Abstract
Ischemische beroerte initieert een robuuste ontstekingsreactie die begint in het intravasculaire compartiment en het gaat om een snelle activering van de hersenen ingezeten cellen. Een belangrijk mechanisme van deze ontstekingsreactie is de migratie van circulerende immuuncellen naar de ischemische hersenen vergemakkelijkt door chemokine afgifte en verhoogde endotheliale expressie van adhesiemoleculen. -Brain binnenvallende leukocyten zijn bekend bij te dragen aan een vroeg stadium van het secundair ischemisch letsel, maar hun betekenis voor de beëindiging van ontsteking en later reparatie hersenen is pas onlangs is opgevallen.
Hier is een eenvoudig protocol voor de efficiënte isolatie van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen ontvangen. Na transcardial perfusie worden hersenhelften ontleed en mechanisch gescheiden. Enzymatische digestie met Liberase wordt gevolgd door dichtheidsgradiënt (zoals Percoll) centrifugatie myeline en celresten te verwijderen. Een groot voordeel van dit protocol is de enkellaags dichtheidsgradiënt procedure die niet vereist tijdrovende voorbereiding hellingen en betrouwbaar kan worden uitgevoerd. De aanpak levert zeer reproduceerbare celtellingen per hersenhelft en maakt meten verschillende flowcytometrie panelen in één biologische repliceren. Fenotypische karakterisering en kwantificering van de hersenen binnenvallende leukocyten na experimentele beroerte kan bijdragen tot een beter begrip van hun veelzijdige rol in ischemisch letsel en reparatie.
Introduction
Herseninfarct veroorzaakt een aanhoudende ontstekingsreactie die begint snel na staken van de lokale bloedstroom en omvat vrijwel alle delen van het immuunsysteem. Een belangrijk kenmerk van deze ontstekingsreactie is een getimede influx van immuuncellen naar de hersenen die wordt aangedreven door de activering van hersenen endotheelcellen aanzienlijke chemokine uitscheiding en verhoogde sympathische uitstroom 1-3. Infiltratie van ontstekingscellen is eerder beschouwd schadelijk bij ischemische beroerte echter verschillende klinische studies ontworpen om willekeurig blok leukocyt uitgang naar de hersenen niet een meetbare klinisch voordeel 4 induceren. Meer recent werd duidelijk dat van monocyten afgeleide cellen in eerste instantie betrokken bij progressie van ischemische schade 5 ook een centrale rol zou kunnen spelen voor het oplossen van de ontsteking en de daaropvolgende weefselherstel 6.
Dankzij de identificatie van fenotypische en functional heterogeniteit onder monocyten en macrofagen, is de kennis over de rol van mononucleaire fagocyten in de ontwikkeling en resolutie van ontsteking aanzienlijk uitgebreid. In muizen kan circulerende monocyten worden ingedeeld in ten minste twee functioneel verschillende subsets volgens hun oppervlakte-expressie van lymfocyt antigen 6 complex (Ly-6C) 7. Terwijl Ly-6C hoge'inflammatory monocytes' duidelijk bleken essentieel voor de bestrijding van bacteriële infecties 8 om hun rol in steriele schade is controversieel. In ischemische beroerte, selectieve ablatie van CCR2 + Ly-6C hoge monocyten resulteerde in hemorragische infarct transformatie 6. Echter, dezelfde experimentele benadering verbeterd acute invaliditeit na hersenbloeding 9. Ook verschillende subsets van T-cellen worden verondersteld om ofwel schadelijk 10 of beschermende maatregelen uit te oefenen 11 in ischemisch hersenletsel, echter gegevens controversial 12,13 en warrants verder onderzoek. Gezien deze toenemende complexiteit, blijkt dat diepere kennis over de rol van de diverse immuuncellen in ischemisch letsel en reparatie cruciaal voor het vertalen experimentele bevindingen naar behandelingen die na een beroerte ontsteking.
Vandaag is de meest krachtige tool voor het analyseren van cellulaire immuunreacties is polychromatische flowcytometrie. Het maakt de identificatie en kwantificering van diverse immuuncelsubklassen op de plaats van ontsteking zonder de noodzaak om het systeem voorspanning in vivo labeling of genetische manipulatie 14. Gelijktijdige kleuring van celoppervlak markers met antilichamen tegen intracellulaire cytokinen 15 of transcriptiefactoren 16 bovendien informatie over de functionele status van afzonderlijke, fenotypisch geïdentificeerde cellen. Als een groot nadeel, zijn enkele celsuspensies vereist voor flowcytometrische assays en is informatie over localization van cellulaire infiltraten verloren. Hoewel histologie ideale ruimtelijke informatie te verkrijgen, wordt beperkt door het aantal antilichamen dat in een keer kan worden gebruikt om immuuncel subtypen te karakteriseren in een bepaald weefsel. Vandaag zal een combinatie van de aanwezigheid en afwezigheid van verschillende oppervlakte markers nodig ondubbelzinnig te identificeren zeldzame immuuncelsubklassen, vooral onderscheiden van monocyten afgeleide celpopulaties tijdens inflammatie 17.
We beschrijven een efficiënt protocol hoge aantallen leukocyten isoleren van de postischemische muizenhersenen met behulp van een single-layer dichtheidsgradiënt. De verkregen celsuspensies kan ofwel geanalyseerd met multidimensionale flowcytometrie of verder worden verrijkt door flow cytometrische sortering of immunomagnetische selectie zeer specifieke downstream analyses uitvoeren. De methode Gegevens transcardial perfusie, het verwijderen van de hersenhelften, dissociatie van hersenweefsel in één cel suspensions, dichtheidsgradiënt centrifugeren myeline verwijderen en antilichaamkleuring voor flowcytometrische analyse.
Protocol
Alle dierproeven moeten voldoen aan volgens normen voor de verzorging van dieren (bijv., De Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door het Amerikaanse National Institutes of Health, NIH Publication No. 85-23, herzien 1996) en moeten worden goedgekeurd door de bevoegde overheidsinstantie.
1. Bereiding van reagentia
- Digestiebuffer (1 ml per halfrond): Los een gestandaardiseerde mengsel van gezuiverde spijsverteringsenzymen, bijvoorbeeld Liberase met lage thermolysine concentratie (TL) met een concentratie van 2U / ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) die calcium (Ca) en magnesium (Mg)
- Wasbuffer met DNAse: Los DNAse I bij een concentratie van 666U / ml in HBSS (Ca / Mg vrij) met 10% foetaal kalfsserum (FCS)
- Wasbuffer zonder DNAse: HBSS (Ca / Mg vrij) bevattende 10% FCS
- Dichtheidsgradiënt medium (5 ml per halfrond): bereiden voorraad isotone dichtheidsgradiënt0, medium (SIP; 100%) door mengen negen delen dichtheidsgradiënt medium met enerzijds 1,5 M natriumchloride. Verdun SIP tot 25% dekking door toevoeging van een geschikt volume van HBSS (Ca / Mg vrij) met 3% FCS
- Flow cytometrie (FC) buffer: Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 3% FCS
2. Transient midden cerebrale slagader Occlusie
OPMERKING: Transient middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO) via de intraluminale hechting techniek werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 18 in 12-weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen.
- Kort verdoven muizen met 2,0% isofluraan in 100% zuurstof. Handhaving van het lichaam temperatuur op 36,5 ° C ± 0,5 ° C door een feedback geregelde verwarming apparaat.
- Na ligatie van de gemeenschappelijke halsslagader en de externe halsslagader, invoering van een gestandaardiseerd siliconen rubberen monofilament in de gemeenschappelijke halsslagader en verder naar de oorsprong van de middelste cerebral slagader.
- Na 45 min verwijder de gloeidraad reperfusie mogelijk. In schijn-geopereerde dieren, onmiddellijk de draad terug te trekken na het afsluiten van de middelste cerebrale slagader om ischemie te voorkomen.
3. transcardial perfusie en Brain Dissection
- Bereid een peristaltische perfusiepomp door onderdompeling één uiteinde van de slang in ijskoude HBSS (Ca / Mg vrij). Bevestig een stompe 23 G naald in het andere einde van de infusiebuis en schakel de pomp naar de buis met HBSS (Ca / Mg vrij) volledig vullen.
- Diep verdoven muis met 4% isofluraan en euthanaseren door CO 2 inhalatie.
- Plaats de muis dorsaal op een dissectie bord ingebed in een plastic bakje. Spread voor- en achterpoten zo breed mogelijk en bevestig ze op de dissectie bord met 20 G naalden.
- Grijp buikhuid met een rechte 1 x 2 tanden tang en scherpe iris schaar om een laterale incisie door de omhulling en buikwand te maken en bloot delever.
- Til het borstbeen en incise het diafragma met de botte mes scherpe / stompe iris schaar. Blijf de laterale ribbenkast aan beide kanten snijden in caudocranial richting. Wees voorzichtig de longen, het hart en de thoracale slagaders niet te verwonden.
- Til de huid flap met een stompe pincet en speld het op de dissectie bord. Gebruik stompe uiteinden pincet en een schaar zorgvuldig te scheiden het hart van bindweefsel.
- Houden hart met een stomp uiteinde tang en steek de punt van de stompe 23 G naald met de bijgevoegde infusiebuis in de apex van de linker ventrikel. Opmerking: Steek de naald te ver in de linker ventrikel om letsel van de interventriculare septum te voorkomen. Indien nodig, bevestig de canule op zijn plaats met een rechte scherpe tang.
- Incise de rechter atrium met scherpe iris schaar en meteen weer aan de pomp (stroomsnelheid: 8 - 10 ml / min).
- Ga door perfusie totdat de lever toont een lichte koffie kleur (~ 30 ml van HBSS). overalde perfusie, zorgvuldig te voorkomen dat de vorming van luchtbel in de slang.
- Onthoofden de muis met rechte chirurgische schaar net achter de schedel. Gebruik iris schaar om een middellijn incisie van de hoofdhuid te maken aan de schedel bloot te leggen.
- Plaats een tip van scherpe iris schaar in het foramen magnum en snijd zijdelings in de schedel. Herhaal dit voor de andere kant.
- Gebruik scherpe iris schaar zorgvuldig gesneden uit dezelfde holte van de middellijn in de richting van de neus. Proberen het einde van de schaar als oppervlakkig mogelijk te houden om letsel aan de hersenen voorkomen.
- Gebruik fijne tang om voorzichtig schil de schedelbotten uit elke hersenhelft. Opmerking: Geïnfarceerde weefsel kan hechten aan de hersenvliezen of de schedel; zorg ervoor dat hersenweefsel niet te verliezen als gevolg van onvoorzichtig dissectie
- Til de hersenen met een spatel en scherpe iris schaar zorgvuldig te ontleden hersenzenuw vezels die het probleem te verhelpen aan de schedel. Plaats de hersenen in een 15 ml buis gevuld met 10 ml HBSS (+ Ca / Mg) en houd het shortly op ijs.
4. dissociatie van hersenweefsel in de Single Cell Schorsingen
- Verwijder voorzichtig hersenstam en kleine hersenen met een schone scheermesje. Gebruik een schone scheermesje naar de hersenen hemisect en snijd elk halfrond langs de frontale vlak in drie stukken van ongeveer gelijke grootte.
- Gehakt ontleed weefsel van elk halfrond door een 100 um zeef cel met de plunjer einde van een 5 ml spuit. Continu spoel de cel zeef met ijskoude HBSS (+ Ca / Mg). Bewaar gehomogeniseerde monsters op ijs.
- Centrifugeer bij 286 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten, voorzichtig gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml digestiebuffer en breng het mengsel op in een 2 ml buisje. Incubeer suspensie onder langzaam continue rotatie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Zeef celsuspensie door een 70 um cel zeef en grondig met 3 ml wasbuffer bevattende DNAse, gevolgd door 15 ml DNAse-vrij wasbuffer. Centrifugeer bij 286 xg en 18 ° C gedurende 5 minuten en gooi de supernatant. Opmerking: Opmerking: Het gebruik van DNAse elimineert DNA slijm veroorzaakt door cellysis die kunnen leiden tot cel aggregatie afbreuk te doen aan de cel te overleven.
5. dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor het verwijderen van myeline en celresten
- Hersuspenderen celpellet in 5 ml 25% dichtheidsgradiënt medium pipet en de suspensie tot een 15 ml buis. Meng goed door herhaalde en zachte pipetteren vermijden van de vorming van luchtbellen. Opmerking: dichtheidsgradiënt drager dient bij kamertemperatuur worden naar cel klonteren te voorkomen.
- Centrifugeer bij 521 xg en 18 ° C gedurende 20 min. Gebruik laagste acceleratieprofiel van de rotor en laat de rotor te stoppen zonder rem. Zachtjes de buizen uit de centrifuge te verwijderen zonder schudden. Zorgvuldig aspireren de myeline laag en de supernatant met behoud van de celpellet aan de onderkant van de buis. Opmerking: Zorg ervoor dat u de hele myeline vacht te verwijderen als alle overgebleven zal impair flowcytometrische analyse.
- Resuspendeer de pellet in 10 ml DNAse vrije wasbuffer en pipet de suspensie tot een nieuwe 15 ml buis. Opmerking: Deze wasstap is cruciaal omdat voldoende verwijdering van dichtheidsgradiënt medium aanzienlijk bijdraagt aan de kwantiteit en kwaliteit van de uiteindelijke celmonster.
- Centrifugeer opnieuw bij 286 xg en 10 ° C gedurende 5 minuten en gooi de supernatant. Resuspendeer cellen in 100 ul koude wasbuffer en bepaal cellen en levensvatbaarheid door trypan blauw exclusie op een hemocytometer. WINKEL monsters bij 4 ° C en snel verder verwerken hen.
6. Antilichaam kleuring voor Flow cytometrische analyse
- Vóór antilichaam labeling, incubeer de celsuspensie bij 4 ° C gedurende 10 min met anti-muis CD16 / CD32 FC-receptor blokkerende reagens (eindconcentratie van 2,5 ug / ml, verdunningsfactor 1: 200) om niet-specifieke binding te voorkomen.
- Add fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen op eenppropriate concentratie (zoals aangegeven in tabel 1) aan de celsuspensie en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten in het donker. Opmerking: controlemonsters niet gekleurd met primaire antilichamen, maar overigens van dezelfde behandeling.
- Was de cellen met 2 ml FC buffer en centrifugeer bij 350 xg en 10 ° C gedurende 7 min.Carefully zuig het supernatant en resuspendeer celpellet in 200 ui buffer FC. WINKEL tijdelijk monsters bij 4 ° C in het donker totdat de stroom cytometrische analyse.
7. Absolute kwantificering van het tellen van kralen
- Omgekeerd Pipetteer 40 ul FC buffer en 10 pi van de celsuspensie in een telbuis met een bekend aantal fluorescerende kralen. Opmerking: Let erop dat pipetten zijn gekalibreerd om precies 10 ul van het monster te leveren als de daaropvolgende berekening van leukocyten verwijst naar dit volume.
- Incubeer celsuspensie met FITC-gemerkt CD45 antilichaam (eindconcentratievan 5 ug / ml, verdunningsfactor 1: 100) bij 4 ° C gedurende 20 minuten in het donker.
- Omgekeerd het tellen buis met 200 ui buffer FC vullen zonder wasstap en CD45 + cellen direct opnemen in de flowcytometer.
8. Flowcytometrische Acquisition
Opmerking: De voorgestelde antilichaam panel analyse, heeft passende cytometer worden uitgerust met een blauwe (488 nm), rood (635 nm) en paars (405 nm) laser en filters voor FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 en AmCyan.
- Pas vooruit (FSC) en zijwaartse (SSC) scatter met behulp van ongekleurde cellen van een ischemische halfrond. Discrimineren doubletten van enkele cellen in een dot grafiek die het gebied en de hoogte van FSC.
- Alle enkele cellen in single-parameter histogrammen voor elk fluorescentie kanaal gebruikt en aanpassen van de fotomultiplicator buis (PMT) spanningen, zodat enkele cellen worden weergegeven in de uiterst links van het histogram.
- Gebruik een CD45-FITC enkelegebrandschilderde monster scatter en PMT instellingen voor de cellen van belang te controleren door backgating CD45 hoge immuuncellen in elk histogram en scatter plot. Opmerking: Pas PMT voltages van FITC zodat CD45 negatieve, tussenproduct (int) en hoge expressie brengende cellen kunnen worden onderscheiden van elkaar.
- Gebruik antilichaam gevangen compensatie kralen om multi-color compensatie uit te voeren. Stel poorten voor microglia (CD45 int) en leukocyten (CD45 hoog) en vervolgens vast leukocytsubpopulaties volgens de gating strategie weergegeven in figuur 1.
Representative Results
Cerebrale ischemie werd in 12-weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen via transiënte filament occlusie van de linker middelste cerebrale arterie (MCAO). Voor sham operatie werd de gloeidraad ingebracht om de linker middelvinger cerebrale slagader af te sluiten en onmiddellijk teruggetrokken om instant reperfusie mogelijk te maken. Belangrijk is dat cellulaire neuroinflammatie verschilt behoorlijk algemeen toegepaste takt modellen 19. Dit moet in het achterhoofd worden gehouden met name wanneer het extrapoleren van de bevindingen uit dierproeven naar de heterogene pathofysiologie van menselijke beroerte.
Muizen werden opgeofferd 24 uur na MCAO vroeg immuuncel invasie analyseren om de ischemische hersenen. Celtellingen verkregen van de ischemische hemisfeer (MCAO ipsi; 0,95 ± 0,25 x 10E6) na dichtheidsgradiënt centrifugatie vergelijkbaar waren met die van de contralaterale hemisfeer (MCAO contra; 1,09 ± 0,30 x 10E6) en de ipsilateralehalfrond van schijn-geopereerde muizen (sham ipsi; 1,12 ± 0,18 x 10E6, one-way ANOVA, p = 0,524). Levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen gemeten door trypan blauw uitsluiting was hoog en verschilde niet significant tussen de groepen (sham 96,85 ± 0,60%, MCAO contra 97,12 ± 1,18%, MCAO IPSI 95,68 ± 2,04%, one-way-ANOVA, p = 0,253 ).
De samenstelling van de hersenen infiltreren 24 uur na MCAO werd bepaald door flow cytometrische analyse. Figuur 1 illustreert de gating strategie schematisch (A) en een representatieve beroerte dier (B). Brain-infiltrerende leukocyten werden gedefinieerd als CD45 hoge cellen die kunnen worden onderscheiden van CD45 int microglia. Binnen het CD45 hoge populatie, werden polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) geïdentificeerd door Ly-6G expressie, terwijl T-lymfocyten werden afgebakend als CD45 high CD3 + cellen. De resterende CD45 hoge cellen werden vervolgens onderscheidened door CD19 (B-lymfocyten) en CD11b expressie. De CD11b + fractie werd verder gesubcategoriseerde in Ly-6C hoge `inflammatoire monocytes` en een Ly-6C laag bevolking die monocyten, dendritische cellen (DC) en macrofagen omvat.
In de acute fase van een beroerte, myeloïde immuuncellen domineren de hersenen infiltreren 3,20. Neutrofielen voer de hersenen snel na het vaartuig occlusie en het bevorderen van de extravasatie van inflammatoire monocyten 21. Figuur 2A toont de procentuele stijging van Ly6-G + neutrofielen in het ischemische halfrond 24 uur na MCAO ten opzichte van de contralaterale hemisfeer en sham operatie. Daarentegen is het aantal CD3 + T-cellen in de ischemische hemisfeer (relatief) lager dan in de gezonde hersenen. Binnen het CD11b + bevolking, de hersenen ischemie verschuift de balans in de richting van een sterk overwicht van Ly-6C hoge inflammatoire monocyten (Figuur2B).
Naast relatieve verdelingen werden telbuizen van absolute aantallen immuuncelsubklassen bepalen monsters op basis van CD45 positieve gebeurtenissen (figuur 3). Het tellen van buizen bevatten een gevriesdroogd pellet die een bekend aantal fluorescerende kralen releases. Het absolute aantal positieve cellen in het monster kan worden bepaald met betrekking cellulaire gebeurtenissen gebeurtenissen kraal. Om het aantal CD45 hoge leukocyten per halfrond de volgende vergelijking werd gebruikt te berekenen: CD45 hoge cellen per halfrond = (CD45 hoog gebeurtenissen x totaal tellen van kralen / sample kraal evenementen) x (volledige schorsing volume (100 pl) / monster volume (10 pi )). 24 uur na MCAO werden totale leukocyten in de hemisfeer infarct aanzienlijk toegenomen in vergelijking met de contralaterale hemisfeer en sham operatie (figuur 3D, eenzijdige ANOVA, p = 0,0004). Tellingen van de di instinct immuuncelsubklassen (PMN, T-cellen, B-cellen, Ly-6C hoog en Ly-6C laag monocyten) kan eenvoudig worden berekend door hun relatieve frequentie te vermenigvuldigen met de totale CD45 hoge leukocyten personeel van het monster.
Figuur 1. Gating strategie voor Flow Cytometry. (A) Schematische weergave van de gating strategie. (B) toont flowcytometrische analyse van leukocyten geïsoleerd uit een vertegenwoordiger van de hersenen van muizen 24 uur na midden cerebrale slagader occlusie. FSC voorwaartse verstrooiing, PMN polymorfonucleaire neutrofielen, CDC klassieke dendritische cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
Figuur 2. Differentiatie van immuuncelsubklassen. De relatieve verdeling van Ly-6G + -neutrophils (A) CD3 + T-cellen (A) en monocyt subsets geïdentificeerd door differentiële expressie van Ly-6C (B) in de ipsilaterale (IPSI) en contralaterale ( contra) halfrond 24 uur na midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) of een respectieve schijnvertoning chirurgie. Percentage van elke populatie wordt aangegeven in de poort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Kwantificering van Brain leukocyten door tellen Beads. (A) toont de zeer dubbelpositieve bead gate. In de enkele cel populatie (B) CD45 int microglia kunnen worden onderscheiden van CD45 hoge leukocyten (C). Voor kwantificering is het aantal gated CD45 high gebeurtenissen was genormaliseerd tot de getelde kraal gebeurtenissen. Merk op dat de totale leukocyten (CD45 hoog) tellingen zijn aanzienlijk toegenomen in de ipsilaterale (ipsi) halfrond in vergelijking met de contralaterale (contra) halfrond en sham operatie 24 uur na midden cerebrale slagader occlusie (MCAO). ** P <0,01, *** p <0,001 door ANOVA en post hoc Tukey`s meervoudige vergelijkingen proef. n = 4-6 per groep. FSC voorwaartse verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| fluorochroom | FITC | PE | PerCP | PC7 | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| Antigeen | CD45.2 | CD3 | Ly-6G | CD19 | Ly-6C | CD11b |
| Eindconcentratie [ug / ml] | 5 | 1 | 0.2 | 0.2 | 1 | 1 |
| verdunningsfactor | 1/100 | 1/200 | 1/1000 | 1/1000 | 1/200 | 1/200 |
| Clone | 104 | 145-2C11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | M1 / 70 |
Tabel 1. Basic Antibody Cocktail voor immuuncel Identificatie in het ischemische Brain.
Discussion
We beschrijven hier een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren van leukocyten uit het murine hersenen na experimentele beroerte. De aanpak betrouwbaar levert zeer reproduceerbare celtellingen per hersenhelft maakt om verschillende stroomsnelheden panelen meten één biologische repliceren.
Blijkbaar zal een onvolledige verwijdering van het bloed waaronder immuuncellen leiden tot een vertekend beeld van de werkelijke bedrag van inflammatoire cellen die de ischemische hersenen ingevoerd. Dus, als het gebruik van dit protocol bijzondere aandacht besteden aan grondige transcardial perfusie om besmetting van geïnfiltreerd immuuncellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten te voorkomen. Uit ervaring, het gebruik van botte naalden voor linkerventrikel punctie vermindert het risico op letsel van de interventriculare septum die perfusie van de systemische circulatie zou omzeilen. Opkomst van de perfusie vloeistof uit de neusgaten is een teken dat de perfusie pressureis te hoog, dus eenvoid stroomsnelheden> 10 ml / min. Pale om witte kleur van het hersenweefsel geeft een goede doorbloeding, terwijl roze kleur is een teken van een slechte doorbloeding.
Een andere belangrijke stap van dit protocol is efficiënt dissociatie van hersenweefsel mechanische fragmentatie en enzymatische afbraak omvat. Hakken het weefsel door de cel zeef kritisch verbeterde effectiviteit van proteasen verschaffen. Echter, wanneer het homogeniseren van het weefsel voorkomen dat te veel druk mononucleaire fagocyten zijn zeer gevoelig voor autolyse 22. Enzymatische digestie Liberase TL wordt aanbevolen dat een mengsel van sterk gezuiverd collagenase I en II dat lage concentraties van de neutrale protease thermolysine bevat. De directe vergelijking met de eerder beschreven isolatie protocollen 14,22,23 bleek significant hoger herstel van levensvatbare cellen door Liberase TL behandeling (KM ongepubliceerde gegevens). Vergeleken met collagenase die vaak gebruiktd voor de isolatie van de immuuncellen van de hersenen, Liberase TL bevat verwaarloosbare niveaus van endotoxine. Dit is van bijzonder belang indien cellen worden gesorteerd voor downstream analyse omdat hoge niveaus van endotoxine de activeringstoestand kan veranderen van immuuncellen 24 en ernstig afbreuk celkweek uitkomsten 25. Een ander nadeel van traditionele collagenase significant lot-to-lot verschillen in enzymactiviteiten die gevaar reproduceerbaarheid van de resultaten en vereist de bepaling van de werkconcentratie voor elke partij 26.
In de volwassen hersenen, myeline verwijdering door dichtheidsgradiënt centrifugatie is een noodzakelijke stap om verdere toepassingen zoals flowcytometrie of verdere studies op gen- of eiwitexpressie. Een groot voordeel van het protocol is de enkellaags density procedure die tijdrovende voorbereiding van hellingen vereist. Bovendien, de scheidingsprotocol produceert betrouwbaar resultaats, zelfs wanneer deze wordt uitgevoerd door nogal onervaren onderzoekers. Het mist gelaagd gradiënten met dichtheden dicht bij elkaar moeilijk zijn pipet zonder de interface tussen.
Op basis van de expressie van het oppervlak marker CD45, levert het protocol drie grote categorieën cel in de ischemische hersenen. De overgrote meerderheid van de cellen tot een CD45 negatieve populatie die bestaat uit neuronale cellen, astroglia, ependymale en endotheelcellen. De overvloedige aanwezigheid toegeschreven aan de enkellaags dichtheidsgradiënt die primair is gericht op efficiënte myeline en afvalverwijderingssysteem. Bovendien kan een CD45 int bevolking vertegenwoordigen inwoner microglia 27 worden onderscheiden van een CD45 hoge populatie die voornamelijk bestaat uit het infiltreren hematogene leukocyten. Er moet echter worden opgemerkt dat geactiveerde microglia het fenotype van de bloed-geboren myeloïde cellen kan vaststellen. Dus alleen het toepassen van sophisticated technieken zoals parabiosis 28, beenmerg chimeren 29 of het lot mapping analyse 30 maken een duidelijk onderscheid tussen deze twee populaties tijdens ontsteking.
Gegevensanalyse in flowcytometrie is vaak beperkt tot de procentuele verdeling van specifieke celpopulaties. Echter, bij het vergelijken van het infarct halfrond niet-geïnfarceerde hersenweefsel deze informatie kan misleidend zijn, omdat zij niet van mening totale hersenen leukocyten die zijn veranderd door ischemisch letsel. Dus, om een volledig beeld van de omvang en de fenotype van ontstekingsinfiltraten te trekken na een beroerte relatieve verdeling van het immuunsysteem cel subsets moet worden aangevuld met absolute cel aantallen. Bij gebruik van microbolletjes zoals beschreven in dit protocol, pipetteren van een nauwkeurig monstervolume absoluut noodzakelijk om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Bovendien wordt reverse pipetteren sterk aanbevolen om schuimvorming bij het tellen buis te voorkomen. Voortvloeiende luchtbellenzal het verwachte volume van de microbolletjes te verminderen en dus leiden tot een overschatting van de absolute CD45 hoog aantal leukocyten in het monster.
Kortom, dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare benadering van immuuncellen isoleren van de hersenen. Het kan dienen als een waardevol instrument om de complexiteit van de ontstekingsreactie op ischemische beroerte ontleden. Toekomstige toepassingen zijn onder meer onderzoek naar het tijdsafhankelijke rol van monocyten subsets in de voortplanting en de resolutie van ischemische ontsteking van de hersenen. Evenzo wordt de rol van het adaptieve immuunsysteem na een beroerte slecht begrepen. Flow cytometrische analyse van T-cel subpopulaties geïdentificeerd door de expressie van subgroep-specifieke transcriptiefactoren of cytokines in situ zou kunnen helpen om hun impact op de lange termijn het herstel na een beroerte en dus geopend veelbelovende mogelijkheden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelmethoden te verduidelijken.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken Isabell Schulz voor een uitstekende technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
- Courties, G., et al. Ischemic stroke activates hematopoietic bone marrow stem cells. Circulation research. 116 (3), 407-417 (2015).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nature medicine. 17 (7), 796-808 (2011).
- Möller, K., Boltze, J., Pösel, C., Seeger, J., Stahl, T., Wagner, D. -C. Sterile inflammation after permanent distal MCA occlusion in hypertensive rats. Journal of cerebral blood flow and metabolism. 34 (2), 307-315 (2014).
- Sughrue, M. E., Mehra, A., Connolly, E. S., D'Ambrosio, A. L., et al. Anti-adhesion molecule strategies as potential neuroprotective agents in cerebral ischemia: a critical review of the literature. Inflammation research. 53 (10), 497-508 (2004).
- Dimitrijevic, O. B., Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Absence of the chemokine receptor CCR2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Stroke. 38 (4), 1345-1353 (2007).
- Gliem, M., et al. Macrophages prevent hemorrhagic infarct transformation in murine stroke models. Annals of neurology. 71 (6), 743-752 (2012).
- Geissmann, F., et al. Blood monocytes: distinct subsets, how they relate to dendritic cells, and their possible roles in the regulation of T-cell responses. Immunology and cell biology. 86 (5), 398-408 (2008).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Hammond, M. D., et al. CCR2+ Ly6C(hi) inflammatory monocyte recruitment exacerbates acute disability following intracerebral hemorrhage. The Journal of neuroscience. 34 (11), 3901-3909 (2014).
- Shichita, T., et al. Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury. Nature medicine. 15 (8), 946-950 (2009).
- Liesz, A., et al. Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nature medicine. 15 (2), 192-199 (2009).
- Kleinschnitz, C., Wiendl, H. Con: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), 87-88 (2013).
- Hu, X., Li, P., Chen, J. Pro: Regulatory T cells are protective in ischemic stroke. Stroke. 44 (8), e85-e86 (2013).
- Möller, K., Stahl, T., Boltze, J., Wagner, D. -C. Isolation of inflammatory cells from rat brain tissue after stroke. Experimental & translational stroke medicine. 4 (1), 20 (2012).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 6, Unit 6.24 (2007).
- Albu, D. I., Califano, D., Avram, D. Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes. Methods in molecular biology. 647, Clifton, N.J. 377-390 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nature neuroscience. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Wagner, D. -C., et al. Allometric dose retranslation unveiled substantial immunological side effects of granulocyte colony-stimulating factor after stroke. Stroke. 45 (2), 623-626 (2014).
- Zhou, W., et al. Postischemic brain infiltration of leukocyte subpopulations differs among murine permanent and transient focal cerebral ischemia models. Brain pathology. 23 (1), Zurich, Switzerland. 34-44 (2013).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Soehnlein, O., Lindbom, L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature reviews. Immunology. 10 (6), 427-439 (2010).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nature protocols. 1 (4), 1947-1951 (2006).
- Arac, A., et al. Systemic augmentation of alphaB-crystallin provides therapeutic benefit twelve hours post-stroke onset via immune modulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 13287-13292 (2011).
- Mattern, T., et al. Endotoxin and lipid A stimulate proliferation of human T cells in the presence of autologous monocytes. Journal of immunology. 153 (7), Baltimore, Md. 2996-3004 (1950).
- Berney, T., et al. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptosis. Transplantation. 71 (1), 125-132 (2001).
- McShane, P., Sutton, R., Gray, D. W., Morris, P. J. Protease activity in pancreatic islet isolation by enzymatic digestion. Diabetes. 38, s126-s128 (1989).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. Journal of immunology. 154 (9), Baltimore, Md. 4309-4321 (1950).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. abioM. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
