Abstract
Ischemisk stroke initierar en robust inflammatoriskt svar som börjar i det intravaskulära rummet och involverar snabb aktivering av hjärnresidensceller. En viktig mekanism för denna inflammatoriska reaktion är migrationen av cirkulerande immunceller till den ischemiska hjärnan underlättas av kemokin frisättning och ökad endotel adhesionsmolekyl uttryck. Brain-invaderande leukocyter är välkända bidra till tidig sekundär ischemisk skada, men deras betydelse för terminering av inflammation och senare hjärn reparation har nyligen uppmärksammats.
Här, är ett enkelt protokoll för effektiv isolering av immunceller från den ischemiska mushjärna tillhandahålls. Efter transcardial perfusion, är hjärnhalvorna dissekeras och mekaniskt dissocierade. Enzymatisk spjälkning med Liberase följs av densitetsgradient (såsom Percoll) centrifugering för avlägsnande myelin och cellrester. En stor fördel med detta protokoll iär den enda lager densitetsgradient förfarande som inte kräver tidskrävande förberedelse av lutningar och tillförlitligt kan genomföras. Tillvägagångssättet ger mycket reproducerbara celltal per hjärnhalvan och gör det möjligt att mäta flera flödescytometri paneler i en biologisk replikera. Fenotypisk karakterisering och kvantifiering av hjärnan invaderande leukocyter efter experimentell stroke kan bidra till en bättre förståelse för deras mångfacetterade roller i ischemisk skada och reparation.
Introduction
Cerebral stroke utlöser en fördröjd inflammatorisk respons som startar snabbt efter upphörande av den lokala blodflödet och involverar i stort sett alla delar av immunsystemet. Ett viktigt kännetecken för denna inflammatoriska respons är en tidsinställd inflöde av immunceller till hjärnan som drivs genom aktivering av hjärn endotelceller, väsentlig kemokin sekretion och ökad sympatisk utflöde 1-3. Inflammatorisk cellinfiltration har tidigare ansetts skadlig vid ischemisk stroke, dock flera behandlingsförsök utformade för att urskillningslöst blockera leukocyt- egress till hjärnan misslyckades med att inducera en mätbar klinisk nytta 4. På senare tid, blev det uppenbart att monocythärledda celler initialt involverade i utvecklingen av ischemisk skada 5 också kan spela en central roll för att lösa inflammation och efterföljande vävnadsreparation 6.
Tack vare identifieringen av fenotypiska och functiOnal heterogenitet bland monocyter och makrofager, har kunskapen om betydelsen av mononukleära fagocyter i utveckling och upplösning av inflammation betydligt. I möss, kan cirkulerande monocyter klassificeras i åtminstone två funktionellt distinkta underuppsättningar beroende på deras yta uttryck av lymfocytantigen 6-komplex (Ly-6C) 7. Medan Ly-6C höga'inflammatory monocytes' tydligt visat sig vara viktig för kontroll av bakterieinfektioner 8, är deras roll i steril skada mer kontroversiella. I ischemisk stroke, selektiv ablation av CCR2 + Ly-6C höga monocyter ledde hemorragisk infarkt transformation 6. Men samma experimentella tillvägagångssätt förbättrad akut funktionshinder efter intracerebral blödning 9. På liknande sätt är olika undergrupper av T-celler antas utöva antingen skadliga 10 eller skyddande åtgärder 11 i ischemisk hjärnskada, emellertid finns data controversial 12,13 och garanterar ytterligare undersökningar. Med tanke på detta ökande komplexitet, blir det tydligt att en djupare kunskap om roller de olika immunceller i ischemisk skada och reparation är avgörande för att översätta experimentella resultaten i terapier inriktade efter stroke inflammation.
Idag är den mest kraftfulla verktyg för att analysera cellulära immunsvar polychromatic flödescytometri. Den tillåter identifiering och kvantifiering av olika immuncellundergrupper vid inflammationsstället utan behov att förspänna systemet genom in vivo-märkning eller genetisk manipulering 14. Samtidig färgning av cellytemarkörer med antikroppar mot intracellulära cytokiner 15 eller transkriptionsfaktorer 16 dessutom ger information om funktionstillstånd av enskilda, fenotypiskt identifierade celler. Som en stor nackdel är enkelcellsuspensioner krävs för flödescytometriska analyser och därmed information om localization cellulära infiltrat går förlorad. Men medan histologi är idealisk för att få rumslig information är det begränsas av antalet av antikroppar som kan användas på en enda gång för att karakterisera immuncellundertyper i en viss vävnad. Idag, behövs en kombination av närvaro och frånvaro av olika ytmarkörer för att otvetydigt identifiera sällsynta immuncellundergrupper, i synnerhet de distinkta monocythärledda cellpopulationer under inflammation 17.
Här beskriver vi ett effektivt protokoll för att isolera ett stort antal leukocyter från postischemiska mushjärna med hjälp av en enkel single-layer densitetsgradient. De erhållna cellsuspensioner kan antingen analyseras genom flerdimensionell flödescytometri eller ytterligare berikas genom flödescytometrisk sortering eller immunomagnetisk val att utföra mycket specifika nedströms analyser. Metoden detaljer transcardial perfusion, avlägsnande av hjärnhalvorna, dissociation av hjärnvävnaden till en enda cell suspensioner, densitetsgradientcentrifugering för myelin borttagning liksom antikroppar färgning för flödescytometrisk analys.
Protocol
Alla djurförsök måste uppfylla enligt normer för djurvård (eg., Guide för skötsel och användning av försöksdjur som publicerats av amerikanska National Institutes of Health, NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996) och måste godkännas av lämplig statlig myndighet.
1. Beredning av reagenser
- Nedbrytningsbuffert (1 ml per halvklotet): Lös en standardiserad blandning av renade matsmältningsenzymer, t ex, Liberase med låg termolysin koncentration (TL) till en koncentration av 2U / ml i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande kalcium (Ca) och magnesium (Mg)
- Tvättbuffert med DNAs: Lös DNAs I till en koncentration av 666U / ml i HBSS (Ca / Mg-fri) innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS)
- Tvättning buffert utan DNas: HBSS (Ca / Mg-fri) innehållande 10% FCS
- Densitetsgradient medium (5 ml per halvklotet): förbereda lager isoton densitetsgradient0; medium (SIP; 100%) genom blandning av nio delar av densitetsgradient-medium med en del 1,5 M natriumklorid. Späd SIP till 25% densitet genom tillsats av en lämplig volym av HBSS (Ca / Mg-fri) innehållande 3% FCS
- Flödescytometri (FC) buffert: Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 3% FCS
2. Transient Middle Cerebral artärocklusion
OBS: Övergående arteria cerebri media ocklusion (MCAO) via intraluminal sutur tekniken utfördes såsom beskrivits tidigare 18 i 12 veckor gamla manliga C57BL / 6-möss.
- Kortfattat söva möss med 2,0% isofluran i 100% syre. Bibehålla kroppstemperaturen vid 36,5 ° C ± 0,5 ° C genom en återkopplingsstyrd uppvärmningsanordning.
- Efter ligering av den gemensamma halsartären och den yttre halspulsådern, införa ett standardiserat silikongummibelagd monofilament i den gemensamma halspulsådern och matar det till ursprunget av den mellersta cerebral artär.
- Efter 45 min avlägsna glödtråden för att tillåta reperfusion. I skenopererade djur, omedelbart dra tillbaka tråden efter täppa mitten cerebral artär för att undvika ischemi.
3. transcardial Perfusion och Brain Dissection
- Förbereda en peristaltisk perfusion pump genom nedsänkning en ände av slangen i iskall HBSS (Ca / Mg-fri). Fastställa en trubbig 23 G nål till den andra änden av perfusion röret och slå på pumpen för att fullständigt fylla slangen med HBSS (Ca / Mg-fri).
- Djupt söva mus med 4% isofluran och avliva genom COa 2 inhalering.
- Placera musen dorsalt på en dissekering ombord inbäddad i en plastbricka. Spread förgrunden och baktassarna så bred som möjligt och fixa dem på dissekering ombord med 20 G nålar.
- Ta bukhuden med en rak 1 x 2 tänder pincett och vassa iris sax för att göra en lateral snitt genom utrustningen och bukväggen och exponeralever.
- Lyft bröstbenet och incisionsfilm membranet med den trubbiga bladet skarpa / trubbiga iris sax. Fortsätt att skära sidobröstkorgen på båda sidor i caudocranial riktning. Var noga med att inte skada lungorna, hjärtat och bröstkorg artärerna.
- Lyft huden flik med en trubbig pincett och fästa den på dissekering ombord. Använd trubbig-end pincett och sax för att noggrant skilja hjärtat från bindväv.
- Håll hjärta med en trubbig ände pincett och in spetsen på den trubbiga 23G nål med den bifogade perfusion röret i toppen av den vänstra kammaren. Obs! Ta inte in nålen för långt in i den vänstra ventrikeln för att undvika skador av kammarskiljeväggen. Om det är nödvändigt, fixera kanylen på plats med en rak vassa pincett.
- Incisionsfilm det högra förmaket med skarpa iris sax och omedelbart slå på pumpen (flödeshastighet: 8-10 ml / min).
- Fortsätt perfusion tills levern visar en ljus kaffe färg (~ 30 ml HBSS). Genom helaperfusionen, noggrant undvika varje luftbubbelbildning i slangen.
- Halshugga musen med raka kirurgiska saxar precis bakom skallen. Använd iris sax för att göra en mittlinje snitt i hårbotten för att exponera skallen.
- Placera en spets skarpa iris sax i foramen Magnum och skär i sidled i skallen. Upprepa för den andra sidan.
- Använd skarpa iris sax för att noggrant klippa från samma hålighet upp mittlinjen mot näsan. Försök att hålla slutet av saxen så ytliga som möjligt för att undvika skador i hjärnan.
- Använd fin pincett för att försiktigt skala skallbenen från varje hjärnhalva. Obs: infarktvävnad kan ansluta sig till hjärnhinnorna eller skallen; se till att inte förlora hjärnvävnad på grund av oförsiktig dissektion
- Lyft hjärnan med en spatel och vassa iris sax att noggrant dissekera kraniala nervfibrer som fixerar det till skallen. Placera hjärnan i en 15 ml rör fyllt med 10 ml HBSS (+ Ca / Mg) och hålla den ärhortly på is.
4. Dissociation av hjärnvävnaden i enkelcellsuspensioner
- Försiktigt bort hjärnstammen och lillhjärnan med en ren rakblad. Använd en ren rakblad för att hemisect hjärnan och skär varje hemisfär utmed frontalplanet i tre stycken av ungefär lika storlek.
- Färs dissekerade vävnaden i varje hemisfär genom en 100 | im cellfilter med användning av kolven slutet av en 5 ml spruta. Kontinuerligt skölj cell sil med iskall HBSS (+ Ca / Mg). Lagra homogeniserade prover på is.
- Centrifugera vid 286 x g och 4 ° C under 5 min, noggrant kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 1 ml nedbrytningsbuffert och överför suspensionen till ett 2 ml rör. Inkubera suspensionen under långsam kontinuerlig rotation vid 37 ° C under 1 timme.
- Sikt cellsuspensionen genom en 70 ìm cell sil och skölj noga med 3 ml tvättbuffert innehållande DNAse följt av 15 ml DNAse-fri tvättbuffert. Centrifugera vid 286 x g och 18 ° C under 5 min och kasta bort supernatanten. Obs! Obs: Användningen av DNAs eliminerar DNA slem orsakad av cellys som kan leda till cell aggregation kompromissa cellöverlevnad.
5. densitetsgradientcentrifugering för borttagning av myelin och cellrester
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml 25% densitetsgradient-medium och pipettera suspensionen till ett 15 ml rör. Blanda noggrant genom upprepad och försiktig pipettering undvika bubbelbildning. Obs: densitetsgradient medium bör användas vid RT för att förhindra cellklumpning.
- Centrifugera vid 521 x g och 18 ° C under 20 min. Använda lägsta accelerationsprofil av rotorn och göra det möjligt för rotorn att stanna utan broms. Försiktigt bort rören från centrifugen utan skakning. Försiktigt aspirera myelin coat och supernatanten samtidigt bevara cellpelleten i botten av röret. Obs: Se till att ta bort hela myelin pälsen som alla överblivna kommer impair flödescytometrisk analys.
- Återsuspendera pelleten i 10 ml DNAse fri tvättbuffert och pipettera suspensionen till en ny 15 ml tub. Obs: Detta tvättningssteg är avgörande eftersom tillräckligt avlägsnande av densitetsgradient mediet väsentligt bidrar till kvantitet och kvalitet på det slutliga provcellen.
- Centrifugera igen vid 286 x g och 10 ° C under 5 min och kasta bort supernatanten. Resuspendera cellerna i 100 pl kall tvättbuffert och bestämma cellräkningar och livsduglighet genom trypan blå-exklusion i en hemocytometer. Förvara proverna vid 4 ° C och ytterligare bearbeta dem snabbt.
6. Antikropp Färgning för flödescytometrisk analys
- Före märkning antikropp, inkubera cellsuspensionen vid 4 ° C under 10 min med anti-murin CD16 / CD32 FC-receptorblockeringsreagens (slutlig koncentration av 2,5 | ig / ml, utspädningsfaktor 1: 200) för att förhindra ospecifik bindning.
- Lägg fluoroforen-konjugerade primära antikroppar vid enppropriate koncentration (såsom anges i tabell 1) till cellsuspensionen och inkubera vid 4 ° C under 20 minuter i mörker. Notera: Kontrollprover är inte färgas med primära antikroppar, men behandlas i övrigt.
- Tvätta cellerna med 2 ml FC-buffert och centrifugera vid 350 xg och 10 ° C under 7 min.Carefully aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 | il av FC-buffert. Förvara proverna tillfälligt vid 4 ° C i mörker tills flödescytometrisk analys.
7. absolut kvantifiering genom att räkna pärlor
- Omvänt pipettera 40 fil FC-buffert och 10 pl av cellsuspensionen i en räknings rör innehållande ett känt antal fluorescerande pärlor. Notera: Var uppmärksam att pipetter är kalibrerade för att leverera exakt 10 pl prov som efterföljande beräkning av leukocytantalet hänvisar till denna volym.
- Inkubera cellsuspensionen med FITC-märkt CD45 antikropp (slutlig koncentrationav 5 mikrogram / ml, utspädningsfaktor 1: 100) vid 4 ° C under 20 minuter i mörker.
- Omvänt fylla räknings rör med 200 | il av FC-buffert utan något tvättsteg och direkt spela in CD45 + celler i flödescytometern.
8. Flödescytometriska Acquisition
Obs! För att analysera den föreslagna antikroppen panelen har en lämplig cytometern vara utrustad med en blå (488 nm), röd (635 nm) och violett (405 nm) laser och filter för FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 och AmCyan.
- Justera framåt (FSC) och i sidled (SSC) spridning genom ofärgade celler från en ischemisk halvklotet. Diskriminera dubletter från enskilda celler i ett punktdiagram som visar området och höjd FSC.
- Visa alla enskilda celler i en enda parameter histogram för varje fluorescens kanal som används och justera fotomultiplikatorröret (PMT) spänningar så att enstaka celler visas i längst till vänster i histogrammet.
- Använd en CD45-FITC endamålat prov för att kontrollera scatter och PMT inställningar för cellerna av intresse genom bakförspänning CD45 hög immunceller i varje histogram och spridningsdiagram. Obs: Anpassa PMT spänning av FITC så att CD45 negativ, mellan (int) och höga uttryckande celler kan skiljas från varandra.
- Använd antikropps fångade ersättning pärlor att utföra flera färgkompensation. Ställa portarna för mikroglia (CD45 int) och leukocyter (CD45 hög) och därefter definiera leukocyt subpopulationer enligt grindningsstrategin som visas i figur 1.
Representative Results
Cerebral ischemi inleddes 12 veckor gamla C57BL / 6 möss via gående filament ocklusion av den vänstra mellersta cerebrala artären (MCAO). För skenoperation tråden infördes för att täppa till vänster mellersta hjärnartären och dras omedelbart för att möjliggöra omedelbar reperfusion. Viktigt skiljer cellulär neuroinflammation i huvudsak bland vanligen tillämpade stroke modeller 19. Detta måste hållas i minnet speciellt när extrapolera resultaten från djurstudier till den heterogena patofysiologin hos human stroke.
Möss avlivades 24 timmar efter MCAO att analysera tidiga immunceller invasion till den ischemiska hjärnan. Cellräkningar som erhållits från den ischemiska hemisfären (kortex ipsi, 0,95 ± 0,25 x 10E6) efter densitetsgradientcentrifugering var jämförbara med dem från kontralaterala hemisfären (kortex kontra, 1,09 ± 0,30 x 10E6) och ipsilateralahemisfär av skenopererade möss (sken ipsi, 1,12 ± 0,18 x 10E6, envägs ANOVA, p = 0,524). Livskraft isolerade celler mätt med trypanblå uteslutning var hög och skilde sig inte signifikant mellan grupperna (sken 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, Ipsi MCAO 95,68 ± 2,04%, envägs-ANOVA, p = 0,253 ).
Sammansättningen av hjärnan infiltrera 24 h efter MCAO bestämdes genom flödescytometrisk analys. Figur 1 illustrerar den grindningsstrategi schematiskt (A) och i en representativ stroke djur (B). Brain-infiltrerande leukocyter definierades som CD45 hög celler som kan differentieras från CD45 int mikroglia. Inom CD45 höga befolkningen, polymorfonukleära neutrofiler (PMN) identifieras med hjälp av Ly-6G uttryck, medan T-lymfocyter avgränsas som CD45 hög CD3 + celler. De återstående CD45 höga cellerna sedan skiljaed av CD19 (B-lymfocyter) och CD11b uttryck. CD11b + fraktionen ytterligare subcategorized i Ly-6C hög `inflammatorisk monocytes` och Ly-6C låg befolknings som omfattar monocyter, dendritiska celler (DC) och makrofager.
I det akuta skedet av stroke, myeloid immunceller dominerar hjärnan infiltrera 3,20. Neutrofiler in i hjärnan snabbt efter kärlocklusion och främja extravasering av inflammatoriska monocyter 21 Fig. 2A visar den procentuella ökningen av Ly6-G + neutrofiler i ischemiska hemisfären 24 timmar efter kortex jämfört med kontralaterala hemisfären och skenkirurgi. Däremot är andelen CD3 + T-celler i ischemiska hemisfären (relativt) lägre än i den friska hjärnan. Inom CD11b + befolkningen, skiftar balansen mot en stark övervikt av Ly-6C höga inflammatoriska monocyter (Figur hjärnischemi2B).
Förutom relativa fördelningarna, räknade rör som används för att bestämma absoluta antalet immunceller undergrupper i prover på grundval av CD45 positiva händelser (Figur 3). Räkna rör innehåller en lyofiliserad tablett som frisätter ett känt antal fluorescerande pärlor. Det absoluta antalet positiva celler i provet kan bestämmas genom att relatera cellulära händelser till vulst händelser. För att beräkna antalet CD45 höga leukocyter per halvklotet följande ekvation användes: CD45 höga celler per halvklotet = (CD45 höga händelser x total räkna pärlor / prov pärla händelser) x (fullständig befrielse volym (100 ^) / provvolym (10 ^ )). 24 timmar efter MCAO, var totalt leukocytantal i infarkthalvklotet ökat betydligt jämfört med den kontralaterala hemisfären och skenkirurgi (figur 3D, envägs ANOVA, p = 0,0004). Räkningar av den di stinct immuncellundergrupper (PMN, T-celler, B-celler, Ly-6C hög och Ly-6C låga monocyter) kan lätt beräknas genom att multiplicera deras relativa frekvensen med den totala CD45 höga leukocyt antal respektive prov.
Figur 1. Gating strategi för flödescytometri. (A) Schematisk illustration av grindstrategin. (B) visar flödescytometrisk analys av leukocyter isolerade från ett representativt mushjärna 24 h efter arteria cerebri media ocklusion. FSC framåtspridning, PMN polymorfonukleära neutrofiler, CDC klassiska dendritiska celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
Figur 2. Differentiering av immuncellundergrupper. Relativ fördelning av Ly-6G + -neutrophils (A), CD3 + T-celler (A) och monocyt delmängder som identifierats genom differentiell expression av Ly-6C (B) i den ipsilaterala (ipsi) och kontralaterala ( contra) hemisfären 24 timmar efter Middle cerebral artärocklusion (kortex) eller respektive skenoperation. Andel av varje population anges i porten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kvantifiering av Brain leukocyter genom Räkna pärlor. (A) visar den mycket dubbel positiva pärlan grind. Inom den inre cellpopulationen (B) CD45 int mikroglia kan skiljas från CD45 höga leukocyter (C). För kvantifiering antalet gated CD45 höga händelser normaliserades till de räknade pärlor händelser. Observera att den totala leukocyter (CD45 höga) räknas är signifikant ökad i ipsilaterala (ipsi) halvklotet jämfört med den kontralaterala (contra) hemisfären och skenkirurgi 24 timmar efter Middle Cerebral artärocklusion (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 genom envägs ANOVA och Tukey`s post hoc multipeljämförelser test. n = 4-6 per grupp. FSC framåtspridning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| fluorokrom | FITC | PE | PerCP | PC7 | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| Antigen | CD45.2 | CD3 | Ly-6G | CD19 | Ly-6C | CD11b |
| Slutlig koncentration [| ig / ml] | 5 | 1 | 0,2 | 0,2 | 1 | 1 |
| utspädningsfaktor | 1/100 | 1/200 | 1/1000 | 1/1000 | 1/200 | 1/200 |
| Klona | 104 | 145-2C11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | M1 / 70 |
Tabell 1. Grundläggande Antibody Cocktail för immunceller Identifiering i ischemisk hjärnan.
Discussion
Här beskriver vi en enkel och effektiv metod för isolering av leukocyter från den murina hjärnan efter experimentell stroke. Tillvägagångssättet ger ett tillförlitligt sätt mycket reproducerbara celltal per hjärnhalvan gör det möjligt att mäta olika flödespaneler i ett biologiskt replikera.
Uppenbarligen kommer en ofullständig borttagning av blod inklusive immunceller resultera i en förvrängd bild på den faktiska mängden av inflammatoriska celler som trädde den ischemiska hjärnan. Således, vid användning av detta protokoll ägna särskild uppmärksamhet åt noggrann transcardial perfusion för att förhindra kontaminering av infiltrerade immunceller med icke-inflammatoriska cirkulerande leukocyter. Av erfarenhet, minskar användningen av trubbiga nålar för vänster kammare punktering risken för skada kammarskiljeväggen som skulle kringgå perfusion av den systemiska cirkulationen. Uppkomsten av perfusionsfluid från näsborrarna är ett tecken på att perfusionen pressureis för hög, sålunda, envoid flödeshastigheter> 10 ml / min. Pale till vit färg på hjärnvävnad indikerar god perfusion medan rosa färg är ett tecken på dålig perfusion.
En annan avgörande steg i detta protokoll är effektiv dissociation av hjärnvävnad som innefattar mekanisk fragmentering samt enzymatisk spjälkning. Mals vävnaden genom cellen sil är kritisk för att åstadkomma förbättrad effektivitet av proteaser. Men när homogenisering vävnaden, undvika överdrivet tryck som mononukleära fagocyter är mycket mottagliga för autolys 22. För enzymatisk digerering Liberase TL rekommenderas som är en blandning av höggradigt renat kollagenas I och II, som innehåller låga koncentrationer av det neutrala proteaset termolysin. Den direkta jämförelse med tidigare beskrivna isoleringsprotokoll 14,22,23 avslöjade signifikant högre återställande av livskraftiga celler genom Liberase TL behandling (KM opublicerade data). Jämfört med kollagenas som ofta använderd för isolering av immunceller från hjärnan, Liberase TL innehåller försumbara nivåer av endotoxin. Detta är särskilt viktigt om celler sorteras för nedströms analys eftersom höga halter av endotoxin kan ändra aktiveringstillstånd av immunceller 24 och allvarligt försämra cellodling utfall 25. En annan nackdel med traditionella kollagenas är betydande parti till parti skillnader i enzymaktivitet som äventyrar reproducerbarhet av resultat och kräver bestämningen av arbetskoncentration för varje parti 26.
I den vuxna hjärnan, är myelin avlägsnas genom densitetsgradientcentrifugering ett nödvändigt steg för tillämpningar efter såsom flödescytometri eller fortsatta studier på gen eller proteinuttryck. En stor fördel med protokollet är densiteten förfarande enkelt lager som inte kräver tidskrävande beredning av gradienter. Dessutom producerar separationsprotokoll tillförlitligt resultatär även när de utförs av ganska oerfarna praktiker. Det saknar skiktade gradienter med densiteter som ligger nära en annan som är svåra att pipett utan att störa gränsytan däremellan.
Baserat på uttrycket av den ytmarkör CD45, ger protokollet tre huvudcellkategorierna i den ischemiska hjärnan. De allra flesta celler tillhör en CD45 negativ befolknings som består av nervceller, astroglia, ependymceller och endotelceller. Deras riklig förekomst tillskrivs den enda lager densitetsgradient som i första hand syftar till en effektiv myelin och avlägsnande av skräp. Dessutom kan en CD45 int population representerar bosatt mikroglia 27 skiljas från en CD45 hög befolkning som främst innehåller infiltrerande hematogena leukocyter. Emellertid bör det noteras att aktiverade mikroglia får anta fenotypen och funktionen av blodfödda myeloidceller. Således, bara tillämpa sophisticated tekniker såsom parabiosis 28, benmärg chimärer 29 eller ödet kartläggningsanalys 30 medger en tydlig åtskillnad mellan dessa två populationer under inflammation.
analys av data i flödescytometri är ofta begränsad till den procentuella fördelningen av specifika cellpopulationer. Men när man jämför infarkt halvklotet till icke-infarkthjärnvävnad denna information kan vara missvisande eftersom den inte anser totala hjärn leukocytantalet som ändras av ischemisk skada. Således, för att rita en fullständig bild på storleken och fenotypen av inflammatoriska infiltrat efter stroke relativa fördelningen av immuncellundergrupper bör kompletteras med absoluta cellantalen. Vid användning av mikropärlor som beskrivs i detta protokoll, är pipettering av en exakt provvolym absolut obligatoriskt att erhålla tillförlitliga resultat. Dessutom är omvänd pipettering rekommenderas för att undvika skumbildning i räkningsröret. Uppstår luftbubblorkommer att minska den förväntade volymen av mikropärlor och därmed leda till en överskattning av absoluta CD45 hög leukocyter i provet.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll en enkel och tillförlitlig metod för att isolera immunceller från hjärnan. Det kan tjäna som ett värdefullt verktyg för att dissekera komplexiteten i den inflammatoriska responsen på ischemisk stroke. Framtida tillämpningar inkluderar undersökningar på tidsberoende roll monocyt grupper i utbredning och upplösning av ischemisk hjärninflammation. På liknande sätt är den roll som det adaptiva immunsystemet efter stroke dåligt kända. Flödescytometrisk analys av T-cell subpopulationer identifierats av uttrycket av delmängd specifika transkriptionsfaktorer eller cytokiner på plats kan bidra till att klargöra deras inverkan på långsiktig återhämtning efter stroke och därmed öppna lovande vägar för utveckling av nya behandlingsmetoder.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Isabell Schulz för utmärkt teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
- Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
- Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
- Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
- Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
- Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
- Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
- Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
- Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
- Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
- Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
- Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
- Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
- Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
- Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
- Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
- McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
