Abstract
Hjerneinfarkt initierer en robust betennelsesreaksjon som starter i intrarommet og innebærer rask aktivering av hjernen bosatt celler. En viktig mekanisme i denne inflammatoriske respons er migrering av sirkulerende immunceller til den iskemiske hjerne lettes ved kjemokinet frigivelse og økt endotel-adhesjonsmolekyl uttrykk. Brain-invaderende leukocytter er velkjent bidra til tidlig stadium sekundær iskemisk skade, men deres betydning for terminering av betennelse og senere hjernen reparasjon har nylig blitt lagt merke til.
Her blir en enkel protokoll for effektiv isolering av immunceller fra mus iskemiske hjerne tilgjengelig. Etter transcardial perfusjon, er hjernehalvdelene dissekert og mekanisk dissosiert. Enzymatisk spaltning med Liberase er etterfulgt av tetthets-gradient (som Percoll) sentrifugering for å fjerne myelin og celleavfall. En stor fordel med denne protokollen is single-layer tetthetsgradient fremgangsmåte som ikke krever tidkrevende fremstilling av gradienter, og kan bli pålitelig gjennomført. Tilnærmingen gir svært reproduserbare celler per hjernen halvkule og åpner for å måle flere flowcytometri paneler i en biologisk replikere. Fenotypisk karakterisering og kvantifisering av hjerne-invaderende leukocytter etter eksperimentell hjerneslag kan bidra til en bedre forståelse for deres mangefasetterte roller i iskemisk skade og reparasjon.
Introduction
Cerebral slag utløser en vedvarende inflammatorisk reaksjon som starter raskt etter opphør av den lokale blodstrøm og omfatter praktisk talt alle deler av immunsystemet. Et viktig kjennetegn på denne betennelsesreaksjon er en tidsbestemt tilførsel av immunceller i hjernen som er drevet ved aktivering av hjerne endotelceller, betydelig kjemokin-sekresjon og økt sympatisk utstrømning 1-3. Inflammatorisk celleinfiltrasjon ble tidligere ansett som skadelig i iskemisk slag, men flere behandlingsforsøk utviklet for å blokkere ukritisk leukocytt utgang til hjernen ikke klarte å indusere en målbar klinisk nytte 4. Flere nylig, ble det klart at moncyttavledede celler opprinnelig involvert i utviklingen av iskemisk skade 5 kan også spille en sentral rolle for oppløsning av betennelse og påfølgende vev reparasjon seks.
Takk til identifisering av fenotypiske og funksjonelleonal heterogenitet blant monocytter og makrofager, har kunnskap om betydningen av mononukleære fagocytter i utvikling og oppløsning av betennelse betydelig utvidet. I mus, kan sirkulerende monocytter klassifiseres i minst to funksjonelt distinkte undergrupper i henhold til deres overflate ekspresjon av lymfocytt antigen 6-kompleks (Ly-6C) 7. Mens Ly-6C høye'inflammatory monocytes' ble tydelig vist å være avgjørende for kontroll av bakterieinfeksjoner 8, deres rolle i sterile skade er mer kontroversielt. I iskemisk hjerneslag, selektiv ablasjon av CCR2 + Ly-6C høye monocytter resulterte i hemoragisk infarkt transformasjon 6. Men den samme eksperimentell tilnærming forbedret akutt uførhet etter intracerebral blødning 9. Likeledes er forskjellige undersett av T-celler antas å utøve enten skadelige 10 eller beskyttende virkninger 11 på iskemisk hjerneskade, er imidlertid data controversial 12,13 og warrants videre undersøkelser. Gitt denne økende kompleksitet, blir det klart at dypere kunnskap om rollene til de ulike immunceller i iskemisk skade og reparasjon er avgjørende for å oversette eksperimentelle funn i terapi rettet mot innlegget hjerneslag betennelse.
I dag, den mest kraftfulle verktøy for å analysere cellulære immunresponser er polykromatisk flowcytometri. Det tillater identifisering og kvantifisering av forskjellige immuncelleundergrupper på inflammasjonsstedet uten behov for å forspenne system ved in vivo merking eller genetisk manipulasjon 14. Samtidig farging av celleoverflatemarkører med antistoffer mot intracellulære cytokiner 15 eller transkripsjonsfaktorene 16 gir i tillegg informasjon om funksjonell tilstand av individuelle, fenotypisk identifisert celler. Som en stor ulempe, er enkeltcellesuspensjoner kreves for strømningscytometriske analyser og dermed informasjon om localization av cellulære infiltrater er tapt. Imidlertid, mens histologi gjør det enkelt å få romlig informasjon, blir det begrenset av antallet av antistoffer som kan anvendes ved en eneste gang for å karakterisere immuncelleundertyper i et bestemt vev. Dag, er en kombinasjon av nærvær og fravær av forskjellige overflatemarkører for å entydig identifisere sjeldne immuncelleundergrupper, spesielt de distinkte monocytt-avledede cellepopulasjoner i løpet av betennelse 17.
Her beskriver vi en effektiv protokoll for å isolere høyt antall leukocytter fra postischemic musehjerne ved hjelp av en enkel ett-lags tetthetsgradient. De oppnådde cellesuspensjoner kan enten analysert ved multi-dimensjonal flowcytometri eller ytterligere anrikes ved strømningscytometrisk sortering eller immunomagnetisk valg for å utføre svært spesifikke nedstrøms analyser. Metoden detaljer transcardial perfusjon, fjerning av hjernehalvdelene, dissosiasjon av hjernevev i én celle suspensions, tetthetsgradient-sentrifugering for fjerning myelin så vel som antistoff-farging for flowcytometrisk analyse.
Protocol
Alle dyreforsøk må samsvare i henhold standarder for dyr omsorg (f.eks., Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr publisert av det amerikanske National Institutes of Health, NIH publikasjon nr 85-23, revidert 1996) og må godkjennes av vedkommende statlig myndighet.
1. Utarbeidelse av reagenser
- Fordøyelse buffer (1 ml per halvkule): Oppløs en standardisert blanding av rensede fordøyelsesenzymer, f.eks Liberase med lav termolysin konsentrasjon (TL) til en konsentrasjon på 2U / ml i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) inneholdende kalsium (Ca) og magnesium (Mg)
- Vaskebuffer med DNAse: Oppløs DNAse I til en konsentrasjon på 666U / ml i HBSS (Ca / Mg fri) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS)
- Vaske buffer uten DNAse: HBSS (Ca / Mg gratis) inneholder 10% FCS
- Tettshetsgradient medium (5 ml per halvkule): forberede lager isotonisk tettshetsgradient0; medium (SIP; 100%) ved blanding av ni deler av tetthetsgradient medium med en del 1,5 M natriumklorid. Spe SIP til 25% tetthet ved å legge til et passende volum av HBSS (Ca / Mg gratis) inneholder 3% av FCS
- Strømningscytometri (FC) buffer: Fremstill fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 3% av FCS
2. Transient Middle Cerebral arterien okklusjon
MERK: Transient tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) via intraluminal sutur teknikken ble utført som beskrevet tidligere i 18 12-uker gamle hann C57BL / 6 mus.
- I korthet, bedøve mus med 2,0% isofluran i 100% oksygen. At kroppstemperaturen på 36,5 ° C ± 0,5 ° C ved en feedback-kontrollert oppvarming enhet.
- Etter ligering av arteria carotis communis og den ytre halsarterie, innføre en standardisert silikongummi belagt monofilament i arteria carotis communis og forhånd det til opprinnelsen av den midtre cerebral arterie.
- Etter 45 minutter fjernes filamentet for å tillate reperfusjon. I skinn-opererte dyr, straks trekke filamentet etter okkludering av den midtre cerebrale arterie for å unngå iskemi.
3. Transcardial Perfusjons og Brain Dissection
- Forbered en peristaltisk perfusjon pumpe ved å dyppe den ene enden av slangen inn i iskald HBSS (Ca / Mg gratis). Fastsette en stump 23 G-nål til den andre enden av perfusjon røret og slår på pumpen for å fylle røret med HBSS (Ca / Mg-fri).
- Dypt bedøve mus med 4% isofluran og avlive ved CO 2 innånding.
- Plasser musen dorsally på en disseksjon bord innebygd i en plastbrett. Spre forgrunnen og bakpotene så bredt som mulig og fikse dem på disseksjon bord med 20 G kanyler.
- Grab abdominal hud med en rett 1 x 2 tenner pinsett og bruk skarpe iris saks for å lage en lateral snitt gjennom integument og bukveggen og utsettlever.
- Løft sternum og innsnittet membranen med den butte blad av skarpe / butt iris saks. Fortsett å kutte den laterale brystkassen på begge sider i caudocranial retning. Vær forsiktig så du ikke skader lungene, hjertet og thorax arterier.
- Løft huden klaff med en butt pinsett og pin den på disseksjon bord. Bruk butt-end pinsett og saks til å nøye skille hjertet av bindevev.
- Hold hjerte med en butt-ende tang og sette inn spissen av stump 23 G-nål med den vedlagte perfusjon røret inn i toppen av den venstre ventrikkel. Merk: Ikke sett inn nålen for langt inn i venstre hjertekammer for å unngå skade på interventricular septum. Om nødvendig, fikse kanylen på plass med en rett skarpe tang.
- Innsnittet i høyre forkammer med skarpe iris saks og umiddelbart slå på pumpen (strømningshastighet: 8 - 10 ml / min).
- Fortsett perfusjon til leveren viser en lys kaffe farge (~ 30 ml HBSS). Gjennomperfusjon, omhyggelig unngå luftbobledannelse i røret.
- Halshogge musen med rette kirurgisk saks rett bak skallen. Bruk iris saks til å lage en midtlinjen snitt i hodebunnen for å avsløre skallen.
- Sett en spiss av skarpe iris saks inn i foramen magnum og kutte sideveis inn i skallen. Gjenta for den andre siden.
- Bruk skarpe iris saks til å nøye kuttet fra samme hulrom opp midtlinjen mot nesen. Prøv å holde slutten av saksen så overfladiske som mulig for å unngå skade av hjernen.
- Bruk fine tang til å forsiktig skrelle kraniale bein fra hver hjerne halvkule. Merk: infarcted vev kan forholde seg til hjernehinnene eller skallen; sørg for ikke å miste hjernevevet på grunn av uforsiktig disseksjon
- Løft hjernen med en slikkepott og bruk skarpe iris saks til å nøye dissekere hjernenervefibre som fester den til skallen. Plasser hjernen til et 15 ml rør fylt med 10 ml HBSS (+ Ca / Mg) og holde det shortly på is.
4. Dissosiasjon av hjernevev i en enkelt cellesuspensjon
- Fjern forsiktig hjernestammen og lillehjernen med et rent barberblad. Bruk en ren barberblad for å hemisect hjernen og kutt hver halvkule langs coronal plan i tre biter av omtrent lik størrelse.
- Hakke dissekert vev av hver halvkule gjennom en 100 um celle sil ved hjelp av stempelet enden av en 5 ml sprøyte. Kontinuerlig skylle celle sil med iskald HBSS (+ Ca / Mg). Oppbevar homogenis prøvene på is.
- Sentrifuger ved 286 xg og 4 ° C i 5 minutter, forsiktig kast supernatanten. Resuspender pelleten i 1 ml buffer fordøyelse og overfører suspensjonen til en 2 ml rør. Inkuber suspensjon under langsom kontinuerlig rotasjon ved 37 ° C i 1 time.
- Sil cellesuspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil og skyll godt med 3 ml vaskebuffer inneholdende DNAse, etterfulgt av 15 ml DNAse-fri vaskebuffer. Sentrifuger ved 286 xg og 18 ° C i 5 minutter og kast supernatanten. Merk: Merk: Bruken av DNAse eliminerer DNA slim forårsaket av cellelyse som kan føre til celle aggregering kompromittere celle overlevelse.
5. Densitetsgradientsentrifugering for fjerning av myelin og celleavfall
- Resuspender cellepelleten i 5 ml 25% densitetsgradient medium og pipettere suspensjonen i et 15 ml rør. Bland grundig ved gjentatt og forsiktig pipettering unngå bobledannelse. Merk: densitetsgradient medium bør brukes ved RT for å forhindre celle klumper.
- Sentrifuger ved 521 xg og 18 ° C i 20 min. Bruk laveste akselerasjonsprofil av rotoren og tillate rotoren å stoppe uten brems. Fjern forsiktig rørene fra sentrifugen uten risting. suge myelin pelsen og supernatanten forsiktig samtidig bevare cellepelleten på bunnen av røret. Merk: Sørg for å fjerne hele myelin strøk som noen left vil impair flowcytometrisk analyse.
- Resuspender pelleten i 10 ml DNAse fri vaskebuffer og pipettere suspensjonen til et nytt 15 ml tube. Merk: Dette vasketrinn er avgjørende ettersom tilstrekkelig fjerning av tettshetsgradient medium bidrar betydelig til mengden og kvaliteten på det endelige celleprøve.
- Sentrifuger på nytt ved 286 xg og 10 ° C i 5 minutter og kast supernatanten. Resuspender celler i 100 ul kald vaskebuffer og bestemme celletall og levedyktighet ved trypan blå eksklusjon i et hemocytometer. Oppbevar prøver ved 4 ° C og videre prosessen dem raskt.
6. Antistoff Farging for flowcytometrisk analyse
- Før antistoff merking, inkubere cellesuspensjonen ved 4 ° C i 10 minutter med anti-murine CD16 / CD32 FC-reseptor-blokkerende reagens (endelig konsentrasjon på 2,5 ug / ml, fortynning faktor 1: 200) for å forhindre uspesifikk binding.
- Legg fluoroforen-konjugert primære antistoffer ved enppropriate konsentrasjon (som angitt i tabell 1) til cellesuspensjonen og inkuberes ved 4 ° C i 20 min i mørket. Merk: Kontrollprøver ikke er farget med primære antistoffer, men ellers behandles på samme måte.
- Vask cellene med 2 ml FC-buffer og sentrifuger ved 350 xg og 10 ° C i 7 min.Carefully Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 ul av FC-buffer. Oppbevar prøver midlertidig ved 4 ° C i mørke før flowcytometrisk analyse.
7. Absolutt Kvantifisering av Telle Perler
- Omvendt pipette 40 ul av FC-buffer og 10 ul av cellesuspensjonen inn i en telle rør inneholdende et kjent antall fluorescerende kuler. Merk: Vær oppmerksom på at pipetter er kalibrert for å levere nøyaktig 10 ul prøve som etterfølgende beregning av leukocyttverdiene refererer til dette volumet.
- Inkuber cellesuspensjon med FITC-merket CD45-antistoff (endelig konsentrasjonav 5 ug / ml, fortynning faktor 1: 100) ved 4 ° C i 20 min i mørket.
- Omvendt fylle telle rør med 200 ul av FC-buffer uten vasketrinnet og direkte opp CD45 + -celler i flowcytometer.
8. Flowcytometriske Acquisition
Merk: For å analysere den foreslåtte antistoff panel, riktig cytometeret har til å være utstyrt med en blå (488 nm), rød (635 nm) og fiolett (405 nm) laser og filtre for FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 og AmCyan.
- Juster fremover (FSC) og sideveis (SSC) scatter ved hjelp ufargede celler fra en iskemisk halvkule. Diskriminere dubletter fra enkeltceller i et prikkplott som viser området og høyde på FSC.
- Vis alle enkeltceller i enkelt parameterhistogrammer for hver fluorescens kanal som brukes og juster fotomultiplikatorrøret (PMT) spenninger slik at enkeltceller vises helt til venstre i histogrammet.
- Bruk en CD45-FITC singelfarget prøve å sjekke scatter og PMT innstillingene for cellene av interesse ved backgating CD45 høye immunceller i hvert histogram og spredningsplott. Merk: tilpasse PMT-spenninger av FITC, slik som CD45-negative, mellomprodukt (int) og høy-uttrykkende celler kan skilles fra hverandre.
- Bruk antistoff fanget kompensasjon perler til å utføre multi-farge kompensasjon. Sett porter for microglia (CD45 int) og leukocytter (CD45 høy) og deretter definere leukocytt subpopulasjoner ifølge gating strategien vist i figur 1.
Representative Results
Cerebral iskemi ble startet i 12-uker gammel mannlig C57BL / 6 mus via forbigående filament okklusjon av venstre arteria cerebri media (MCAO). For humbug drift filament ble satt inn for å tilstoppe venstre arteria cerebri media og trukket umiddelbart å tillate umiddelbar reperfusjon. Viktigere, skiller mobilnevroinflammasjon vesentlig blant vanlige benyttede takts modellene 19. Dette må tas i betraktning, spesielt når ekstrapolere resultater fra dyrestudier til heterogene patofysiologien av menneskelig slag.
Mus ble avlivet 24 timer etter MCAO for å analysere tidlig immune celle invasjon av iskemisk hjerneskade. Celletall hentet fra iskemisk halvkule (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) etter densitetsgradientsentrifugering var sammenlignbare med de fra motsatt halvkule (MCAO contra, 1,09 ± 0,30 x 10E6) og ipsilateralehalvkule av humbug-opererte mus (humbug ipsi; 1,12 ± 0,18 x 10E6, enveis ANOVA, p = 0,524). Levedyktighet av isolerte celler målt ved trypan blå eksklusjon var høy, og var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene (humbug 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, ipsi MCAO 95,68 ± 2,04%, enveis-ANOVA, p = 0,253 ).
Sammensetningen av hjernen infiltrere 24 timer etter MCAO ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse. Figur 1 illustrerer portstyringsstrategien skjematisk (A) og i en representativ slag dyr (B). Brain-infiltrere leukocytter ble definert som CD45 høy celler som kan skilles fra CD45 int microglia. Innenfor CD45 høye befolkningen, ble polymorfonukleære nøytrofiler (PMN) identifisert av Ly-6G uttrykk, mens T-lymfocytter ble avgrenset som CD45 høy CD3 + celler. De gjenværende CD45 høy-celler ble deretter skilleed av CD19 (B-lymfocytter) og CD11b uttrykk. Den CD11b + fraksjonen ble videre subcategorized inn Ly-6C høy `inflammatorisk monocytes` og en Ly-6C lav befolkning som omfatter monocytter, dendrittiske celler (DC) og makrofager.
I den akutte fasen av hjerneslag, myeloide immunceller dominere hjernen infiltrere 3,20. Neutrophils inn i hjernen raskt etter fartøyet okklusjon og fremme bloduttredelse av inflammatoriske monocytter 21. Figur 2A viser den prosentvise økningen av Ly6-G + nøytrofile i iskemisk halvkule 24 timer etter MCAO sammenlignet med kontralateral hemisfære og humbug kirurgi. I motsetning til dette er andelen av CD3 + T-celler i den ischemiske hjernehalvdelen (forholdsvis) som er lavere enn i den friske hjernen. Innenfor CD11b + befolkningen, skifter hjerne iskemi balansen mot en sterk overvekt av Ly-6C høye betennelses monocytter (Figur2B).
I tillegg til relative fordelinger, ble telle rør anvendt for å bestemme absolutte tall av immuncelleundergrupper i prøver på grunnlag av CD45 positive hendelser (figur 3). Telling av rørene inneholder en lyofilisert pellet som frigjør et kjent antall fluorescerende kuler. Det absolutte antall positive celler i prøven kan bestemmes ved å relatere cellulære hendelser å perle arrangementer. For å beregne antall CD45 høye leukocytter per halvkule følgende ligning ble brukt: CD45 høy celler per halvkule = (CD45 høye hendelser x total telling perler / sample perle hendelser) x (total suspensjon volum (100 ul) / prøvevolum (10 ul )). 24 timer etter MCAO ble samlet leukocyttverdiene i infarkt halvkule betydelig økt sammenlignet med den kontralaterale hemisfære og sham kirurgi (figur 3D, en-veis ANOVA, p = 0,0004). Teller av di stinct immuncelleundergrupper (PMN, T-celler, B-celler, Ly-6C høy og Ly-6C lave monocytter) lett kan beregnes ved å multiplisere deres relative frekvens med den samlede CD45 høy leukocytt-tall for den respektive prøve.
Figur 1. gating Strategi for flowcytometrisystemer. (A) Skjematisk illustrasjon av gating strategien. (B) viser strømningscytometrisk analyse av leukocytter isolert fra en representativ mus hjernen 24 timer etter tilstopping av midtre cerebralarterie. FSC frem scatter, PMN polymorfonukleære nøytrofile, CDC klassiske dendrittiske celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
Figur 2. Differensiering av immun cell Subsets. Den relative fordeling av Ly-6G + -neutrophils (A), CD3 + T-celler (A) og monocytt undergrupper som er identifisert ved differensiell ekspresjon av Ly-6C (B) i den ipsilaterale (ipsi) og kontralaterale ( contra) halvkule 24 timer etter tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) eller en respektiv falsk operasjon. Andel av hver populasjon er angitt i porten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kvantifisering av Brain leukocytter ved å telle perler. (A) viser svært dobbel-positive perle gate. Innenfor enkelt celle populasjon (B) CD45 int mikroglia kan skilles fra CD45 høye leukocytter (C). For kvantifisering, antall gated CD45 høye hendelser ble normalisert til de telles perle hendelser. Legg merke til at den totale leukocytter (CD45 høy) tellinger blir signifikant økt i den ipsilaterale (ipsi) halvkule sammenlignet med den kontralaterale (Contra) halvkule og sham kirurgi 24 timer etter tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 ved en-veis ANOVA og Tukey`s post hoc multiple sammenligninger test. n = 4. - 6. pr gruppe. FSC frem scatter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| fluorochrome | FITC | PE | PerCP | PC7- | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| antigen | CD45.2 | CD3 | Ly-6G | CD19 | Ly-6C | CD11b |
| Endelig konsentrasjon [pg / ml] | 5 | 1 | 0.2 | 0.2 | 1 | 1 |
| fortynningsfaktoren | 1/100 | 1/200 | 1/1000 | 1/1000 | 1/200 | 1/200 |
| Clone | 104 | 145-2C11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | M1 / 70 |
Tabell 1. Grunnleggende antistoff Cocktail for immun Cell Identifikasjon i iskemisk Brain.
Discussion
Her beskriver vi en enkel og effektiv metode for isolering av leukocytter fra den murine hjernen etter eksperimentell slag. Tilnærmingen gir pålitelig svært reproduserbare celler per hjernen halvkule tillater å måle ulike strømnings paneler i en biologisk replikere.
Angivelig, vil en ufullstendig fjerning av blod inkludert immunceller resultere i et forvrengt syn på den faktiske mengden av betennelsesceller som kom inn i iskemisk hjernen. Så når du bruker denne protokollen være spesielt oppmerksom på grundig transcardial perfusjon for å hindre forurensning av infiltrerte immunceller med ikke-inflammatoriske sirkulerende leukocytter. Fra erfaring, reduserer bruken av sløve nåler for venstre hjertekammer punktering risikoen for skade av det interventrikulære septum som ville omgå perfusjon av den systemiske sirkulasjonen. Fremveksten av perfusjon væske fra neseborene er et tegn på at den perfusjon pressureis for høyt, og dermed envoid strømningshastigheter> 10 ml / min. Pale til hvite fargen på hjernevev indikerer god perfusjon mens rosa farge er et tegn på dårlig perfusjon.
Et annet kritisk punkt i denne protokollen er effektiv dissosiasjon av hjernevev som omfatter mekanisk fragmentering samt enzymatisk fordøyelse. Hakking vevet gjennom celle sil er kritisk for å tilveiebringe forbedret effektivitet av proteaser. Imidlertid, når homogenisering av vevet, unngå for stort trykk som mononukleære fagocytter er svært utsatt for autolyse 22. For enzymatisk fordøyelse Liberase TL er anbefalt som er en blanding av høyt renset kollagenase I og II som inneholder lave konsentrasjoner av den nøytrale proteasen termolysin. Den direkte sammenligning med tidligere beskrevne isolasjon protokoller 14,22,23 avslørte betydelig høyere utvinning av levedyktige celler ved Liberase TL behandling (KM upubliserte data). Sammenlignet med kollagenase som er bruker ofted for isolering av immunceller fra hjernen, inneholder Liberase TL neglisjerbare nivåer av endotoksin. Dette er av spesiell betydning hvis celler sorteres for genetisk analyse, fordi høye nivåer av endotoksin kan endres av aktiveringstilstanden av immunceller 24 og alvorlig svekke cellekultur utfall 25. En annen ulempe ved tradisjonelle kollagenase er betydelige masse-til-mange forskjeller i de enzymaktiviteter som truer reproduserbarhet av resultater og krever bestemmelse av arbeidskonsentrasjon for hvert parti 26.
I den voksne hjernen, myelin fjerning av densitetsgradientsentrifugering er en uunnværlig skritt for nedstrøms applikasjoner som flowcytometri eller videre studier på gen eller protein uttrykk. En stor fordel med den protokoll er et enkelt-lags tetthet fremgangsmåte som ikke krever tidkrevende fremstilling av gradienter. Videre er separasjonen protokollen produserer pålitelig resultats selv når utført av ganske uerfarne forskere. Det er blottet for lagdelte gradienter med tettheter nær hverandre som er vanskelige å pipette uten å forstyrre grensesnittet i mellom.
Basert på ekspresjon av CD45 overflatemarkør, protokollen gir celle tre hovedkategorier i den ischemiske hjerne. De aller fleste av celler tilhører en CD45 negative befolkning som er sammensatt av nerveceller, astroglia, ependymal og endotelceller. Deres rikelig tilstedeværelse er knyttet til densitetsgradient med ett lag som i hovedsak tar sikte på effektiv myelin og avfall fjernes. I tillegg kan en CD45 int befolkning representerer bosatt microglia 27 skilles fra en CD45 høy befolkning som hovedsakelig inneholder infiltrere hematogene leukocytter. Imidlertid bør det bemerkes at aktiverte mikroglia kan fastsette fenotype og funksjonen av blod-fødte myeloide celler. Dermed er det bare å bruke sophisticated teknikker som parabiosis 28, hjernespinn benmarg 29 eller skjebne kartlegging analyse 30 tillate en klar distinksjon mellom de to bestandene ved betennelse.
Analyse av data i flowcytometri er ofte begrenset til den prosentvise fordeling av spesifikke cellepopulasjoner. Men når du sammenligner infarktet halvkule til ikke-infarkt hjernevev denne informasjonen kan være misvisende fordi den ikke anser totalt hjerne leukocyttverdiene som er endret av iskemisk skade. Derfor, for å tegne et fullstendig bilde av omfanget og fenotype av inflammatoriske infiltrater etter hjerneslag relative fordelingen av immuncelle undergrupper bør suppleres med absolutte celle tall. Ved bruk av mikroperler som er beskrevet i denne protokollen, er pipettering av en nøyaktig prøvevolum helt obligatorisk for å oppnå pålitelige resultater. Videre er omvendt pipettering sterkt anbefalt å unngå skumdannelse i telle røret. Oppstår luftboblervil redusere forventet volum av mikroperler og dermed føre til en overvurdering av absolutte CD45 høy leukocyttverdiene i utvalget.
Oppsummert gir denne protokollen en enkel og pålitelig metode for å isolere immunceller fra hjernen. Det kan tjene som et verdifullt verktøy for å dissekere kompleksiteten av den inflammatoriske respons på hjerneinfarkt. Fremtidige anvendelser omfatter undersøkelser på den tidsavhengige rolle av monocytt delmengder i forplantning og oppløsning av iskemisk hjernebetennelse. Tilsvarende er rollen til det adaptive immunsystemet etter hjerneslag dårlig forstått. Flowcytometrisk analyse av T-celle subpopulasjoner identifisert av uttrykket av undergruppe spesifikke transkripsjonsfaktorer eller cytokiner in situ kan bidra til å avklare deres innvirkning på langsiktig bedring etter hjerneslag, og dermed åpne lovende veier for utvikling av nye behandlingsmetoder.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Isabell Schulz for utmerket teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
- Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
- Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
- Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
- Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
- Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
- Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
- Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
- Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
- Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
- Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
- Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
- Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
- Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
- Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
- Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
- McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
