقة. عند استخدام ميكروبيدات كما هو موضح في هذا البروتوكول، pipetting لمن حجم عينة دقيق إلزامي على الاطلاق للحصول على نتائج موثوقة. وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن pipetting لعكس بقوة لتجنب تشكيل رغوة في أنبوب العد. الناشئة فقاعات الهواءسوف يقلل من الحجم المتوقع من ميكروبيدات، وبالتالي يؤدي إلى المبالغة في تقدير المطلقة CD45 التهم ارتفاع الكريات البيض في العينة.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول نهج سهلة وموثوقة لعزل الخلايا المناعية من الدماغ. قد يكون بمثابة أداة قيمة لتشريح تعقيد الاستجابة الالتهابية للسكتة الدماغية. وتشمل التطبيقات المستقبلية التحقيقات حول دور تعتمد على الوقت من مجموعات فرعية الوحيدات في نشر وقرار من التهاب الدماغ الدماغية. وبالمثل، فإن مفهومة دور الجهاز المناعي التكيفي بعد السكتة الدماغية. تحليل تدفق cytometric من القطعان الخلايا التائية التي حددها تعبير عن عوامل النسخ-فرعية معينة أو السيتوكينات في الموقع قد تساعد على توضيح تأثيرها على التعافي على المدى الطويل بعد السكتة الدماغية وآفاقا واعدة وبالتالي مفتوحة لتطوير أساليب علاجية جديدة.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

الكتاب أشكر إيزابيل شولتز حصول على الدعم الفني الممتاز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel World precision instruments PERIPRO-4LS
Heracell 240i CO2 incubator  Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+ Thermo Scientific
FACS Canto II Becton Dickinson
Isoflurane Abbott 4831850
Hank's buffered salt solution (HBSS) Gibco/Life Technologies GmbH 14175-129
HBSS with Calcium/Magnesium Gibco/Life Technologies GmbH 24020-091
Liberase TL Roche Diagnostics GmbH 5401020001
Percoll Plus GE Healthcare Europe GmbH 17-5445-01
Fetal bovine serum  PAN Biotech 3302-P101003
Trypan blue Gibco/Life Technologies GmbH 15250-061
Trucount BD Biosciences 340334
Phosphate buffered saline Biochrom AG L 182-10
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 11284932001
CD11b Horizon V500 BD Biosciences 562128
CD16/CD32 eBioscience 14-0161
CD45.2 FITC eBioscience 11-0454
CD3 PE Biolegend 100307
CD19 PE-Cy7 Biolegend 115519
Ly6C APC-Cy7 BD Biosciences 560596
Ly6G PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560602
Silicone Tubing, 1 m World precision instruments 503022
Fine Iris Scissors sharp Fine Science Tools 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools 14130-17
Fine Iris Scissors sharp/blunt Fine Science Tools 14028-10
Straight 1 x 2 teeth forceps Fine Science Tools 11021-14
Blunt-end Forceps Fine Science Tools 11008-13
5ml syringe plunger Carl Roth GmbH (Braun) EP96.1
Cell strainer, 100 µm Dr. I. Schubert, BD 2360-00
Omnican Fine dosage syringe 1 ml Braun TBD
Cell strainer, 70 µm Greiner Bio-One GmbH 542 070
FACS Tubes BD Bioscience GmbH 352052
serological pipettes, 10 ml Greiner Bio-One GmbH 607180
serological pipettes, 10 ml Sarstedt AG&Co 861,254,025
serological pipettes, 25 ml Greiner Bio-One GmbH 760180
serological pipettes, 5 ml Greiner Bio-One GmbH 606180
serological pipettes, 25 ml Sarstedt AG&Co 861,685,020
serological pipettes,5 ml Sarstedt AG&Co 861,253,025
Tips, 0.1 - 10 µl Corning B.V.Life Sciences 4840
Tips, 100 - 1,000 µl Greiner Bio-One GmbH 740290
Tips, 10 - 200 µl Greiner Bio-One GmbH 739296
Reaction tubes 1.5 ml Greiner Bio-One GmbH 616201
Reaction tubes 2 ml Greiner Bio-One GmbH 623201
Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm Greiner Bio-One GmbH 633180
Falcon 15 ml Greiner Bio-One GmbH 188271
Falcon 50 ml VWR International GmbH (BD) 734-0448
Neubauer hemocytometer Biochrom AG PDHC-N01
razor blade Carl Roth GmbH CK07.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
  2. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
  3. Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
  4. Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
  5. Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
  6. Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
  7. Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
  8. Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
  9. Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
  10. Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
  11. Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
  12. Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
  13. Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
  14. Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
  15. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
  16. Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
  17. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  18. Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
  19. Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
  20. Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
  21. Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
  22. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  23. Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
  24. Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
  25. Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
  26. McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
  27. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
  28. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  29. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  30. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 108، السكتة الدماغية، التهاب الدماغ، وإصلاح، والعزلة الخلية، والتدفق الخلوي، وتحديد وتوصيف، phenotyping الخلية، الخلايا المناعية، الكريات البيض
العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pösel, C., Möller, K.,… More

Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (108), e53658, doi:10.3791/53658 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter