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Immunology and Infection

अलगाव और इस्केमिक माउस मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण

Published: February 12, 2016 doi: 10.3791/53658
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3
1Ischemia Research Unit, Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Fraunhofer Research Institution for Marine Biotechnology, University of Lubeck, 3Department of Neurology, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Abstract

इस्कीमिक स्ट्रोक एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि intravascular डिब्बे में शुरू होता है और मस्तिष्क निवासी कोशिकाओं का तेजी से सक्रियण शामिल शुरू की। इस भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण तंत्र केमोकाइन रिहाई और बढ़ endothelial आसंजन अणु अभिव्यक्ति द्वारा सुविधा इस्कीमिक मस्तिष्क के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं घूम के पलायन है। ब्रेन-हमलावर ल्यूकोसाइट्स अच्छी तरह से जाना जाता है प्रारंभिक अवस्था माध्यमिक इस्कीमिक चोट के लिए योगदान है, लेकिन बाद में सूजन और मस्तिष्क की मरम्मत की समाप्ति के लिए उनके महत्व हाल ही में देखा गया है।

इधर, इस्कीमिक माउस मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कुशल अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है। transcardial छिड़काव के बाद, मस्तिष्क गोलार्द्धों विच्छेदित कर रहे हैं और यंत्रवत् अलग। Liberase साथ enzymatic पाचन माइलिन और सेल मलबे को हटाने के घनत्व ढाल (जैसे Percoll के रूप में) centrifugation द्वारा पीछा किया जाता है। इस प्रोटोकॉल मैं का एक प्रमुख लाभएकल परत घनत्व ढाल प्रक्रिया है जिसमें ढ़ाल के समय लेने वाली तैयारी की आवश्यकता नहीं है और मज़बूती से प्रदर्शन किया जा सकता है। दृष्टिकोण मस्तिष्क गोलार्द्ध प्रति अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कोशिकाओं की गिनती पैदावार और एक जैविक को दोहराने में कई पैनलों से फ्लो को मापने के लिए अनुमति देता है। प्ररूपी लक्षण और मस्तिष्क पर हमला ल्यूकोसाइट्स की मात्रा का ठहराव प्रायोगिक इस्कीमिक स्ट्रोक के बाद चोट और मरम्मत में उनकी बहुमुखी भूमिकाओं की एक बेहतर समझ के लिए योगदान कर सकते हैं।

Introduction

सेरेब्रल स्ट्रोक एक निरंतर भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि तेजी से स्थानीय रक्त के प्रवाह की समाप्ति के बाद शुरू होता है और लगभग प्रतिरक्षा प्रणाली के सभी भागों शामिल हो सके। इस भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण बानगी है जो मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं, पर्याप्त केमोकाइन स्राव की सक्रियता के द्वारा संचालित है और सहानुभूति बहिर्वाह 1-3 बढ़ जाती है मस्तिष्क के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक समय पर बाढ़ है। भड़काऊ सेल घुसपैठ पहले से इस्कीमिक स्ट्रोक में हानिकारक माना जाता था, हालांकि, कई उपचार परीक्षण धड़ल्ले से मस्तिष्क को ल्युकोसैट निकास ब्लॉक करने के लिए बनाया गया एक औसत दर्जे का चिकित्सीय लाभ 4 के लिए प्रेरित करने में विफल रहा है। हाल ही में, यह स्पष्ट है कि monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं शुरू इस्कीमिक क्षति 5 की प्रगति में शामिल भी सूजन और बाद के ऊतकों की मरम्मत 6 के समाधान के लिए एक निर्णायक भूमिका निभा सकता है बन गया।

प्ररूपी और कामकाज की पहचान करने के लिए धन्यवादmonocytes और मैक्रोफेज के बीच onal विविधता, विकास और सूजन के संकल्प में mononuclear phagocytes की भूमिका पर ज्ञान में काफी विस्तार किया गया है। चूहों में घूम monocytes लिम्फोसाइट प्रतिजन 6 जटिल (भंडारण-6C) 7 की उनकी सतह अभिव्यक्ति के अनुसार कम से कम दो कार्यात्मक अलग कैंपेन्स में वर्गीकृत किया जा सकता है। जबकि Ly-6C उच्च'inflammatory monocytes' स्पष्ट रूप से जीवाणु संक्रमण 8 के नियंत्रण के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था, बाँझ चोट में उनकी भूमिका अधिक विवादास्पद है। इस्कीमिक स्ट्रोक में, CCR2 + Ly-6C उच्च monocytes के चुनिंदा पृथक रक्तस्रावी रोधगलितांश परिवर्तन 6 में हुई। हालांकि, एक ही प्रयोगात्मक दृष्टिकोण इन्ट्रासेरेब्रल नकसीर 9 के बाद तीव्र विकलांगता सुधार हुआ है। इसी तरह, टी कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट में या तो 10 या हानिकारक सुरक्षात्मक कार्यों को लागू करने के लिए 11 विश्वास कर रहे हैं, हालांकि, डेटा controversi हैअल 12,13 और वारंट आगे की जांच। इस बढ़ती जटिलता को देखते हुए यह स्पष्ट हो जाता है कि इस्कीमिक चोट और मरम्मत में विविध प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका पर गहरा ज्ञान पद स्ट्रोक सूजन को निशाना बनाने के उपचारों में प्रयोगात्मक निष्कर्षों के अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण है।

आज, सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए सबसे शक्तिशाली उपकरण अनेक रंगों से फ्लो है। यह इन विवो लेबलिंग या आनुवंशिक हेरफेर 14 से पूर्वाग्रह प्रणाली की आवश्यकता के बिना सूजन के स्थल पर पहचान और विभिन्न प्रतिरक्षा सेल सबसेट की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। Intracellular साइटोकिन्स 15 या प्रतिलेखन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कोशिका की सतह मार्कर का एक साथ धुंधला कारकों 16 अतिरिक्त व्यक्ति, phenotypically पहचान कोशिकाओं के कार्यात्मक स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करता है। एक बड़ी खामी के रूप में, एकल कक्ष निलंबन प्रवाह cytometric assays के लिए आवश्यक हैं और इस प्रकार नियंत्रण रेखा के बारे में जानकारीसेलुलर पैठ की alization खो दिया है। हालांकि, जबकि ऊतक विज्ञान स्थानिक जानकारी हासिल करने के लिए आदर्श है, यह है कि एक ही समय में इस्तेमाल किया जा सकता है एक विशेष ऊतकों में प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार को चिह्नित करने के लिए एंटीबॉडी की संख्या से सीमित है। आज, उपस्थिति और विभिन्न सतह मार्कर के अभाव का एक संयोजन असंदिग्ध रूप से सूजन के दौरान 17 दुर्लभ प्रतिरक्षा सेल सबसेट, विशेष रूप से अलग monocyte व्युत्पन्न सेल आबादी की पहचान करने की जरूरत है।

यहाँ, हम एक सरल एकल परत घनत्व ढाल का उपयोग कर postischemic माउस मस्तिष्क से ल्यूकोसाइट्स की उच्च संख्या को अलग-थलग करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन। प्राप्त सेल निलंबन या तो cytometry या आगे की बहु-आयामी प्रवाह से विश्लेषण किया जा सकता अति विशिष्ट बहाव के विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए प्रवाह cytometric छँटाई या immunomagnetic सेलेक्शन समृद्ध किया। विधि विवरण transcardial छिड़काव, मस्तिष्क गोलार्द्धों के हटाने, मस्तिष्क के ऊतकों की हदबंदी एकल कक्ष susp मेंensions, माइलिन हटाने के लिए घनत्व ढाल centrifugation के रूप में अच्छी तरह से प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी धुंधला।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों जानवरों की देखभाल के लिए अनुसार मानकों के अनुरूप होना चाहिए (उदाहरण के लिए।, देखभाल और प्रयोगशाला पशु स्वास्थ्य, एनआईएच प्रकाशन नहीं 85-23 के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रकाशित, के उपयोग के लिए गाइड 1,996 संशोधित) और अनुमोदित किया जाना है उपयुक्त राज्य प्राधिकारी द्वारा।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. पाचन बफर (गोलार्द्ध प्रति 1 मिलीलीटर): शुद्ध पाचक एंजाइम, जैसे की एक मानकीकृत मिश्रण भंग, Liberase कम thermolysin एकाग्रता (टीएल) हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) युक्त कैल्शियम में 2 यू / एमएल के एक एकाग्रता (सीए) और मैग्नीशियम के साथ (मिलीग्राम)
  2. DNase साथ धुलाई बफर: HBSS में 666U / एमएल की एकाग्रता के लिए DNase मैं भंग (सीए / एमजी मुक्त) भ्रूण बछड़ा सीरम के 10% से युक्त (एफसीएस)
  3. DNase बिना वॉशिंग बफर: HBSS (सीए / एमजी मुक्त) एफसीएस के 10% से युक्त
  4. घनत्व ढाल मध्यम (गोलार्द्ध प्रति 5 एमएल): शेयर isotonic घनत्व ढाल तैयार0; मध्यम (एसआईपी; 100%) एक हिस्सा 1.5 एम सोडियम क्लोराइड के साथ मध्यम घनत्व ढाल के नौ भागों मिश्रण से। HBSS के (सीए / एमजी मुक्त) एक उचित मात्रा एफसीएस के 3% से युक्त जोड़कर 25% घनत्व के लिए एसआईपी पतला
  5. से फ्लो (एफसी) बफर: (पीबीएस) फॉस्फेट बफर खारा तैयार एफसीएस के 3% से युक्त

2. क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा

नोट: क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) intraluminal सिवनी तकनीक के माध्यम के रूप में पहले 18 से 12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL / 6 चूहों में वर्णित किया गया था।

  1. संक्षेप में, 100% ऑक्सीजन में 2.0% isoflurane के साथ चूहों anesthetize। 36.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए ± 0.5 डिग्री सेल्सियस एक राय नियंत्रित हीटिंग उपकरण के द्वारा।
  2. आम मन्या धमनी और बाह्य मन्या धमनी के बंधाव के बाद, मध्यम सी की उत्पत्ति के लिए आम मन्या धमनी और यह पहले से एक मानकीकृत सिलिकॉन रबर लेपित monofilament परिचयerebral धमनी।
  3. 45 मिनट के बाद reperfusion की अनुमति देने के लिए रेशा निकाल दें। दिखावा संचालित जानवरों में, तुरंत मध्य मस्तिष्क धमनी occluding ischemia से बचने के लिए रेशा के बाद वापस ले लें।

3. Transcardial छिड़काव और ब्रेन विच्छेदन

  1. ठंडा HBSS (सीए / एमजी मुक्त) में टयूबिंग के एक छोर डुबो कर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला छिड़काव पंप तैयार करें। छिड़काव ट्यूब के दूसरे छोर से एक कुंद 23 जी सुई फिक्स और पंप पर स्विच पूरी तरह से HBSS (सीए / एमजी मुक्त) के साथ ट्यूबिंग भरने के लिए।
  2. गहराई से 4% isoflurane के साथ माउस anesthetize और सीओ 2 साँस लेना द्वारा euthanize।
  3. एक विच्छेदन बोर्ड एक प्लास्टिक की ट्रे में एम्बेडेड पर माउस पीछे की ओर रखें। फैलाओ सामने और हिंद पंजे के रूप में व्यापक रूप में संभव है और 20 जी सुइयों के साथ विच्छेदन बोर्ड पर उन्हें ठीक।
  4. एक सीधे 1 एक्स 2 दांत संदंश के साथ पेट की त्वचा को पकड़ो और आवरण और पेट की दीवार के माध्यम से एक पार्श्व चीरा बनाने के लिए तेज परितारिका कैंची का उपयोग करें और बेनकाबजिगर।
  5. उरोस्थि लिफ्ट और तेज / कुंद कुंद आईरिस कैंची की ब्लेड के साथ डायाफ्राम काटकर अलग कर देना। caudocranial दिशा में दोनों पक्षों में पार्श्व रिब पिंजरे में कटौती करने के लिए आगे बढ़ें। फेफड़े, दिल और धमनियों वक्ष को चोट पहुंचाना नहीं सावधान रहें।
  6. एक कुंद संदंश के साथ त्वचा फ्लैप लिफ्ट और विच्छेदन बोर्ड पर पिन। कुंद अंत संदंश और कैंची का प्रयोग सावधानी से संयोजी ऊतक से अलग करने के लिए दिल।
  7. एक कुंद अंत संदंश के साथ दिल पकड़ो और बाएं वेंट्रिकल की सर्वोच्च में संलग्न छिड़काव ट्यूब के साथ कुंद 23 जी सुई की नोक डालें। नोट: बहुत दूर बाएं वेंट्रिकल में सुई डालने interventricular पट की चोट से बचने के लिए नहीं है। यदि आवश्यक हो, एक सीधे तेज संदंश के साथ जगह में प्रवेशनी तय कर लो।
  8. (प्रवाह की दर: 8 - 10 मिलीग्राम / मिनट) तेज आईरिस कैंची से काटकर अलग कर देना सही आलिंद और तुरंत पंप पर बारी।
  9. छिड़काव जारी रखें जब तक जिगर एक प्रकाश कॉफी रंग (~ HBSS के 30 मिलीलीटर) से पता चलता है। पूरेछिड़काव, ध्यान से ट्यूबिंग में किसी भी हवाई बुलबुले के गठन से बचें।
  10. सीधे शल्य कैंची सिर्फ खोपड़ी के पीछे के साथ माउस सिर काटना। आईरिस कैंची का उपयोग खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के एक midline चीरा बनाने के लिए।
  11. तेज आईरिस कैंची से एक टिप रंध्र मैग्नम में रखें और खोपड़ी में laterally काटा। दूसरे पक्ष के लिए दुहराएँ।
  12. ध्यान से नाक की ओर midline ऊपर ही गुहा से कटौती करने के लिए तेज आईरिस कैंची का प्रयोग करें। कैंची संभव के रूप में सतही के अंत रखने के लिए मस्तिष्क की चोट से बचने की कोशिश करें।
  13. ठीक संदंश का प्रयोग धीरे प्रत्येक मस्तिष्क गोलार्द्ध से कपाल हड्डियों छील करने के लिए। नोट: Infarcted ऊतक तानिका या खोपड़ी का पालन कर सकते हैं; असावधान विच्छेदन के कारण मस्तिष्क के ऊतकों को खोना नहीं सुनिश्चित कर लें
  14. एक रंग के साथ मस्तिष्क लिफ्ट और तेज आईरिस कैंची का उपयोग सावधानी से कपाल तंत्रिका तंतुओं है कि यह खोपड़ी को ठीक करने के लिए काटना। मस्तिष्क HBSS (+ सीए / एमजी) के 10 मिलीलीटर से भरा एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और यह बात रखhortly बर्फ पर।

एकल कक्ष निलंबन में सेरेब्रल ऊतक की हदबंदी 4.

  1. ध्यान से एक साफ रेजर ब्लेड के साथ मस्तिष्क स्टेम और सेरिबैलम हटा दें। मस्तिष्क Hemisect और लगभग बराबर आकार के तीन टुकड़ों में राज्याभिषेक विमान के साथ प्रत्येक गोलार्द्ध में कटौती करने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड का प्रयोग करें।
  2. कीमा एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के सवार अंत का उपयोग कर एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से प्रत्येक गोलार्द्ध के ऊतक विच्छेदित। लगातार ठंडा HBSS (+ सीए / एमजी) के साथ सेल झरनी कुल्ला। बर्फ पर homogenized नमूने संग्रहित करें।
  3. 286 XG और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पाचन बफर के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धीमी गति से निरंतर रोटेशन के तहत निलंबन सेते हैं।
  4. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से चलनी सेल निलंबन और वाशिंग बफर DNase युक्त के 3 मिलीलीटर DNase मुक्त धोने बफर के 15 मिलीलीटर द्वारा पीछा के साथ अच्छी तरह कुल्ला। 286 XG पर अपकेंद्रित्र और 5 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। नोट: नोट: DNase का उपयोग सेल जो सेल अस्तित्व समझौता किए सेल एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की वजह से डीएनए बलगम समाप्त।

5. घनत्व माइलिन और सेल मलबे को हटाने के लिए ढाल centrifugation

  1. 25% घनत्व ढाल माध्यम के 5 मिलीलीटर और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को निलंबन पिपेट में Resuspend सेल गोली। दोहराया और कोमल pipetting बुलबुला गठन से बचने के द्वारा अच्छी तरह मिक्स। नोट: मध्यम घनत्व ढाल सेल clumping को रोकने के लिए आरटी पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. 521 XG पर अपकेंद्रित्र और 20 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस। रोटर की सबसे कम त्वरण प्रोफ़ाइल का प्रयोग करें और रोटर ब्रेक के बिना बंद करने के लिए अनुमति देते हैं। धीरे मिलाते हुए बिना सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों को हटा दें। जबकि ट्यूब के नीचे सेल गोली संरक्षण ध्यान माइलिन कोट और सतह पर तैरनेवाला aspirate। नोट: पूरे माइलिन कोट को दूर करने के रूप में किसी भी बचे हुए impai जाएगा सुनिश्चित करेंआर प्रवाह cytometric विश्लेषण।
  3. DNase मुक्त धोने बफर के 10 मिलीलीटर में गोली Resuspend और एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब को निलंबन पिपेट। नोट: यह धोने कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि मध्यम घनत्व ढाल की पर्याप्त हटाने में काफी मात्रा और अंतिम सेल नमूना की गुणवत्ता के लिए योगदान देता है।
  4. फिर 286 XG पर और 5 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला त्यागने सेंट्रीफ्यूज। ठंड धोने बफर के 100 μl में कोशिकाओं resuspend और सेल मायने रखता है और व्यवहार्यता का निर्धारण एक hemocytometer में trypan नीले बहिष्कार से। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के नमूने और उन्हें जल्दी से आगे की प्रक्रिया।

प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए 6. एंटीबॉडी धुंधला

  1. unspecific बंधन को रोकने के लिए: एंटीबॉडी लेबलिंग करने से पहले, विरोधी murine CD16 / CD32 एफसी रिसेप्टर अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ 10 मिनट (200 माइक्रोग्राम 2.5 / एमएल के अंतिम एकाग्रता, कमजोर पड़ने कारक 1) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेते हैं।
  2. एक पर fluorophore संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ेंppropriate एकाग्रता सेल निलंबन के लिए (तालिका 1 में संकेत के रूप में) और अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। नोट: नियंत्रण नमूने प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं कर रहे हैं, लेकिन अन्यथा एक ही इलाज किया।
  3. 350 XG पर एफसी बफर और सेंट्रीफ्यूज के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और 7 min.Carefully के लिए 10 डिग्री सेल्सियस एफसी बफर के 200 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली aspirate। प्रवाह cytometric विश्लेषण जब तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर अस्थायी रूप से स्टोर नमूने हैं।

7. गिनती मोती द्वारा निरपेक्ष मात्रा

  1. विपरीत एफसी बफर के 40 μl और फ्लोरोसेंट मोतियों की एक ज्ञात संख्या वाले एक गिनती ट्यूब में सेल निलंबन के 10 μl विंदुक। नोट: ध्यान दें कि pipettes के रूप में ल्युकोसैट की गिनती के बाद गणना इस मात्रा को दर्शाता है नमूना के ठीक 10 μl वितरित करने के लिए calibrated हैं।
  2. FITC लेबल CD45 एंटीबॉडी (अंतिम एकाग्रता के साथ सेल निलंबन सेतेअंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100): 5 माइक्रोग्राम / एमएल, कमजोर पड़ने कारक 1।
  3. विपरीत किसी भी कदम धोने के बिना एफसी बफर के 200 μl के साथ गिनती ट्यूब भरने और सीधे प्रवाह में CD45 + कोशिकाओं रिकॉर्ड है।

8. प्रवाह cytometric अधिग्रहण

नोट: प्रस्तावित एंटीबॉडी पैनल का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त कोशिकामापी एक नीले (488 एनएम), लाल (635 एनएम) और वायलेट (405 एनएम) लेजर और फिल्टर FITC, पीई, PerCP Cy5.5, PECy7 के लिए के साथ सुसज्जित किया जाना है, एपीसी-Cy7 और AmCyan।

  1. एक इस्कीमिक गोलार्द्ध से बेदाग कोशिकाओं का उपयोग करके आगे (एफएससी) और बगल की ओर (एसएससी) बिखराव को समायोजित करें। एक डॉट क्षेत्र और एफएससी की ऊंचाई दिखा साजिश में एकल कक्षों से दोहरी भेदभाव।
  2. प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए इस्तेमाल किया एकल पैरामीटर histograms में सभी एकल कक्षों को प्रदर्शित और photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज इतना है कि एकल कक्षों में अब तक हिस्टोग्राम की बाईं प्रदर्शित कर रहे हैं समायोजित करें।
  3. का प्रयोग करें एक CD45-FITC एकलप्रत्येक हिस्टोग्राम और तितर बितर साजिश में CD45 उच्च प्रतिरक्षा कोशिकाओं backgating द्वारा ब्याज की कोशिकाओं के लिए तितर बितर और पीएमटी सेटिंग्स की जाँच करने के लिए दाग नमूना। नोट: FITC की पीएमटी voltages को अपनाना तो यह है कि CD45 नकारात्मक, मध्यवर्ती (पूर्णांक) और उच्च व्यक्त कोशिकाओं को एक दूसरे से भेदभाव किया जा सकता है।
  4. बहु रंग मुआवजा प्रदर्शन करने के लिए एंटीबॉडी कब्जा कर लिया मुआवजा मोतियों का प्रयोग करें। Microglia (CD45 पूर्णांक) और ल्यूकोसाइट्स (CD45 उच्च) के लिए द्वार सेट और बाद में gating रणनीति चित्रा 1 में दिखाया गया के अनुसार ल्युकोसैट उप-जनसंख्या को परिभाषित।

Representative Results

मस्तिष्क ischemia छोड़ा मध्य मस्तिष्क धमनी (MCAO) के क्षणिक रेशा रोड़ा के माध्यम से 12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL / 6 चूहों में शुरू किया गया था। दिखावा आपरेशन के लिए छोड़ दिया रेशा मध्य मस्तिष्क धमनी रोक देना डाला जाता है और तुरंत वापस ले लिया तत्काल reperfusion की अनुमति देने के लिए किया गया था। महत्वपूर्ण बात है, सेलुलर neuroinflammation सामान्यतः लागू स्ट्रोक मॉडल 19 के बीच काफी अलग है। यह विशेष रूप से जब जानवरों के अध्ययन से निष्कर्ष मानव स्ट्रोक की विषम pathophysiology के लिए extrapolating को ध्यान में रखा जाना है।

चूहे MCAO के बाद 24 घंटे बलिदान किया गया इस्कीमिक मस्तिष्क को जल्दी प्रतिरक्षा सेल आक्रमण का विश्लेषण करने के लिए। सेल मायने रखता है इस्कीमिक गोलार्द्ध से प्राप्त (MCAO ipsi; 0.95 ± 0.25 x 10E6) के बाद घनत्व ढाल centrifugation contralateral गोलार्द्ध से उन लोगों के बराबर थे (MCAO कॉन्ट्रा, 1.09 ± 0.30 x 10E6) और ipsilateralदिखावा संचालित चूहों के गोलार्द्ध (दिखावा ipsi; 1.12 ± 0.18 x 10E6, एक तरह से एनोवा, पी = .524)। trypan नीले बहिष्कार से मापा पृथक कक्षों की व्यवहार्यता उच्च था और काफी समूह (दिखावा ९६.८५ ± 0.60%, MCAO कॉन्ट्रा ९७.१२ ± 1.18%, MCAO ipsi ९५.६८ ± 2.04%, एक तरह-एनोवा, पी = 0.253 के बीच अलग नहीं किया था )।

मस्तिष्क की संरचना 24 घंटा में घुसपैठ के बाद MCAO प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। चित्रा 1 gating रणनीति रेखाचित्र (ए) और एक प्रतिनिधि स्ट्रोक जानवर में (बी) को दिखाता है। ब्रेन घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स CD45 उच्च कोशिकाओं है कि CD45 int microglia से भेदभाव किया जा सकता के रूप में परिभाषित किया गया। CD45 उच्च जनसंख्या के भीतर, Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (PMN), Ly-6G अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की है, जबकि टी lymphocytes CD45 उच्च CD3 + कोशिकाओं के रूप में चित्रित किया गया गया था। शेष CD45 उच्च कोशिकाओं तो भेद थेCD19 (बी लिम्फोसाइट) और CD11b अभिव्यक्ति द्वारा एड। CD11b + अंश आगे Ly-6C उच्च `भड़काऊ monocytes` और एक घातक-6C कम जनसंख्या कि monocytes, वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) और मैक्रोफेज शामिल subcategorized में किया गया था।

स्ट्रोक की तीव्र चरण में, माइलॉयड प्रतिरक्षा कोशिकाओं मस्तिष्क घुसपैठ 3,20 पर हावी है। न्यूट्रोफिल पोत रोड़ा के बाद तेजी से मस्तिष्क में प्रवेश और भड़काऊ monocytes 21 के परिस्त्राव बढ़ावा देने के। चित्रा 2A contralateral गोलार्द्ध और नकली सर्जरी की तुलना में MCAO के बाद इस्कीमिक गोलार्द्ध 24 घंटा में Ly6-जी + न्यूट्रोफिल का प्रतिशत बढ़ाने को प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, इस्कीमिक गोलार्द्ध में CD3 + टी कोशिकाओं का अनुपात (अपेक्षाकृत) स्वस्थ मस्तिष्क की तुलना में कम है। CD11b + आबादी के भीतर, मस्तिष्क ischemia Ly-6C उच्च भड़काऊ monocytes के एक मजबूत प्रधानता (चित्रा की ओर संतुलन में बदलाव2 बी)।

रिश्तेदार वितरण के अलावा, गिनती ट्यूब (चित्रा 3) CD45 सकारात्मक घटनाओं के आधार पर नमूनों में प्रतिरक्षा सेल सबसेट के निरपेक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। गिनती ट्यूब एक lyophilized गोली जो फ्लोरोसेंट मोतियों की एक विज्ञप्ति में जाना जाता नंबर होते हैं। नमूने में सकारात्मक कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या सेलुलर घटनाओं से संबंधित घटनाओं के लिए मनका द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। एक्स (कुल निलंबन की मात्रा (100 μl) / नमूना मात्रा 10 μl गोलार्द्ध प्रति CD45 उच्च कोशिकाओं = (कुल गिनती के मोती / नमूना मनका घटनाओं CD45 उच्च घटनाओं x) (प्रति गोलार्द्ध निम्न समीकरण इस्तेमाल किया गया था CD45 उच्च ल्यूकोसाइट्स की संख्या की गणना करने के लिए ))। MCAO के बाद 24 घंटे, रोधगलितांश गोलार्द्ध में कुल ल्यूकोसाइट की गिनती के रूप में काफी contralateral गोलार्द्ध और नकली सर्जरी की तुलना में बढ़ रहे थे (चित्रा 3 डी, एक तरह से एनोवा, पी = 0.0004)। di की गणना stinct प्रतिरक्षा सेल सबसेट (PMN, टी-कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, Ly-6C उच्च और घातक-6C कम monocytes) आसानी से संबंधित नमूना की कुल CD45 उच्च ल्युकोसैट संख्या के साथ उनके रिश्तेदार आवृत्ति गुणा करके गणना की जा सकती।

आकृति 1
से फ्लो के लिए चित्रा 1. gating रणनीति। (ए) gating रणनीति के योजनाबद्ध चित्रण। (बी) के मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा के बाद एक प्रतिनिधि माउस मस्तिष्क 24 घंटा से अलग ल्यूकोसाइट्स का प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चलता है। एफएससी आगे तितर बितर, PMN Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल, सीडीसी शास्त्रीय वृक्ष के समान कोशिकाओं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. इम्यून सेल सबसेट के भेदभाव। Ly-6G + -neutrophils (ए) के सापेक्ष वितरण, CD3 + टी कोशिकाओं (ए) और monocyte सबसेट ipsilateral (ipsi) में Lý-6C (बी) के अंतर अभिव्यक्ति और contralateral (द्वारा की पहचान कॉन्ट्रा) गोलार्द्ध मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) या एक संबंधित नकली सर्जरी के बाद 24 घंटे। प्रत्येक जनसंख्या का प्रतिशत गेट में संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. मोती की गणना के द्वारा मस्तिष्क Leukocytes की मात्रा। (ए) अत्यधिक डबल सकारात्मक मनका गेट से पता चलता है। एकल कोशिका के भीतर आबादी (बी) CD45 int microglia CD45 उच्च ल्यूकोसाइट्स (सी) से भेदभाव किया जा सकता है। मात्रा का ठहराव के लिए, gated CD45 उच्च घटनाओं की संख्या की गिनती मनका घटनाओं के लिए सामान्यीकृत था। ध्यान दें कि कुल ल्यूकोसाइट (CD45 उच्च) में गिना जाता है काफी contralateral (कॉन्ट्रा) गोलार्द्ध और नकली सर्जरी 24 मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) के बाद मानव संसाधन की तुलना में ipsilateral (ipsi) गोलार्द्ध में बढ़ रहे हैं। ** पी <0.01, *** पी <0.001 एक तरह से एनोवा और Tukey`s पोस्ट अस्थायी एकाधिक तुलना परीक्षण के द्वारा। एन = 4 - 6 समूह के प्रति। एफएससी आगे तितर बितर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

fluorochrome FITC पीई PerCP PC7 V500
(Cy5.5)
एंटीजन CD45.2 CD3 Ly-6G CD19 Ly-6C CD11b
अंतिम एकाग्रता [माइक्रोग्राम / एमएल] 5 1 0.2 0.2 1 1
कमजोर पड़ने का कारक 1/100 1/200 1/1000 1/1000 1/200 1/200
क्लोन 104 145-2C11 1A8 6D5 AL-21 एम 1/70

इस्केमिक मस्तिष्क में प्रतिरक्षा सेल की पहचान के लिए तालिका 1. बेसिक एंटीबॉडी कॉकटेल।

Discussion

यहाँ, हम murine मस्तिष्क से leukocytes के अलगाव प्रयोगात्मक स्ट्रोक के बाद के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन है। दृष्टिकोण मज़बूती से मस्तिष्क गोलार्द्ध एक जैविक को दोहराने में अलग अलग पैनलों प्रवाह को मापने के लिए अनुमति देता है प्रति अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कोशिकाओं की गिनती अर्जित करता है।

जाहिर है, खून सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक अधूरी हटाने कि इस्कीमिक मस्तिष्क में प्रवेश भड़काऊ कोशिकाओं की वास्तविक राशि पर एक विकृत दृश्य में परिणाम होगा। इस प्रकार, जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग गैर भड़काऊ घूम ल्यूकोसाइट्स के साथ घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रदूषण को रोकने के लिए पूरी तरह से transcardial छिड़काव करने के लिए विशेष ध्यान देते हैं। अनुभव से, बाएं वेंट्रिकल पंचर के लिए कुंद सुइयों का उपयोग interventricular पट जो प्रणालीगत संचलन का छिड़काव बाईपास होगा की चोट के लिए जोखिम कम कर देता है। नाक से तरल पदार्थ छिड़काव के उद्भव एक संकेत है कि छिड़काव भी उच्च pressureis, इस प्रकार, एकशून्य प्रवाह दरों> 10 मिलीग्राम / मिनट। मस्तिष्क के ऊतकों की सफेद रंग पीला अच्छा छिड़काव इंगित करता है, जबकि गुलाबी रंग गरीब छिड़काव का एक संकेत है।

इस प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण कदम मस्तिष्क के ऊतकों है कि यांत्रिक विखंडन के साथ-साथ enzymatic पाचन शामिल की कुशल हदबंदी है। सेल झरनी के माध्यम से ऊतक क़ीमा proteases के बेहतर प्रभावशीलता प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, जब ऊतक homogenizing, अत्यधिक दबाव से बचने के रूप में mononuclear phagocytes अत्यधिक autolysis 22 को अतिसंवेदनशील होते हैं। enzymatic पाचन Liberase TL के लिए सिफारिश की है जो उच्च शुद्ध collagenase मैं और द्वितीय कि तटस्थ प्रोटीज thermolysin की कम सांद्रता शामिल का एक मिश्रण है। पहले से वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल 14,22,23 Liberase टीएल उपचार (केएम अप्रकाशित डेटा) से व्यवहार्य कोशिकाओं की काफी अधिक वसूली से पता चला है के साथ सीधे तुलना। कोलैजिनेज़ की तुलना में है जो अक्सर उपयोगमस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए डी, Liberase टीएल endotoxin की नगण्य स्तर होते हैं। इस विशेष महत्व की कोशिकाओं परिणाम 25 बहाव के विश्लेषण के लिए हल कर रहे हैं क्योंकि endotoxin के उच्च स्तर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता के 24 राज्य बदलने के लिए और गंभीर रूप से सेल संस्कृति ख़राब हो सकता है। पारंपरिक कोलैजिनेज़ का एक और दोष एंजाइम गतिविधियों जो परिणामों के reproducibility को जोखिम में डाल और प्रत्येक बहुत कुछ 26 के लिए काम एकाग्रता के निर्धारण में महत्वपूर्ण आवश्यकता है बहुत कुछ करने वाली बहुत मतभेद है।

वयस्क मस्तिष्क में, घनत्व ढाल centrifugation द्वारा माइलिन हटाने इस तरह से फ्लो या जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति पर आगे के अध्ययन के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एक अनिवार्य कदम है। प्रोटोकॉल की एक प्रमुख लाभ एकल परत घनत्व प्रक्रिया है जिसमें ढ़ाल के समय लेने वाली तैयारी की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, जुदाई प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम का उत्पादनजब नहीं बल्कि अनुभवहीन प्रयोगकर्ताओं द्वारा किया जाता भी है। यह बीच में इंटरफ़ेस परेशान बिना एक दूसरे के लिए मुश्किल हो जाता है कि पिपेट के करीब घनत्व के साथ बहुस्तरीय ढ़ाल से रहित है।

सतह मार्कर CD45 की अभिव्यक्ति के आधार पर, प्रोटोकॉल इस्कीमिक मस्तिष्क में तीन प्रमुख श्रेणियों सेल पैदावार। कोशिकाओं के विशाल बहुमत एक CD45 नकारात्मक जनसंख्या कि neuronal कोशिकाओं, अस्थिकणिका, ependymal और endothelial कोशिकाओं से बना है के हैं। उनके प्रचुर उपस्थिति एकल परत घनत्व ढाल जो मुख्य रूप से कुशल माइलिन और मलबे को हटाने के लिए करना है के लिए जिम्मेदार ठहराया है। इसके अतिरिक्त, एक CD45 int निवासी microglia 27 का प्रतिनिधित्व जनसंख्या एक CD45 उच्च जनसंख्या मुख्य रूप से hematogenous ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ जिसमें से भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सक्रिय microglia phenotype और रक्त में जन्मे माइलॉयड कोशिकाओं के समारोह गोद ले सकते हैं। इस प्रकार, केवल लागू करने से मिलावटडी तकनीक जैसे 28 parabiosis, अस्थि मज्जा 29 काइमेरा या भाग्य मानचित्रण विश्लेषण 30 सूजन के दौरान उन दो आबादी के बीच एक स्पष्ट अंतर की अनुमति।

से फ्लो में डेटा विश्लेषण अक्सर विशेष सेल आबादी का प्रतिशत वितरण तक सीमित है। हालांकि, जब गैर infarcted मस्तिष्क के ऊतकों को गोलार्द्ध रोधगलितांश की तुलना में इस जानकारी को गुमराह किया जा सकता है क्योंकि यह मस्तिष्क की कुल ल्युकोसैट मायने रखता है जो इस्कीमिक चोट से बदल रहे हैं पर विचार नहीं करता। इस प्रकार, परिमाण और भड़काऊ पैठ के phenotype पर एक पूरी तस्वीर आकर्षित करने के लिए प्रतिरक्षा के बाद सेल सबसेट के स्ट्रोक रिश्तेदार वितरण पूर्ण सेल नंबर से पूरित किया जाना चाहिए। microbeads उपयोग करते समय इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, एक सटीक नमूना मात्रा की pipetting विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से अनिवार्य है। इसके अलावा, रिवर्स pipetting जोरदार गिनती ट्यूब में फोम के गठन से बचने के लिए सिफारिश की है। हवा के बुलबुले उत्पन्न होने वालीmicrobeads की उम्मीद की मात्रा कम हो जाएगा और इसलिए नमूने में पूर्ण CD45 उच्च ल्युकोसैट गिनती के एक overestimation पैदा होती हैं।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल के लिए एक आसान और विश्वसनीय दृष्टिकोण मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रदान करता है। यह इस्कीमिक स्ट्रोक के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया की जटिलता टुकड़े करना एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम कर सकता है। भविष्य अनुप्रयोगों प्रचार और इस्कीमिक मस्तिष्क में सूजन के संकल्प में monocyte कैंपेन्स के समय पर निर्भर भूमिका पर जांच में शामिल हैं। इसी तरह, स्ट्रोक के बाद अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका खराब समझा जाता है। टी सेल सबसेट-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक या बगल में साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की उप-जनसंख्या cytometric विश्लेषण प्रवाह स्ट्रोक के बाद लंबे समय तक वसूली और नए इलाज के तरीकों के विकास के लिए इस प्रकार खुले होनहार रास्ते पर उनके प्रभाव को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

लेखकों उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Isabell Schulz धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel World precision instruments PERIPRO-4LS
Heracell 240i CO2 incubator  Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+ Thermo Scientific
FACS Canto II Becton Dickinson
Isoflurane Abbott 4831850
Hank's buffered salt solution (HBSS) Gibco/Life Technologies GmbH 14175-129
HBSS with Calcium/Magnesium Gibco/Life Technologies GmbH 24020-091
Liberase TL Roche Diagnostics GmbH 5401020001
Percoll Plus GE Healthcare Europe GmbH 17-5445-01
Fetal bovine serum  PAN Biotech 3302-P101003
Trypan blue Gibco/Life Technologies GmbH 15250-061
Trucount BD Biosciences 340334
Phosphate buffered saline Biochrom AG L 182-10
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 11284932001
CD11b Horizon V500 BD Biosciences 562128
CD16/CD32 eBioscience 14-0161
CD45.2 FITC eBioscience 11-0454
CD3 PE Biolegend 100307
CD19 PE-Cy7 Biolegend 115519
Ly6C APC-Cy7 BD Biosciences 560596
Ly6G PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560602
Silicone Tubing, 1 m World precision instruments 503022
Fine Iris Scissors sharp Fine Science Tools 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools 14130-17
Fine Iris Scissors sharp/blunt Fine Science Tools 14028-10
Straight 1 x 2 teeth forceps Fine Science Tools 11021-14
Blunt-end Forceps Fine Science Tools 11008-13
5ml syringe plunger Carl Roth GmbH (Braun) EP96.1
Cell strainer, 100 µm Dr. I. Schubert, BD 2360-00
Omnican Fine dosage syringe 1 ml Braun TBD
Cell strainer, 70 µm Greiner Bio-One GmbH 542 070
FACS Tubes BD Bioscience GmbH 352052
serological pipettes, 10 ml Greiner Bio-One GmbH 607180
serological pipettes, 10 ml Sarstedt AG&Co 861,254,025
serological pipettes, 25 ml Greiner Bio-One GmbH 760180
serological pipettes, 5 ml Greiner Bio-One GmbH 606180
serological pipettes, 25 ml Sarstedt AG&Co 861,685,020
serological pipettes,5 ml Sarstedt AG&Co 861,253,025
Tips, 0.1 - 10 µl Corning B.V.Life Sciences 4840
Tips, 100 - 1,000 µl Greiner Bio-One GmbH 740290
Tips, 10 - 200 µl Greiner Bio-One GmbH 739296
Reaction tubes 1.5 ml Greiner Bio-One GmbH 616201
Reaction tubes 2 ml Greiner Bio-One GmbH 623201
Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm Greiner Bio-One GmbH 633180
Falcon 15 ml Greiner Bio-One GmbH 188271
Falcon 50 ml VWR International GmbH (BD) 734-0448
Neubauer hemocytometer Biochrom AG PDHC-N01
razor blade Carl Roth GmbH CK07.1

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इम्यूनोलॉजी अंक 108 इस्कीमिक स्ट्रोक मस्तिष्क में सूजन मरम्मत सेल अलगाव प्रवाह cytometry मात्रा का ठहराव लक्षण सेल phenotyping प्रतिरक्षा कोशिकाओं ल्यूकोसाइट्स
अलगाव और इस्केमिक माउस मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण
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Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. J. Vis. Exp. (108), e53658, doi:10.3791/53658 (2016).

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