Abstract
Ишемический инсульт может инициировать надежную воспалительную реакцию, которая начинается в внутрисосудистого отсека и включает быструю активацию резидентных клеток мозга. Ключевой механизм этого воспалительного ответа является миграция циркулирующих иммунных клеток к ишемии мозга при посредничестве выпуска хемокинов и повышенной экспрессии молекул эндотелиальной адгезии. Мозговые-вторжение лейкоциты известный вклад в ранней стадии вторичного ишемического повреждения, но их значение для прекращения воспаления и последующего ремонта мозга лишь недавно было замечено.
Здесь, простой протокол для эффективного выделения клеток иммунной от ишемической мозга мыши предусмотрен. После transcardial перфузии, полушарий мозга расчленены и механически диссоциированных. Переваривание ферментом с Liberase следуют градиента плотности (например, перколлом) центрифугирования для удаления миелина и клеточного дебриса. Одно из главных преимуществ этой протокола IS процедура градиент плотности однослойного который не требует больших затрат времени подготовку градиентов и может быть надежно выполнена. Подход дает высокую воспроизводимость подсчитанных клеток на полушарии головного мозга и позволяет для измерения несколько проточной цитометрии панелей в одной биологической репликации. Фенотипическая характеристика и количественное определение мозговых вторжения лейкоцитов после экспериментального инсульта может способствовать лучшему пониманию их многогранных ролей в ишемическом повреждении и ремонта.
Introduction
Церебральный инсульт вызывает устойчивый воспалительную реакцию, которая начинается быстро после прекращения местного кровотока и включает практически все части иммунной системы. Один важный признак этой воспалительной реакции является приурочен приток иммунных клеток в мозг, который приводится в действие активации эндотелиальных клеток головного мозга, существенной секреции хемокинов и повышенных симпатической нервной 1-3. Инфильтрация воспалительных клеток Ранее считалось вредным при ишемическом инсульте, однако, несколько клинических наблюдений, предназначенные для разбора блокировать лейкоцитов EGRESS в мозг не способны индуцировать измеримую клиническую пользу 4. Совсем недавно, стало очевидно, что из моноцитов клетки изначально вовлеченные в прогрессирования ишемического повреждения 5 также может играть ключевую роль для разрешения воспаления и последующего восстановления тканей 6.
Благодаря идентификации фенотипических и functiнальных неоднородность моноцитов и макрофагов, знание о роли мононуклеарных фагоцитов в развитии и разрешении воспаления значительно расширен. У мышей, циркулирующие моноциты могут быть классифицированы на по меньшей мере двух функционально различных подмножеств в зависимости от их поверхностной экспрессии лимфоцитов антиген 6 комплекса (Ly-6C) 7. В то время как Ly-6C высокие'inflammatory monocytes' были четко показано, что важно для контроля бактериальных инфекций 8, их роль в стерильной травмы является более спорным. В ишемического инсульта, селективный абляция CCR2 + Ly-6С высоких моноцитов в результате геморрагического инфаркта трансформации 6. Тем не менее, тот же экспериментальный подход улучшилось острый инвалидность после внутримозгового кровоизлияния 9. Кроме того, различные подмножества Т-клеток, как полагают, оказывают либо вредным 10 или защитных действий 11 в ишемической мозговой травмой, однако, данные controversiаль 12,13 и требует дальнейшего исследования. Учитывая эту возрастающую сложность, становится ясно, что глубокое знание о роли разнообразных иммунных клеток в ишемическом повреждении и ремонта имеет решающее значение для перевода экспериментальные данные в терапии, направленных воспаление после инсульта.
На сегодняшний день наиболее мощным инструментом для анализа клеточных иммунных ответов является полихроматическая проточной цитометрии. Это позволяет выявлять и количественно различных подмножеств иммунных клеток в месте воспаления без необходимости смещения системы путем маркировки в естественных или генетических манипуляций 14. Одновременное окрашивание маркеров клеточной поверхности с антителами против внутриклеточных цитокинов 15 или транскрипционных факторов 16 дополнительно содержит информацию о функциональном состоянии отдельных, фенотипически выявленных клеток. Как один большой недостаток, одноклеточные суспензии требуются для проточной цитометрии анализах и, таким образом информация о локомотивзация из клеточных инфильтратов теряется. Тем не менее, в то время как гистологическое идеально, чтобы получить пространственную информацию, оно ограничено количеством антител, которые могут быть использованы за один раз, чтобы охарактеризовать подтипы иммунные клетки в определенной ткани. Сегодня комбинация присутствии и в отсутствие различных поверхностных маркеров необходим для однозначной идентификации редких подмножества иммунных клеток, особенно отчетливые клеточные популяции моноцитов во время воспаления 17.
Здесь мы описываем эффективный протокол, чтобы изолировать большое число лейкоцитов из постишемический мозга мыши, используя простой однослойный градиент плотности. Полученные клеточные суспензии могут быть либо анализировали многомерного проточной цитометрии или дополнительно обогащен сортировки проточной цитометрии или иммуномагнитного отбора на выполнение сугубо специфические нижестоящие анализы. Способ детали transcardial перфузии, удаление полушарий головного мозга, диссоциация мозговой ткани в отдельных клеток SUSPensions, центрифугирования в градиенте плотности для удаления миелина, а также окрашивание антитела для проточной цитометрии анализа.
Protocol
Все эксперименты на животных должны соответствовать согласно стандартам для ухода за животными (например., Руководство по уходу и использованию лабораторных животных опубликованных Национальными Институтами Здоровья, публикации NIH No. 85-23, пересмотренная 1996) и должны быть одобрены соответствующим государственным органом.
1. Подготовка реагентов
- Переваривание буфера (1 мл на полусфере): Растворить стандартизированный смесь очищенных пищеварительных ферментов, например, Liberase с низкой концентрацией термолизин (TL) до концентрации 2U / мл в Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), содержащего кальций (Ca) и магния (Mg)
- Промывочный буфер с ДНКазой: Растворить ДНКазы I до концентрации 666U / мл в HBSS (Са / Mg свободный), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS)
- Промывочным буфером без ДНКазы: HBSS (Са / Mg свободный), содержащий 10% FCS
- Плотность градиент среда (5 мл на полушарии): подготовить фондовый изотонический градиент плотности0; средний (SIP; 100%) путем смешивания девяти частей градиента плотности среды с одной стороны 1,5 М хлорида натрия. Развести SIP к плотности 25% путем добавления (свободный Ca / Mg) соответствующий объем HBSS, содержащего 3% FCS
- Проточной цитометрии (FC) буфер: Подготовка фосфатно-солевом буферном (PBS), содержащем 3% FCS
2. Переходный средней мозговой артерии Окклюзия
Примечание: Переходный окклюзия средней мозговой артерии (МСАО) с помощью внутрипросветного техники шовного проводили, как описано ранее 18 в 12-ти недельных самцов мышей C57BL / 6.
- Вкратце, обезболить мышей с 2,0% изофлуран в 100% кислорода. Поддерживать температуру тела на 36,5 ° С ± 0,5 ° C с помощью нагревательного устройства обратной связи контролируемых.
- После перевязки общей сонной артерии и наружной сонной артерии, ввести стандартизированную мононити покрытием кремния резиновый в общей сонной артерии и продвигать его в начало координат срединной Cerebral артерии.
- Через 45 мин снять нить, чтобы позволить реперфузии. В ложнооперированными животных, немедленно вывести нить после окклюзии средней мозговой артерии, чтобы избежать ишемии.
3. Transcardial перфузии и мозг Препарирование
- Подготовьте перистальтического насоса перфузии путем погружения одного конца трубки в ледяную HBSS (Са / Mg свободный). Устранить тупой 23 г иглу к другому концу перфузии трубки и включите насос, чтобы полностью заполнить трубопровод с HBSS (Са / Mg свободный).
- Глубоко обезболить мышь с 4% изофлуран и эвтаназии путем ингаляции СО 2.
- Поместите мыши дорсально на рассечение борту встроенные в пластиковый лоток. Распространение передних и задних лап как можно шире и исправить их на рассечение борту с 20 г хвои.
- Захватите кожу с брюшка с прямым 1 Х 2 зубов щипцами и использовать острые диафрагмой ножницы сделать боковой надрез через покровы и брюшную стенку и подвергатьПечень.
- Поднимите грудины и надрезать диафрагму с тупым лезвием острых / тупыми ириса ножницами. Продолжить, чтобы сократить боковой грудную клетку с обеих сторон в caudocranial направлении. Будьте осторожны, чтобы не повредить легкие, сердце и грудной артерии.
- Поднимите кожный лоскут с тупым пинцетом и закрепить его на вскрытии борту. Используйте тупым концом щипцов и ножниц тщательно отделить сердце от соединительной ткани.
- Удерживая сердца с тупым концом щипцов и вставьте кончик тупой 23 G иглы с прикрепленным перфузии трубки в верхушке левого желудочка. Примечание: Не вводить иглу слишком далеко в левый желудочек, чтобы избежать травм межжелудочковой перегородки. При необходимости, исправить канюли в месте с прямыми острыми щипцами.
- Надрезать правое предсердие с острыми ножницами ириса и немедленно включить насос (скорость потока: 8 - 10 мл / мин).
- Продолжить перфузии до печень не показан светлый цвет кофе (~ 30 мл HBSS). На протяженииперфузии, тщательно избегать любых образования пузырьков воздуха в трубки.
- Обезглавьте мышь с прямыми хирургическими ножницами прямо за черепом. Используйте диафрагмы ножницы, чтобы сделать срединный разрез кожи головы, чтобы подвергать черепа.
- Поместите один кончик острыми ножницами ириса в затылочного отверстия и нарезать в боковом направлении черепа. Повторите для другой стороны.
- Используйте острые ножницы радужной оболочки, чтобы аккуратно вырезать из того же полости до средней линии к носу. Старайтесь, чтобы конец ножниц в поверхностных, насколько это возможно, чтобы избежать травм головного мозга.
- Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно очистить кости черепа от каждого полушария мозга. Примечание: инфарктом ткань может придерживаться мозговых оболочек или черепа; убедитесь, чтобы не потерять ткани мозга из неосторожном вскрытии
- Поднимите мозг с помощью шпателя и используйте острые диафрагмой ножницы тщательно анализировать черепных нервных волокон, которые фиксируют его к черепу. Поместите мозг в 15 мл пробирку, наполненную 10 мл HBSS (+ Ca / Mg) и удерживать ее Shortly на льду.
4. Разобщенность мозговой ткани до одноклеточных суспензий
- Осторожно снимите ствол мозга и мозжечок с чистой бритвой. Используйте чистую лезвие, чтобы hemisect мозг и разрезать каждую полушарие вдоль фронтальной плоскости в трех частей примерно одинакового размера.
- Фарш рассеченные ткани каждом полушарии через клеточный фильтр 100 мкм с использованием конец плунжера 5 мл шприца. Непрерывно промыть фильтр клеток с ледяной HBSS (+ Ca / Mg). Хранить гомогенизированных образцов на льду.
- Центрифуга при 286 мкг в и 4 ° С в течение 5 мин, тщательно отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера пищеварения и передавать суспензии в 2 мл пробирку. Инкубируйте суспензии при медленном непрерывном вращении при 37 ° С в течение 1 ч.
- Сито клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм и тщательно промыть 3 мл промывочного буфера, содержащего ДНКазу затем 15 мл ДНКазы, свободной промывочного буфера, Центрифуга при 286 мкг в и 18 ° С в течение 5 мин и отбросить супернатант. Примечание: Примечание: Использование ДНКазы устраняет слизь ДНК, вызванное лизиса клеток, которые могли бы привести к агрегации клеток ущерба выживаемость клеток.
5. центрифугирования в градиенте плотности для удаления миелина и остатков клеток
- Осадок клеток Ресуспендируют в 5 мл 25% градиенте плотности среды и пипеткой суспензию до 15 мл пробирку. Тщательно перемешать путем многократного и осторожно пипеткой избегая образования пузырьков. Примечание: в градиенте плотности среду следует использовать при КТ, чтобы предотвратить слипание клеток.
- Центрифуга при 521 мкг в и 18 ° С в течение 20 мин. Используйте низкую профиль ускорения ротора и позволяют ротор, чтобы остановить без тормоза. Аккуратно снимите трубки из центрифуги без встряхивания. Тщательно аспирата миелина пальто и супернатант при сохранении клеточный осадок на дне пробирки. Примечание: Убедитесь, чтобы удалить весь миелина пальто, как любые остатки будут impaiг анализа методом проточной цитометрии.
- Ресуспендируют осадок в 10 мл ДНКазы буфера для промывки и пипеткой суспензию до нового 15 мл пробирку. Примечание: Эта стадия промывки имеет решающее значение, так как достаточное удаление градиентной среде плотности значительно способствует увеличению количества и качества конечного клеточного образца.
- Центрифуга снова при 286 х г и 10 ° С в течение 5 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток в 100 мкл холодного буфера для промывки и определить количество клеток и жизнеспособность путем трипанового синего в гемоцитометра. Образцы хранят при температуре 4 ° С и дальнейший процесс их быстро.
6. Антитела Окрашивание для анализа проточной цитометрии
- До маркировки антител, инкубировать клеточную суспензию при 4 ° С в течение 10 мин с анти-мышиным CD16 / CD32 блокирующего реагента FC-рецептор (конечной концентрации 2,5 мкг / мл, коэффициент разбавления 1: 200), чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
- Добавить флуорофором-конъюгированные первичных антител в аppropriate концентрация (как указано в таблице 1) к клеточной суспензии и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 мин в темноте. Примечание: Контрольные образцы не окрашивали с первичными антителами, но не подвергнутые дальнейшей обработке тем же самым.
- Промыть клетки с 2 мл FC буфера и центрифуге при 350 мкг в 10 ° С в течение 7 min.Carefully аспирации осадок клеток супернатант и ресуспендируют в 200 мкл буфера FC. Образцы магазин временно на 4 ° С в темноте до анализа методом проточной цитометрии.
7. Абсолютная Количественное путем подсчета шариков
- И наоборот пипетки 40 мкл буфера FC и 10 мкл клеточной суспензии в счетной трубке, содержащей известное количество флуоресцентных шариков. Примечание: Обратите внимание, что пипетки откалиброван для доставки ровно 10 мкл образца, последующим расчетом количества лейкоцитов относится к этому объему.
- Инкубируйте клеточной суспензии с FITC-меченного CD45 антитела (конечная концентрация5 мкг / мл, коэффициент разбавления 1: 100) при 4 ° С в течение 20 мин в темноте.
- И наоборот заполнить подсчета трубку с 200 мкл буфера FC без стадии промывки и непосредственно записывать CD45 + клеток в проточном цитометре.
8. проточной цитометрии Приобретение
Примечание: Для анализа предлагаемого панель антител, соответствующая цитометр быть оснащен синим (488 нм), красный (635 нм) и фиалки (405 нм) лазера и фильтров для FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 и AmCyan.
- Регулировка вперед (FSC) и в сторону (SSC) разброс помощью неокрашенных клеток из ишемической полушарии. Различают дублеты из одиночных клеток в дот график, показывающий площадь и высоту FSC.
- Показать все отдельные клетки в одной параметров гистограмм для каждого канала флуоресценции, используемой и регулировать ФЭУ (ФЭУ) напряжения, чтобы отдельные клетки выводятся в левой части гистограммы.
- Используйте CD45-FITC одногоокрашенных образец для проверки разброса и PMT параметры клеток, представляющих интерес с backgating высокие иммунные клетки CD45 в каждой гистограммы и диаграммы рассеяния. Примечание: Адаптация PMT напряжений FITC, так что CD45 отрицательными, промежуточное соединение (INT) и высокие экспрессирующие клетки могут быть дифференцированы друг от друга.
- Используйте антител захватили компенсации бусы выполнять компенсацию многоцветной. Установить ворота для микроглии (CD45 INT) и лейкоцитов (CD45 высокий), а затем определить субпопуляций лейкоцитов в соответствии со стратегией литниковой, изображенного на рисунке 1.
Representative Results
Церебральной ишемии была инициирована в 12-недель самцов мышей C57BL / 6 с помощью временной окклюзии нитей левой средней мозговой артерии (МСАО). Для мнимого операции нить была вставлена в закупоривать левой средней мозговой артерии и извлекают сразу, чтобы позволить мгновенную реперфузии. Важно отметить, что сотовая нейровоспаления существенно отличается среди широко применяемых моделей инсульта 19. Это должно иметь в виду, особенно при экстраполяции результатов исследований на животных к гетерогенной патофизиологии человека инсульта.
Мышей умерщвляли через 24 ч после МСАО анализировать ранний вторжение иммунных клеток к ишемическому мозга. Количество клеток, полученных из ишемической полушарии (MCAO IPSI; 0,95 ± 0,25 х 10E6) после центрифугирования в градиенте плотности были сопоставимы с таковыми из контралатерального полушария (МСАО противопоказания; 1,09 ± 0,30 х 10E6) и ипсилатеральнаяполушарие ложнооперированными мышей (мнимого IPSI; 1,12 ± 0,18 х 10E6, односторонний ANOVA, р = 0,524). Жизнеспособность изолированных клеток, измеренных трипанового синего был высоким и существенно не отличалась между группами (фиктивных 96.85 ± 0.60%, МСАО против 97,12 ± 1,18%, МСАО Ипси 95.68 ± 2.04%, с односторонним ANOVA, р = 0,253 ).
Состав мозга проникнуть через 24 ч после МСАО определяли методом проточной цитометрии. Рисунок 1 иллюстрирует стратегию стробирования схематически (а) и в представительном инсульта животного (B). Мозговые-Лейкоциты проникают были определены как CD45 высоких клеток, которые могут быть дифференцированы от CD45 INT микроглии. В большой популяции CD45, полиморфно нейтрофилы (ПМН) были определены выражением Ly-6G, в то время как Т-лимфоциты были обозначены, как CD45 высокой CD3 + клеток. Остальные CD45 высокие Затем клетки различаютред CD19 (В-лимфоциты) и выражения CD11b. CD11b + фракция далее подразделена на Ли-6C высокой `воспалительного monocytes` и низкой населения Ly-6C, который охватывает моноциты, дендритные клетки (ДК) и макрофаги.
В острой стадии инсульта, миелоидной иммунные клетки доминируют мозг проникнуть 3,20. Нейтрофилы проникают в мозг быстро после окклюзии сосуда и способствовать экстравазации воспалительных моноцитов 21. 2А показывает процентное увеличение Ly6-G + нейтрофилов в ишемической полушарие 24 ч после МСАО по сравнению с контралатеральной полушарии и мнимого хирургии. В отличие от этого, доля CD3 + Т-клеток в ишемической полушарии (относительно) ниже, чем в здоровом мозге. В популяции CD11b +, ишемия головного мозга смещает баланс в сторону сильного перевеса Ly-6С высоких воспалительных моноцитов (рис2B).
В дополнение к относительной распределений, считая трубки были использованы для определения абсолютного числа подмножеств иммунных клеток в образцах на основе CD45 позитивных событий (рисунок 3). Подсчет пробки содержат лиофилизированную лепешку, который высвобождает известное число флуоресцентных шариков. Абсолютное количество положительных клеток в образце может быть определена путем соотнесения клеточных событий, чтобы шарик события. Чтобы рассчитать количество CD45 высоких лейкоцитов в полушарии была использована следующая формула: CD45 высокие клеток на полушарии = (CD45 высокие события х общее подсчета бисер / образец шарик события) х (объем всего подвеска (100 мкл) / объем пробы (10 мкл )). 24 ч после МСАО, всего лейкоциты в инфаркт полушарии были значительно увеличены по сравнению с контралатеральной полушарии и мнимого хирургии (рис 3D, односторонний ANOVA, р = 0,0004). Графы ди stinct подмножества иммунных клеток (ПМН, Т-клетки, В-клетки, Ly-6C высокого и Ly-6C низкие моноциты) может быть легко вычислена путем умножения их относительную частоту, с общей CD45 высокой лейкоцитов числа соответствующего образца.
Рисунок 1. Память Стратегия проточной цитометрии. (А) Схематическое изображение стратегии селекции. (Б) показывает проточной цитометрии анализ лейкоцитов, выделенных из репрезентативной мозга мыши 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии. FSC вперед разброс, ПМН полиморфоядерные нейтрофилы, CDC классические дендритные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Дифференцирование иммунных клеток подмножеств. Относительное распределение LY-6G + -neutrophils (A), CD3 + Т-клеток (A) и моноцитов подмножества идентифицированные с помощью дифференциальной экспрессии LY-6C (б) в ипсилатеральной (IPSI) и контралатеральной ( противопоказания) полушарие 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) или соответствующего мнимого хирургии. Процент каждой популяции указывается в воротах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Количественная оценка мозга лейкоцитов путем подсчета бисер. (А) показывает высокую дважды положительный шарик ворота. В популяции одной клетки (Б) CD45 INT микроглии может быть дифференцирована от CD45 высоких лейкоцитов (С). Для количественного, количество закрытых высоких событий CD45 нормализовалось к подсчитанных бортов событий. Отметим, что общее лейкоцитов (CD45 высокий) рассчитывает значительно увеличены в ипсилатеральной (ипси-) полушарии по сравнению с контралатеральной (контр) полушарие и обман хирургии 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии (MCAO). ** Р <0,01, *** р <0,001 односторонним ANOVA и Tukey`s постфактум тест множественных сравнений. п = 4 - 6 в группе. FSC вперед разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| флюорохром | FITC | ЧП | PerCP | PC7 | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| антиген | CD45.2 | CD3 | Ly-6G | CD19 | Ly-6C | CD11b |
| Конечная концентрация [мкг / мл] | 5 | 1 | 0,2 | 0,2 | 1 | 1 |
| коэффициент разрежения | 1/100 | 1/200 | 1/1 000 | 1/1 000 | 1/200 | 1/200 |
| клон | 104 | 145-2С11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | М1 / 70 |
Таблица 1. Основные антитела Коктейль для иммунных клеток идентификации в ишемической мозга.
Discussion
Здесь мы описываем простой и эффективный способ выделения лейкоцитов из мышиного мозга после экспериментального инсульта. Подход надежно дает высокую воспроизводимость подсчитанных клеток на мозговой полушарии, позволяющей измерять различные панели потоков в одной биологической репликации.
По-видимому, неполное удаление крови, включая иммунные клетки приведет к искаженному представлению о фактическом количестве воспалительных клеток, которые вошли в ишемический мозг. Таким образом, при использовании этого протокола обратить особое внимание на тщательное transcardial перфузии, чтобы предотвратить загрязнение проникли иммунных клеток с невоспалительными циркулирующих лейкоцитов. Из опыта, использование тупых игл для левой пункции желудочков снижает риск травмы межжелудочковой перегородки, которые в обход перфузии кровообращения. Появление перфузионной жидкости из ноздрей является признаком того, что перфузии pressureis слишком высока, таким образом,недействительными дебиты> 10 мл / мин. Бледно к белому цвету ткани мозга указывает на хорошую перфузии во время розоватого цвета является признаком недостаточной перфузии.
Другим важным шагом этого протокола является эффективным диссоциация ткани мозга, который включает механическую фрагментацию, а также ферментативного расщепления. Мясорубки ткани через ячейки фильтра является критическим, чтобы обеспечить улучшенную эффективность протеаз. Однако, когда гомогенизацией ткани, во избежание чрезмерного давления в мононуклеарных фагоцитов очень восприимчивы к автолиза 22. Для ферментативного расщепления Liberase TL рекомендуется которых представляет собой смесь высокоочищенной коллагеназы I и II, который содержит низкие концентрации нейтрального термолизина протеазы. Прямое сравнение с ранее описанными протоколов изоляции 14,22,23 выявленных значительно более высокое извлечение жизнеспособных клеток путем обработки Liberase TL (км неопубликованные данные). По сравнению с коллагеназы, которые часто используютд для выделения иммунных клеток из мозга, Liberase TL содержит незначительные уровни эндотоксина. Это имеет особое значение, если клетки сортируются по ходу анализа, поскольку высокие уровни эндотоксина может изменить состояние активации иммунных клеток 24 и серьезно ухудшить клеточной культуры результатов 25. Другим недостатком традиционной коллагеназы это существенные различия от партии к партии в активности ферментов, которые ставят под угрозу воспроизводимости результатов и требует определения рабочей концентрации для каждой партии 26.
Во взрослом мозге, удаление миелина путем центрифугирования в градиенте плотности является необходимым шагом для последующих приложений, таких как проточной цитометрии или дальнейших исследований по гена или экспрессии белка. Одно из главных преимуществ протокола является процедура плотность однослойного который не требует больших затрат времени подготовку градиентов. Кроме того, протокол разделения производит надежный результатS, даже если выполняется довольно неопытных экспериментаторов. Это лишено слоистых градиентов с плотностью близких друг к другу, что трудно пипетки, не нарушая интерфейс между ними.
На основе экспрессии поверхностного маркера CD45, протокол дает три основных категории клеток в ишемизированной мозга. Подавляющее большинство клеток принадлежат к отрицательному населения CD45, который состоит из нервных клеток, астроглию, эпендимные и эндотелиальных клеток. Их присутствие большого приписывается градиента плотности однослойного которые в первую очередь направлена на эффективное миелина и вывоза мусора. Кроме того, CD45 INT населения, представляющая резидента микроглии 27 могут быть дифференцированы от высокой населения CD45 которое в основном состоит проникновения Гематогенное лейкоциты. Тем не менее, следует отметить, что активированные микроглии может принять фенотип и функцию миелоидных клеток крови новорожденного. Таким образом, только применение усложняемметоды, такие как D парабиозе 28, костный мозг химеры 29 или анализ отображение судьба 30 позволяют четкое различие между этими двумя популяциями при воспалении.
Анализ данных в проточной цитометрии часто ограничивается процентное распределение конкретных клеточных популяций. Тем не менее, при сравнении инфаркт полушарие не-инфарктом ткани головного мозга эта информация может ввести в заблуждение, потому что оно не считает общее рассчитывает мозга лейкоцитов, которые изменены ишемического повреждения. Таким образом, чтобы нарисовать полную картину о величине и фенотипа воспалительных инфильтратов после инсульта относительное распределение подмножеств иммунных клеток должны быть дополнены абсолютное количество клеток. При использовании микрошариков, как описано в данном протоколе, пипетки из точного объема пробы абсолютно обязательным для получения достоверных результатов. Кроме того, обратная пипетки настоятельно рекомендуется, чтобы избежать образования пены в счетной трубки. Возникающие воздушные пузыриснизит ожидаемый объем микросфер и, следовательно, привести к переоценке абсолютного количества лейкоцитов высокой CD45 в образце.
Таким образом, этот протокол обеспечивает простой и надежный подход, чтобы изолировать иммунные клетки из мозга. Это может служить ценным инструментом рассекать сложность воспалительной реакции на ишемический инсульт. Будущие приложения включают исследования по нестационарной роли моноцитов подмножеств в распространении и разрешением ишемической воспаления мозга. Аналогичным образом, роль адаптивной иммунной системы после инсульта мало изучен. Проточной цитометрии анализ субпопуляций Т-клеток, идентифицированных по выражению подмножества конкретных факторов транскрипции или цитокинов в месте может помочь прояснить их влияние на долгосрочное восстановление после инсульта и тем самым открыть перспективных направлений для развития новых подходов к лечению.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Изабель Schulz за отличную техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
- Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
- Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
- Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
- Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
- Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
- Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
- Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
- Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
- Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
- Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
- Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
- Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
- Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
- Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
- Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
- McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
