Abstract
Iskæmisk slagtilfælde indleder en robust inflammatorisk reaktion, der starter i det intravaskulære rum og involverer hurtig aktivering af hjernens bosiddende celler. Et centralt mekanisme af denne inflammatoriske reaktion er migrationen af cirkulerende immunceller til den iskæmiske hjerne lettes ved chemokin frigivelse og forøget endotel adhæsionsmolekyleekspression. Brain-invaderende leukocytter velkendte bidrage til den tidlige fase sekundær iskæmisk skade, men deres betydning for opsigelse af inflammation og senere hjerne reparation er først for nylig blevet bemærket.
Her er en simpel protokol til effektiv isolering af immunceller fra iskæmisk musehjerne forudsat. Efter transcardial perfusion, er hjernehalvdele dissekeres og mekanisk dissocieret. Enzymatisk fordøjelse med Liberase efterfølges af densitetsgradient (såsom Percoll) centrifugering for at fjerne myelin og cellerester. En væsentlig fordel ved denne protokol Is tætheden gradientprocedure enkelt lag, som ikke kræver tidskrævende fremstilling af gradienter og kan måles pålideligt udføres. Tilgangen giver meget reproducerbare celletællinger pr hjernehalvdel og giver mulighed for at måle flere flowcytometri paneler i én biologisk gentagelse. Fænotypisk karakterisering og kvantificering af hjerne-invaderende leukocytter efter eksperimentel slagtilfælde kan bidrage til en bedre forståelse af deres mangesidede roller i iskæmisk skade og reparation.
Introduction
Cerebralt slagtilfælde udløser en vedvarende inflammatorisk respons, der starter hurtigt efter ophør af den lokale blodgennemstrømning og involverer stort set alle dele af immunsystemet. Et væsentligt kendetegn ved denne inflammatoriske respons er en tidsindstillet tilstrømning af immunceller til hjernen, som drives af aktiveringen af hjernens endotelceller, omfattende kemokin sekretion og øgede sympatisk udstrømning 1-3. Inflammatorisk celleinfiltration er hidtil blevet betragtet skadelig i iskæmisk slagtilfælde imidlertid adskillige behandlingsforsøg formål at ukritisk blokere leukocyt egress til hjernen inducerede ikke et måleligt klinisk fordel 4. For nylig blev det klart, at monocyt-afledte celler oprindeligt involveret i progression af iskæmisk skade 5 også kan spille en central rolle for løsning af inflammation og efterfølgende vævsreparation 6.
Takket være identifikation af fænotypiske og functional heterogenitet blandt monocytter og makrofager har viden om betydningen af mononukleære fagocytter i udvikling og løsning af inflammation væsentligt udvidet. Hos mus, kan cirkulerende monocytter inddeles i mindst to funktionelt forskellige undergrupper efter deres overflade ekspression af lymfocyt antigen 6-kompleks (Ly-6C) 7. Mens Ly-6C høje'inflammatory monocytes' blev klart vist sig at være af afgørende betydning for kontrollen med bakterieinfektioner 8, deres rolle i sterilt skade er mere kontroversiel. I iskæmisk slagtilfælde, selektiv ablation af CCR2 + Ly-6C høje monocytter resulterede i blødende infarkt transformation 6. Men den samme eksperimentelle tilgang forbedret akut handicap efter intracerebral blødning 9. Tilsvarende er forskellige delgrupper i T-celler antages at udøve enten skadelige 10 eller beskyttelsesforanstaltninger 11 i iskæmisk hjerneskade, men data er controversial 12,13 og garanterer yderligere undersøgelser. På baggrund af denne stigende kompleksitet, bliver det klart, at dybere viden om, hvilke roller de forskellige immunceller i iskæmisk skade og reparation er afgørende for at oversætte eksperimentelle resultater i behandlingsformer rettet indlæg slagtilfælde inflammation.
I dag, den mest kraftfulde værktøj til at analysere cellulære immunreaktioner er polykromatisk flowcytometri. Det muliggør identifikation og kvantificering af forskellige immuncelleundergrupper ved stedet for inflammation uden behov for at forspænde systemet ved in vivo-mærkning eller genetisk manipulation 14. Samtidig farvning af celleoverflademarkører med antistoffer mod intracellulære cytokiner 15 eller transskription faktorer 16 derudover giver oplysninger om den funktionelle tilstand af individuelle, fænotypisk identificerede celler. Som en væsentlig ulempe, er enkeltcellesuspensioner kræves til flowcytometriske assays og dermed information om localization af cellulære infiltrater er tabt. Men mens histologi er ideel til at opnå geografisk information, er det begrænset af antallet af antistoffer, som kan anvendes på et enkelt tidspunkt at karakterisere immuncellepopulationer undertyper i et bestemt væv. Dag, er en kombination af nærvær og fravær af forskellige overflademarkører nødvendige til entydigt at identificere sjældne immuncelleundergrupper, især de forskellige monocytafledte cellepopulationer under inflammation 17.
Her beskriver vi en effektiv protokol til isolering høje antal leukocytter fra postiskæmisk musehjerne hjælp af en simpel single-layer densitetsgradient. De opnåede cellesuspensioner kan enten analyseres ved flerdimensional flowcytometri eller yderligere beriges ved flowcytometrisk sortering eller immunomagnetisk udvælgelse til at udføre meget specifikke downstream analyser. Metoden detaljer transcardial perfusion, fjernelse af hjernehalvdele, dissociation af hjernevæv i enkelt celle suspension, densitetsgradientcentrifugering for myelin fjernelse samt antistoffarvning til flowcytometrisk analyse.
Protocol
Alle dyreforsøg skal overholde ifølge standarder for dyrs pleje (f.eks., Vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr offentliggjort af det amerikanske National Institutes of Health, NIH publikation nr 85-23, revideret 1996), og skal godkendes af den relevante statslige myndighed.
1. Fremstilling af reagenser
- Digestionspuffer (1 ml pr halvkugle): Opløs en standardiseret blanding af oprensede fordøjelsesenzymer, f.eks, Liberase med lav thermolysin fusion (TL) til en koncentration på 2U / ml i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) indeholdende calcium (Ca) og magnesium (Mg)
- Vaskebuffer med DNAse: Opløs DNAse I til en koncentration på 666U / ml i HBSS (Ca / Mg free) indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS)
- Vaskebuffer uden DNAse: HBSS (Ca / Mg free) indeholdende 10% FCS
- Density gradient medium (5 ml pr halvkugle): forberede lager isotonisk densitetsgradient0; medium (SIP 100%) ved blanding ni dele densitetsgradient-medium med en del 1,5 M natriumchlorid. Fortynd SIP til 25% densitet ved tilsætning af et passende volumen af HBSS (Ca / Mg free) indeholdende 3% FCS
- Flowcytometri (FC) buffer: Forbered phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 3% FCS
2. Forbigående mellem-cerebral arterieokklusion
BEMÆRK: Forbigående mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) via intraluminale sutur teknik blev udført som tidligere beskrevet 18 i 12 uger gamle C57BL / 6 mus.
- Kort fortalt, bedøver mus med 2,0% isofluran i 100% oxygen. Opretholde kroppens temperatur ved 36,5 ° C ± 0,5 ° C ved en tilbagemelding-kontrolleret opvarmning enhed.
- Efter ligering af den fælles carotidarterie og den ydre carotidarterie, indføre et standardiseret silicium-gummibelagt monofilament i den fælles halspulsåre og føre det til oprindelsen af den midterste cerebral arterie.
- Efter 45 min fjernes glødetråden for at tillade reperfusion. I sham-opererede dyr, straks trække glødetråden efter okklusion arteria cerebri media at undgå iskæmi.
3. Transcardial Perfusion og Brain Dissection
- Forbered en peristaltisk pumpe perfusion ved nedsænkning ene ende af slangen i iskold HBSS (Ca / Mg free). Fastsætte en stump 23 G nål til den anden ende af perfusion rør og tænd for pumpen at fylde slangen med HBSS (Ca / Mg free).
- Dybt bedøver mus med 4% isofluran og aflive ved CO2 inhalation.
- Placer musen dorsalt på en dissektion bord indlejret i en plastbakke. Spread forgrunden og bagpoterne så brede som muligt og løse dem på dissektion bord med 20 G kanyler.
- Grab abdominal hud med en straight 1 x 2 tænder pincet og bruge skarpe iris saks til at foretage en sideværts snit gennem integument og bugvæggen og blotlæggelever.
- Løft brystbenet og incise membranen med den stumpe klinge skarpe / stumpe iris saks. Fortsæt med at skære den laterale brystkassen ved begge sider i caudocranial retning. Pas på ikke at skade lungerne, hjertet og thorax arterier.
- Løft huden klap med en stump pincet og pin det på dissektion bord. Brug stumpendet pincet og saks til omhyggeligt adskille hjertet mod bindevæv.
- Hold hjerte med en stump-end pincet og spidsen af den stumpe 23 G nål med vedlagte perfusion røret i spidsen af den venstre ventrikel. Bemærk: Du må ikke indsætte nålen for langt ind i venstre ventrikel for at undgå skade af interventrikulære septum. Hvis det er nødvendigt, fastsætte kanylen på plads med en lige skarpe pincet.
- Incise højre atrium med skarpe iris saks og straks tænde pumpen (strømningshastighed: 8 - 10 ml / min).
- Fortsæt perfusion indtil leveren viser en lys kaffe farve (~ 30 ml HBSS). Hele vejen igennemperfusionen, omhyggeligt undgå enhver luftboble dannelse i slangen.
- Halshugge musen med lige kirurgiske sakse lige bag kraniet. Brug iris saks til at gøre en midtlinjeincision i hovedbunden for at blotlægge kraniet.
- Placer en spids af skarpe iris saks ind i foramen magnum og skæres sideværts ind i kraniet. Gentag for den anden side.
- Brug skarpe iris saks til omhyggeligt skåret fra samme hulrum op midterlinjen mod næsen. Forsøge at holde enden af saksen så overfladiske som muligt for at undgå skade på hjernen.
- Brug fine pincet til forsigtigt skrælle de kranieknogler fra hver hjernehalvdel. Bemærk: infarkt væv kan holde sig til meninges eller kraniet; Sørg for ikke at miste hjernevæv på grund af uforsigtig dissektion
- Løft hjerne med en spatel og bruge skarpe iris saks til omhyggeligt dissekere kranienerver fibre, der fastgør det til kraniet. Placer hjernen i et 15 ml rør fyldt med 10 ml HBSS (+ Ca / Mg) og holde det shortly på is.
4. Dissociation af hjernevæv i enkeltcellesuspensioner
- Fjern forsigtigt hjernestammen og cerebellum med en ren barberblad. Brug en ren barberblad til hemisect hjernen og skær hver halvkugle langs koronale plan i tre stykker af nogenlunde samme størrelse.
- Mince dissekerede væv af hver halvkugle gennem en 100 um cellefilter hjælp af stempelstangsenden af en 5 ml sprøjte. Kontinuerligt skylles cellesigte med iskold HBSS (+ Ca / Mg). Opbevar homogeniserede prøver på is.
- Der centrifugeres ved 286 xg og 4 ° C i 5 minutter, omhyggeligt supernatanten. Pellet resuspenderes i 1 ml spaltningsbuffer og overfør suspensionen til et 2 ml rør. Inkuber suspension under langsom kontinuerlig rotation ved 37 ° C i 1 time.
- Sieve cellesuspension gennem en 70 um cellefilter og skylles grundigt med 3 ml vaskepuffer indeholdende DNAse efterfulgt af 15 ml DNAse-fri vaskebuffer. Centrifuger ved 286 xg og 18 ° C i 5 min og kassér supernatanten. Bemærk: Bemærk: Brugen af DNAse eliminerer DNA slim forårsaget af cellelysis som kan føre til celle sammenlægning kompromittere celle overlevelse.
5. densitetsgradientcentrifugering til fjernelse af myelin og cellerester
- Resuspender cellepelleten i 5 ml 25% densitetsgradient-medium og pipetteres suspensionen til et 15 ml rør. Bland grundigt ved gentagen og blid pipettering undgå bobledannelse. Bemærk: densitetsgradient medium bør anvendes ved stuetemperatur for at forhindre celle sammenklumpning.
- Der centrifugeres ved 521 xg og 18 ° C i 20 min. Brug laveste acceleration profil af rotoren og tillade rotoren at stoppe uden bremse. Fjern forsigtigt rørene fra centrifugen uden at ryste. aspireres forsigtigt myelin pels og supernatanten samtidig bevare cellepelleten ved bunden af røret. Bemærk: Sørg for at fjerne hele myelin frakke som alle rester vil impair flowcytometrisk analyse.
- Pellet resuspenderes i 10 ml DNAse fri vaskebuffer og pipette suspensionen til et nyt 15 ml rør. Bemærk: Dette vasketrin er afgørende, da tilstrækkelig fjernelse af densitetsgradient-medium bidrager væsentligt til mængden og kvaliteten af det endelige celleprøve.
- Centrifuge igen ved 286 xg og 10 ° C i 5 min og kassér supernatanten. Resuspender celler i 100 ul kold vaskebuffer og bestemme celletal og levedygtighed ved trypanblåteksklusion i et hæmocytometer. Opbevar prøverne ved 4 ° C og videre proces dem hurtigt.
6. Antistof Farvning for flowcytometrisk analyse
- Før antistofmærkning, inkuber cellesuspensionen ved 4 ° C i 10 minutter med anti-murint CD16 / CD32 FC-receptor-blokerende reagens (slutkoncentration på 2,5 ug / ml, fortyndingsfaktoren 1: 200) for at forhindre uspecifik binding.
- Tilføj fluorofor-konjugeret primære antistoffer ved enppropriate koncentration (som angivet i tabel 1) til cellesuspensionen og inkuberes ved 4 ° C i 20 minutter i mørke. Bemærk: Kontrolprøver ikke farvet med primære antistoffer, men ellers behandles ens.
- Vask cellerne med 2 ml FC buffer og centrifuger ved 350 xg og 10 ° C i 7 min.Carefully aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 pi FC buffer. Opbevar prøver midlertidigt ved 4 ° C i mørke, indtil flowcytometrisk analyse.
7. Absolut Kvantificering ved Counting perler
- Omvendt pipetten 40 pi FC puffer og 10 pi af cellesuspensionen i en tællende rør indeholdende et kendt antal fluorescerende kugler. Bemærk: Vær opmærksom på at pipetter er kalibreret til at levere præcis 10 ul prøve som efterfølgende beregning af leukocyttallet henviser til denne mængde.
- Inkuber cellesuspension med FITC-mærket CD45-antistof (slutkoncentrationaf 5 ug / ml, fortynding faktor 1: 100) ved 4 ° C i 20 minutter i mørke.
- Omvendt fylde optælling rør med 200 pi FC buffer uden vask skridt og direkte optage CD45 + celler i flowcytometeret.
8. Flowcytometrisk Acquisition
Bemærk: For at analysere den foreslåede antistof panel, det passende cytometret har at være udstyret med en blå (488 nm), rød (635 nm) og violet (405 nm) laser og filtre til FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 og AmCyan.
- Juster fremad (FSC) og til siden (SSC) spredning ved hjælp af ufarvede celler fra en iskæmisk hemisfære. Diskriminere dubletter fra enkelte celler i et dot-plot, der viser området og højden af FSC.
- Vis alle enkelte celler i en enkelt parameter histogrammer for hver fluorescens kanal, der bruges, og juster fotomultiplikatorrør (PMT) spændinger, så enkelte celler vises i længst til venstre i histogrammet.
- Brug en CD45-FITC enkeltfarves prøve at tjekke scatter og PMT indstillinger til cellerne af interesse ved backgating CD45 høje immunceller i hvert histogram og scatter plot. Bemærk: Adapt PMT spændinger på FITC så CD45 negativ, mellemprodukt (int) og høje udtrykkende celler kan skelnes fra hinanden.
- Brug antistof fanget kompensation perler til at udføre flerfarvede kompensation. Set gates for mikroglia (CD45 int) og leukocytter (CD45 høj) og efterfølgende definere leukocytsubpopulationer ifølge gating strategi vist i figur 1.
Representative Results
Cerebral iskæmi blev initieret i 12 uger gamle C57BL / 6-mus via forbigående filament okklusion af den venstre midterste cerebrale arterie (MCAO). For fingeret operation filamentet blev indsat for at lukke venstre midterste cerebrale arterie og trækkes straks at tillade øjeblikkelig reperfusion. Vigtigere, cellulære neuroinflammation afviger væsentligt blandt almindeligt anvendte slagtilfælde modeller 19. Dette skal holdes for øje, især når ekstrapolere resultaterne fra dyrestudier til den heterogene patofysiologien af humant slagtilfælde.
Mus blev aflivet 24 timer efter MCAO at analysere tidlig immuncelle invasion til den iskæmiske hjerne. Celletællinger opnået fra den iskæmiske hemisfære (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) efter densitetsgradientcentrifugering var sammenlignelige med dem fra den kontralaterale hemisfære (MCAO kontraindikationer; 1,09 ± 0,30 x 10E6) og den ipsilateralehalvkugle af sham-opererede mus (fingeret ipsi; 1,12 ± 0,18 x 10E6, envejs ANOVA, p = 0,524). Levedygtighed af de isolerede celler målt ved trypanblåteksklusion var høj og ikke signifikant forskellig mellem grupperne (fingeret 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, MCAO ipsi 95,68 ± 2,04%, en-vejs-ANOVA, p = 0,253 ).
Sammensætningen af hjernen infiltrere 24 timer efter MCAO blev bestemt ved flow-cytometrisk analyse. Figur 1 illustrerer gating strategi skematisk (A) og i et repræsentativt slagtilfælde dyr (B). Brain-infiltrerende leukocytter blev defineret som CD45 høje celler, der kan differentieres fra CD45 int mikroglia. Inden for CD45 stor befolkning, blev polymorfonukleære neutrofiler (PMN) identificeret ved Ly-6G udtryk, mens T-lymfocytter blev afgrænset som CD45 høj CD3 + celler. De resterende CD45 høje celler blev derefter skelneed af CD19 (B-lymfocytter) og CD11b-ekspression. CD11b + fraktionen blev yderligere subcategorized i Ly-6C høj `inflammatorisk monocytes` og et Ly-6C lav befolkningstæthed, der omfatter monocytter, dendritiske celler (DC) og makrofager.
I den akutte fase af slagtilfælde, myeloide immunceller dominerer hjernen infiltrere 3,20. Neutrofiler ind i hjernen hurtigt efter fartøj okklusion og fremme ekstravasation af inflammatoriske monocytter 21. Figur 2A viser den procentvise stigning af Ly6-G + neutrofiler i den iskæmiske hemisfære 24 timer efter MCAO sammenlignet med den kontralaterale hemisfære og sham kirurgi. Derimod er andelen af CD3 + T-celler i den iskæmiske hemisfære er (relativt) lavere end i sund hjerne. Inden for CD11b + populationen, hjerneiskæmi forrykker balancen hen imod en stærk overvægt af Ly-6C høje inflammatoriske monocytter (figur2B).
Ud over relative fordelinger, regnede rør anvendt til at bestemme det absolutte antal immuncelleundergrupper i prøver på grundlag af CD45 positive begivenheder (figur 3). Counting rør indeholder en lyofiliseret pellet som frigiver et kendt antal fluorescerende kugler. Det absolutte antal positive celler i prøven kan bestemmes ved at relatere cellulære begivenheder til at perle begivenheder. For at beregne antallet af CD45 høje leukocytter pr halvkugle følgende ligning blev anvendt: CD45 høje celler pr halvkugle = (CD45 høje begivenheder x total optælling perler / prøve perle hændelser) x (total suspension volumen (100 pi) / prøvevolumen (10 pi )). 24 timer efter MCAO, blev de samlede leukocyttallet i infarkt halvkugle signifikant forøget sammenlignet med den kontralaterale hemisfære og skinkirurgi (figur 3D, envejs ANOVA, p = 0,0004). Tællinger af di stinct immuncelleundergrupper (PMN, T-celler, B-celler, Ly-6C høj og Ly-6C lave monocytter) kan let beregnes ved at multiplicere deres relative hyppighed og den samlede CD45 høj leukocyt nummer af den respektive prøve.
Figur 1. Gating strategi for flowcytometri. (A) Skematisk illustration af gating-strategi. (B) viser flowcytometrisk analyse af leukocytter isoleret fra en repræsentativ musehjerne 24 timer efter mellem-cerebral arterieokklusion. FSC forward scatter, PMN polymorfonukleære neutrofiler, CDC klassiske dendritiske celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
ftp_upload / 53.658 / 53658fig2.jpg "/>
Figur 2. Differentiering af immuncelleundergrupper. Relativ fordeling af Ly-6G + -neutrophils (A), CD3 + T-celler (A) og monocyt delmængder identificeret ved differentiel ekspression af Ly-6C (B) i den ipsilaterale (ipsi) og kontralaterale ( contra) halvkugle 24 timer efter mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) eller et respektivt sham operation. Procentdel af hver population er angivet i gaten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kvantificering af Brain leukocytter ved at tælle perler. (A) viser den meget dobbelt-positive perle gate. I det indre cellepopulation (B) CD45 int mikroglia kan differentieres fra CD45 høje leukocytter (C). Til kvantificering, antallet af gated CD45 høje begivenheder blev normaliseret til de optalte perlehændelser. Bemærk, at den samlede leukocyt (CD45 høj) tæller øges betydeligt i ipsilaterale (ipsi) hemisfære sammenlignet med den kontralaterale (contra) halvkugle og sham kirurgi 24 timer efter midterste cerebral arterie okklusion (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 ved envejs ANOVA og post hoc Tukey`s multiple sammenligninger test. n = 4 - 6 per gruppe. FSC fremad scatter. Klik her for at se en større version af dette tal.
| fluorokrom | FITC | PE | PerCP | PC7 | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| Antigen | CD45,2 | CD3 | Ly-6G | CD19 | Ly-6C | CD11b |
| Slutkoncentration [pg / ml] | 5 | 1 | 0.2 | 0.2 | 1 | 1 |
| fortyndingsfaktor | 1/100 | 1/200 | 1 / 1.000 | 1 / 1.000 | 1/200 | 1/200 |
| Klon | 104 | 145-2C11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | M1 / 70 |
Tabel 1. Grundlæggende Antibody Cocktail for Immun Cell Identifikation i iskæmisk Brain.
Discussion
Her beskriver vi en enkel og effektiv fremgangsmåde til isolering af leukocytter fra den murine hjernen efter eksperimentel slagtilfælde. Tilgangen pålideligt giver meget reproducerbare celletællinger pr hjernehalvdel gør det muligt at måle forskellige flow paneler i én biologisk gentagelse.
Tilsyneladende vil en ufuldstændig fjernelse af blod, herunder immunceller resultere i et forvrænget syn på den faktiske mængde af inflammatoriske celler, der trådte den iskæmiske hjerne. Således når du bruger denne protokol være særlig opmærksom på grundig transcardial perfusion at forhindre forurening af infiltrerede immunceller med ikke-inflammatoriske cirkulerende leukocytter. Af erfaring, brugen af stumpe nåle til venstre ventrikel punktering reducerer risikoen for beskadigelse af interventrikulære septum som ville omgå perfusion af den systemiske cirkulation. Fremkomst af perfusion fluid fra næseborene er et tegn på, at perfusionen pressureis for høj, dermed envoid strømningshastigheder> 10 ml / min. Bleg til hvid farve af hjernevæv indikerer god perfusion mens rødlig farve er et tegn på dårlig perfusion.
En anden afgørende skridt i denne protokol er effektiv dissociation af hjernevæv, der omfatter mekanisk fragmentering samt enzymatisk fordøjelse. Hakning vævet gennem cellesigte er kritisk at tilvejebringe forbedret effektivitet af proteaser. Men når homogenisering af væv, undgå overdreven tryk som mononukleære fagocytter er meget modtagelige for autolyse 22. For enzymatisk fordøjelse Liberase TL anbefales som er en blanding af stærkt oprenset collagenase I og II, der indeholder lave koncentrationer af den neutrale protease thermolysin. Den direkte sammenligning med tidligere beskrevne isolation protokoller 14,22,23 afslørede signifikant højere genvinding af levedygtige celler ved Liberase TL behandling (KM upublicerede data). Sammenlignet med collagenase som ofte brugerd til isolering af immunceller fra hjernen, indeholder Liberase TL ubetydelige niveauer af endotoxin. Dette er af særlig betydning, hvis celler er sorteret til nedstrøms analyse, fordi høje niveauer af endotoxin kan ændre aktiveringen tilstand af immunceller 24 og alvorligt forringe cellekultur resultater 25. En anden ulempe ved traditionel collagenase er betydelige masse-til-masse forskelle i enzymaktiviteterne der truer reproducerbarhed af resultater og kræver bestemmelse af arbejder koncentration for hvert parti 26.
I den voksne hjerne, myelin fjernelse ved densitetsgradientcentrifugering er et nødvendigt skridt for efterfølgende anvendelser såsom flowcytometri eller yderligere undersøgelser af gen eller protein ekspression. En væsentlig fordel ved protokollen er massefylden procedure enkelt lag, som ikke kræver tidskrævende fremstilling af gradienter. Desuden adskillelsen protokollen producerer pålideligt resultats selv når udført af temmelig uerfarne eksperimentatorer. Det er blottet for lagdelte gradienter med tætheder tæt på hinanden, der er vanskelige at pipette uden at forstyrre grænsefladen i mellem.
Baseret på ekspressionen af overflademarkør CD45, protokollen giver tre store celle kategorier i den iskæmiske hjerne. Langt størstedelen af celler tilhører en CD45 negativ population, der er sammensat af neuronale celler, astroglia, ependymale og endotelceller. Deres rigelige tilstedeværelse tilskrives den enkelt lag densitetsgradient som primært sigter mod effektiv myelin og vragrester fjernelse. Derudover kan en CD45 int befolkning repræsenterer resident mikroglia 27 differentieres fra en CD45 stor befolkning, der primært indeholder infiltrerende hæmatogene leukocytter. Imidlertid bør det bemærkes, at aktiverede mikroglia kan vedtage fænotype og funktion af blodbårne myeloide celler. Således er det kun at anvende sofistikeretd teknikker såsom parabiosis 28, knoglemarv kimærer 29 eller skæbne mapping analyse 30 tillader en klar sondring mellem de to populationer under inflammation.
Dataanalyse i flowcytometri er ofte begrænset til den procentvise fordeling af specifikke cellepopulationer. Men når man sammenligner infarkt halvkugle til ikke-infarkt hjernevæv disse oplysninger kan være misvisende, fordi det ikke anser totale hjerne leukocyttallet, der er ændret af iskæmisk skade. Således at tegne et fuldstændigt billede af størrelsen og fænotype af inflammatoriske infiltrater efter slagtilfælde relative fordeling af immuncelleundergrupper bør suppleres med absolutte celletal. Ved brug af mikrokugler som beskrevet i denne protokol, pipettering af en præcis prøvevolumen er absolut obligatorisk for at opnå pålidelige resultater. Endvidere er omvendt pipettering stærkt anbefales at undgå skumdannelse i optællingen røret. Opstår luftboblervil reducere den forventede mængde af mikrokugler og dermed føre til en overvurdering af absolutte CD45 høj leukocyttallet i prøven.
Sammenfattende er dette protokol giver en nem og pålidelig fremgangsmåde til isolering immunceller fra hjernen. Det kan tjene som et værdifuldt redskab til at dissekere kompleksiteten af den inflammatoriske respons på iskæmisk slagtilfælde. Fremtidige applikationer omfatter undersøgelser af den tidsafhængige rolle monocyt delmængder i formering og løsning af iskæmisk hjernebetændelse. Tilsvarende er den rolle, det adaptive immunsystem efter slagtilfælde dårligt forstået. Flow cytometri af T-celle subpopulationer identificeret ved ekspression af subset-specifikke transkriptionsfaktorer eller cytokiner i stedet kan bidrage til at afklare deres indvirkning på langsigtet genopretning efter slagtilfælde og dermed åbne lovende muligheder for udvikling af nye behandlingsmetoder.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Isabell Schulz for fremragende teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
- Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
- Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
- Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
- Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
- Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
- Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
- Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
- Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
- Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
- Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
- Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
- Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
- Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
- Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
- Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
- McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
