Introduction
संयंत्र सेल दीवार एक गतिशील संरचना है। बढ़ कोशिकाओं एक प्राथमिक सेल की दीवार, संगठन है जो की कोशिकाओं का विस्तार करने की अनुमति देता से घिरे हैं। कोशिकाओं है कि जमा एक और अधिक कठोर माध्यमिक दीवार है कि संयंत्र के यांत्रिक समर्थन बढ़ाता विकसित करने के लिए संघर्ष। दोनों सेल दीवारों सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के विभिन्न संरचनाओं (जैसे, hemicellulose और पेक्टिन) कि विभिन्न विकास मंच के पार भिन्न है और 1,2 ऊतकों की polysaccharides के एक मैट्रिक्स में एम्बेडेड से बना रहे हैं। सेल्यूलोज (1,4) -β-D-glucan की जंजीरों कि कसकर एक क्रिस्टलीय संरचना के सूक्ष्मतंतु फार्म के लिए गठबंधन कर रहे हैं के रूप में संश्लेषित है। बेढब सेल्यूलोज क्षेत्रों में जहां Glucan चेन कम आदेश दिए हैं करने के लिए संदर्भित करता है। क्रिस्टलीय और अनाकार डोमेन के बीच अनुपात एक पैरामीटर सेल की दीवार के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करने के बारे में सोचा, यांत्रिक शक्ति और viscoelastic विशेषता क्रमश: 3 प्रदान कर रहा है। कई तरीकों से किया गया हैका पता लगाने और एक्स-रे विवर्तन और पार ध्रुवीकरण / जादू कोण ठोस राज्य एनएमआर 4 कताई सेल्यूलोज व्यवस्था के दो रूपों यों, उन के बीच करने के लिए विकसित की है। एक्स-रे विवर्तन नमूना 5 में क्रिस्टलीय बनाम अनाकार सेल्यूलोज डोमेन के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक वैकल्पिक तरीका एसिड अघुलनशील और एसिड में घुलनशील सामग्री में कोशिका दीवार सामग्री के विभाजन का उपयोग करता है, क्रिस्टलीय और अनाकार सेलूलोज या अन्य पॉलिमर के बीच भेद करने के लिए क्रमशः। इस दृष्टिकोण में, लेबल ग्लूकोज ([14 सी] ग्लूकोज) के समावेश सेल्यूलोज 6.7 यों इस्तेमाल किया जाता है। इन विधियों पूरे अंग विश्लेषण करती है, पर अच्छे के लिए संयंत्र सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, और इसलिए, अपर्याप्त कोशिका दीवार संरचना में ऊतक विशेष परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं। एक सेलुलर संकल्प पर सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के दृश्य लाइव इमेजिंग अध्ययन फ्लोरोसेंट रंगों 8,9 के साथ संयुक्त में प्राप्त किया जा सकता है, उस में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैंसेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण। हालांकि, इन रंगों मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, वे सेल्यूलोज क्रिस्टलीय के लिए विशिष्ट नहीं कर रहे हैं और कोशिका दीवार 8 की सामान्य संरचना के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। Polscope एक इमेजिंग तकनीक है कि क्रिस्टलीय सेल्यूलोज की क्षमता प्रकाश बीम विभाजित है और प्रकाश 10 का हिस्सा मंदबुद्धि पर निर्भर करता है। लाइट मंदता सूक्ष्मतंतु कि प्रकाश प्रसार की दिशा के लंबवत झूठ के लिए सबसे मजबूत है। इसी तरह के उन्मुखीकरण के साथ सूक्ष्मतंतु के लिए, उच्च स्फटिकता की डिग्री, बड़ा प्रकाश retardance 11। इसलिए, polscope दोनों रिश्तेदार का स्तर और सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
जड़ें, रैखिक वृद्धि, जिसके दौरान कोशिकाओं को स्टेम सेल आला पर होने वाले, जड़ की नोक पर प्रदर्शन कोशिका विभाजन की एक श्रृंखला से गुजरना, इससे पहले कि वे तेजी से 12 का विस्तार। जड़ जिसमें कोशिकाओं को एक दिशाहीन (anisotropic) में विस्तारढंग से, के रूप में छोटे अणु के संकेत हार्मोन है कि सेल की दीवार 13 के गुणों के प्रभाव से तय है। हार्मोन के अंतर प्रतिक्रियाओं, समय और स्थान में, संतुलित विकास अंग 14 सुनिश्चित करने का एक साधन प्रदान करते हैं। इसलिए, सेल दीवार संरचना के उच्च संकल्प विश्लेषण महत्वपूर्ण जानकारी बेहतर पूरे अंग विकास के लिए सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के बीच संबंध समझने के लिए आवश्यक प्रदान कर सकते हैं। यहाँ, हम के रूप में उच्च गुणवत्ता के संरचनात्मक वर्गों में मनाया, Arabidopsis जड़ों में क्रिस्टलीय सेलूलोज के ऊतक विशेष संचय का अध्ययन करने के polscope के कार्यान्वयन की रिपोर्ट। इस विधि को हाल ही में हार्मोन संबंधी गतिविधि 15 के स्थानिक गड़बड़ी के जवाब में क्रिस्टलीय सेलूलोज के सेल प्रकार विशिष्ट संचय का पर्दाफाश किया।
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Protocol
1. संयंत्र विकास
- भूतल बीज बाँझ।
- गीला या सूखी विधि द्वारा (30 मिलीग्राम तक) के बीज जीवाणुरहित। एक उदाहरण के रूप में, सूखी नसबंदी विधि के लिए, 1 मिलीलीटर हिमनदों एचसीएल 37% 50 मिलीलीटर ब्लीच में, एक बंद desiccator में कम से कम 4 घंटे के लिए और रात को जोड़ने के लिए एक गिलास बीकर में। एक रासायनिक हुड में इस कदम को पूरा करें।
- 0.5x Murashige और Skoog (एमएस) के माध्यम में 0.8% संयंत्र अगर साथ प्लेटों पर बाँझ बीज बिखरा हुआ है। लपेटें Parafilm या झरझरा टेप के साथ प्लेटें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया।
- 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों स्टोर - 4 दिन वर्दी अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए।
- Arabidopsis पौध उगाने के लिए उपयुक्त एक विकास कक्ष प्लेटें स्थानांतरण। प्लेटों की जगह खड़ी अगर मध्यम के शीर्ष पर रूट विकास को बनाए रखने के लिए और प्रवेश को रोकने के लिए।
- स्थानांतरण पौध अंकुरण (डेग) के बाद 7 दिनों के लिए लगानेवाला।
2. फिक्सेशन
- 50 मिलीलीटर रिचर्डसन समाधान तैयारदोहरा आसुत जल में 1% बोरेक्स (बफर एजेंट), 1% Methylene नीले और 1% नीला (ऊतकीय ध्वज) के बराबर मात्रा के संयोजन से एन। एक सिरिंज का उपयोग करने से पहले 0.22 माइक्रोन PVDF फ़िल्टर यूनिट प्रेरित माध्यम से फिल्टर।
- 0.05 एम सोडियम cacodylate (बफरिंग एजेंट) में 1.25% glutaraldehyde: लगानेवाला की 50 मिलीलीटर की तैयारी।
नोट: इन सामग्रियों को विषाक्त कर रहे हैं और एक रासायनिक हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए। - अंतिम निर्धारण समाधान प्राप्त करने के निर्धारण समाधान के लिए रिचर्डसन समाधान के 100 μl (2.1 देखें) (2.2 देखें) जोड़ें।
- मार्क इसी नमूना नाम के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से।
- 3 मिलीग्राम, अंतिम निर्धारण समाधान (2.3 देखें) कुओं में इतना है कि अंकुर, एक बार का तबादला, पूरी तरह से तरल में शामिल किया जाएगा - 2 जगह।
- ध्यान से, संदंश का उपयोग 10 पौध के लिए प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से हस्तांतरण, ऊपर। Parafilm का उपयोग कर प्लेटें सील। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, अंधेरे में, कम से कम एक रात के लिए, और एक सप्ताह तक।
3. निर्जलीकरण
- <li> पौध निर्जलीकरण। 15 मिनट के लिए 10% इथेनॉल:, नई 6 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं के बीच उन्हें स्थानांतरण, इथेनॉल की सांद्रता में वृद्धि से युक्त के रूप में यहाँ सूचीबद्ध 15 मिनट के लिए 30% इथेनॉल; 15 मिनट के लिए 50% इथेनॉल; 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल; 15 मिनट के लिए 85% इथेनॉल; 15 मिनट के लिए 95% इथेनॉल; 4 डिग्री सेल्सियस, रात भर, कम से कम 95% इथेनॉल। ध्यान से उन्हें अपने बीजपत्र, प्लास्टिक संदंश के साथ बेहतर द्वारा लोभी द्वारा पौध संभाल लेना।
4. घुसपैठ
- घुसपैठ के माध्यम से तैयार। एक छोटे से कांच की बोतल में 50 मिलीलीटर बेसिक राल तरल किट के साथ historesin किट उत्प्रेरक का 1 बैग की सामग्री मिक्स। 20 मिनट के लिए चुंबक के साथ हिलाओ। घुसपैठ मध्यम कुछ हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
- मार्क इसी नमूना नाम के साथ एक नया 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से और 2 के साथ भरने - घुसपैठ माध्यम के 3 मिलीलीटर।
- संदंश का उपयोग घुसपैठ मध्यम करने के लिए 95% इथेनॉल समाधान से पौध स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि पौध फू हैंlly मध्यम से कवर किया।
- कम से कम 4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, संयंत्र के ऊतकों में अधिकतम पहुंच सुनिश्चित करने के लिए।
5. ब्लॉक तैयारी
- छोटे लेबल, नमूना नाम के साथ पेंसिल से चिह्नित, नए नए साँचे embedding के प्रत्येक कुएं के अंदर रखें।
- 15 मिलीलीटर घुसपैठ मध्यम (4.1 देखें) 1 मिलीलीटर hardener जोड़कर मध्यम embedding तैयार करें। एक मात्रा छोटे से 15 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, polymerization मुद्दों से बचने के लिए प्रयास न करें।
- अच्छी तरह से 200 μl embedding माध्यम के साथ मोल्ड में प्रत्येक का आधा भरें और भूमि के ऊपर एक फिल्म टुकड़ा मोल्ड आकार करने के लिए कटौती के साथ कवर, लेकिन एक आकार प्रत्येक पक्ष पर 1 मिमी बड़ा करने के लिए। कम से कम 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, polymerization की अनुमति है। 5 घंटा से अधिक नहीं है।
- मध्यम embedding के एक अतिरिक्त बैच तैयार (5.2 देखें) और बर्फ पर रख, polymerization से बचने के लिए, जबकि जड़ सुझावों सांचे में व्यवस्था की जा रही है।
- छुरी का उपयोग कर एक विदारक गुंजाइश के तहत प्रत्येक जड़ टिप कट और बहुत सावधानी से मैं स्थितिटी: खड़ी अनुप्रस्थ वर्गों के लिए या क्षैतिज अनुदैर्ध्य अनुभाग के लिए, के बारे में 2 - मोल्ड परिधि से 3 मिमी। एक उपरि फिल्म के साथ समाधान और कवर को रोकने के साथ पूरी तरह से मोल्ड भरें। ध्यान दें कि अवरुद्ध समाधान थोड़ा हटना होगा एक बार यह polymerized है।
- कम से कम, 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
- ब्लॉकों सूखी, सूखी सिलिका जेल के साथ एक बॉक्स में डाल दिया है और कम से कम रात भर कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
6. सेक्शनिंग
- एक चाकू के निर्माता के साथ कांच की छड़ से गिलास चाकू तैयार करें। ऊतक सेक्शनिंग के लिए कांच की चाकू का प्रयोग करें। एक वर्ग में कांच रॉड कट और फिर स्क्वायर कट तिरछे दो चाकू का उत्पादन करने के लिए, एक हीरे की स्कोरिंग उपकरण का उपयोग।
- 2 में धारा ब्लाकों - 3 माइक्रोन चौड़ाई स्लाइस, एक सेक्शनिंग मशीन का उपयोग कर। एक गिलास स्लाइड पर प्लेस स्लाइस, आसुत जल बूंदों के शीर्ष पर है और एक गर्मी ब्लॉक कम गर्मी के लिए सेट पर स्लाइड जगह (50 - 60 डिग्री सेल्सियस), पानी evaporates जब तक।
- मूल समाधान के 0.2% के लिए रिचर्डसन समाधान (2.1 देखें) पतला और स्लाइस को कवर करने के लिए इसे के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। 5 सेकंड के लिए गर्मी ब्लॉक पर रखें और उसके बाद आसुत जल से धो लें।
- एक गर्म थाली पर स्लाइड सूखी। एक विदारक गुंजाइश के तहत निरीक्षण करें और एक मार्कर के साथ स्लाइड के पीछे निशान, ब्याज की स्लाइस की स्थिति का संकेत माइक्रोस्कोप के तहत उनके बाद में पहचान की सुविधा के लिए।
- एक कवर पर्ची के साथ बढ़ते मध्यम और कवर के 100 μl जोड़ें।
8. छवि अधिग्रहण
- कवर स्लाइड एक प्रकाश retardance जानकारी और एक polarizer / हस्तक्षेप ऑप्टिक फिल्टर (चित्रा 1 एडी) प्राप्त करने के लिए उपयुक्त Polscope प्रणाली से लैस खुर्दबीन के नीचे जड़ वर्गों युक्त रखें।
- चयन बढ़ाई कि पूरे नमूना का स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में 40X) और microscop ध्यान केंद्रितएक खाली क्षेत्र है कि ब्लॉक खंड लेकिन कोई जड़ खंड शामिल हैं पर ई। कोई blemishes के साथ एक साफ क्षेत्र खोजने की कोशिश करें। पृष्ठभूमि सेट करने के लिए इस क्षेत्र का प्रयोग करें।
- 17 एनएम के लिए सीमा निर्धारित करें: सेट इमेजिंग सिस्टम और सॉफ्टवेयर मानकों। लागू करें "ऑटो एक्सपोजर" और खाली मैदान से पृष्ठभूमि छवि प्राप्त (8.2 देखें)। एक पृष्ठभूमि छवि प्रयोग के प्रति प्रयोग किया जाता है।
9. सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु अभिविन्यास का विश्लेषण Polscope
- अनुदैर्ध्य वर्गों का विश्लेषण।
- एक स्लाइड खुर्दबीन के नीचे अनुदैर्ध्य वर्गों युक्त प्लेस और यह एक retardance छवि प्राप्त। ब्याज की एक जड़ खंड पर खुर्दबीन ध्यान दें। एक नया फ़ाइल नाम प्रदान करें।
- "लाइव Abrio" खिड़की के माध्यम से एक abrio छवि (मंदता जानकारी के साथ छवि) पर कब्जा। एक वर्ग है कि सेल की दीवार है, जो सेल की परिधि के साथ चल रहे दाग सेल्यूलोज से पहचाना जा सकता है जैसा कि चित्र में दिखाया गया -2 शामिल कब्जा करने के लिए सुनिश्चित करें।
- छवि विश्लेषण।
- छवि ढेर में प्रासंगिक छवि पर डबल क्लिक करें। "प्रदर्शन सेटिंग" टैब में चुनें "अभिविन्यास छद्म रंग"।
- सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु कोण अनुमान लगाने के लिए, इसी रंग पहिया में है कि सेल की दीवार की छाया मेल खाते हैं।
नोट: चित्रा -2 में रंग पहिया सूक्ष्मतंतु जो सूक्ष्मतंतु की लंबी अक्ष के साथ दिशा का संकेत के साथ झूठ बोल प्रकाश की धीमी अक्ष को दर्शाता है। सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के कोण कोण रंग और सेल की लंबी अक्ष ने संकेत दिया है। उदाहरण के लिए, इनसेट में elongating सेल सियान रंग, कोशिकाओं की लंबी अक्ष के बारे में 90 डिग्री से झुका पता चलता है। - सेल की दीवार में औसत सूक्ष्मतंतु कोण यों, सॉफ्टवेयर की पट्टी से "retardance और दिगंश स्टाम्प" उपकरण का उपयोग करें। प्राप्त छवि में ब्याज के क्षेत्र पर क्लिक करें उपकरण, बिंदु का चयन और है।
नोट: इस Wilडिग्री में कोण (दिगंश) (चित्रा 2 सी) के प्रदर्शन में एल नतीजा है। - एक विकल्प खुला पहुँच ध्रुवीकृत प्रकाश छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, दोपहर का भोजन 'पोल-विश्लेषक "प्लगइन मेनू से प्लगइन। नई खोला विंडो में, "Birefringence" टैब और खुले चयन करें और फिर पृष्ठभूमि फ़ाइल और छवि फ़ाइल सहेजें।
- छवि खिड़की में, "चश्मा चयन करें।" और 'रॉय पिक्सेल आकार' (इस अध्ययन के लिए उपयोग 5 पिक्सल) समायोजित करें। "चश्मा।" में खिड़की, चुनें "परिणाम तालिका में शो मूल्यों"।
- छवि खिड़की में ब्याज के क्षेत्र चिह्नित करने के लिए बहुभुज उपकरण का उपयोग करें। सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण प्राप्त करने के लिए "अभिविन्यास लाइन्स" का चयन करें।
नोट: इस डिग्री में कोण (दिगंश) के प्रदर्शन में परिणाम होगा।
नोट: औसत कोण दो तरीकों में से एक द्वारा गणना की तो स्लाइड के साथ जड़ खंड की स्थिति के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। से विचलन के लिए सही करने के लिएस्लाइड के साथ पूरे रूट खंड की क्षैतिज स्थिति, अपने लंबे अक्ष के साथ सेल flanking कोशिका दीवार की औसत सूक्ष्मतंतु कोण यों (जो है, अनुभाग को सीधा और जड़ विकास की धुरी, चित्रा -2 साथ)। इस कोण 180 ° जब जड़ खंड सही स्लाइड के साथ तैनात किया गया है। सूक्ष्मतंतु कोण की गणना के लिए, 180 डिग्री से flanking कोशिका दीवार की औसत मापा सूक्ष्मतंतु कोण घटाना। सेल की दीवार की औसत मापा सूक्ष्मतंतु कोण है कि स्लाइड पर फ्लैट झूठ को हुई अंतर जोड़ें।
क्रिस्टलीय सेलूलोज़ संचय के 10 Polscope विश्लेषण
- अनुप्रस्थ (क्रॉस) वर्गों का प्रयोग करें। ध्यान दें कि क्रिस्टलीय सेलूलोज संचय केवल (9 में निर्धारित) कोशिकाओं के बीच तुलना की जा सकती है जब उनके सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु एक समान कोण पर जुड़ रहे हैं।
- छवि ढेर में प्रासंगिक छवि पर डबल क्लिक करें। का चयन करें "पीप्रदर्शन सेटिंग "टैब" में "रंग seudo।
- retardance को मापने के लिए। जूम-इन छवि पर। 'क्षेत्र' का चयन करें और ब्याज के सभी क्षेत्रों को चिह्नित। "क्लिपबोर्ड को कॉपी" सभी मूल्यों "माप" टैब और करने के लिए ले जाएँ।
- एक्सेल में डेटा स्थानांतरण और आवश्यक जानकारी (retardance के क्षेत्र मतलब है) निकाल सकते हैं। डेटा मानक के अनुसार।
नोट: स्लाइस के बीच मोटाई में मतभेद के लिए खाते में करने के लिए, मूल्यों स्लाइड में एक विशेष सेल की दीवार बढ़त के सापेक्ष व्यक्त करते हैं। को सामान्य करने के लिए, औसत retardance एक ही छवि में एक अलग सेल दीवार की औसत retardance द्वारा ब्याज की सेल की दीवार के लिए इसी विभाजित। उदाहरण के लिए, बाहरी एपिडर्मल सेल की दीवार हमारे अध्ययन में भीतरी cortical सेल की दीवार के लिए सामान्यीकृत किया गया था।
- एक्सेल में डेटा स्थानांतरण और आवश्यक जानकारी (retardance के क्षेत्र मतलब है) निकाल सकते हैं। डेटा मानक के अनुसार।
- जड़ के अनुसार कम से कम 3 वर्गों के लिए माप दोहराएँ, नमूना प्रति 3 जड़ों की एक न्यूनतम के साथ।
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Representative Results
हम brassinosteroids (BRS) के लिए सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के प्रभाव का अध्ययन, एक मॉडल के अंग के रूप में 15-17 Arabidopsis जड़ का उपयोग कर। जब बीआर रिसेप्टर BRI1 लक्ष्य रखा गया है, bri1 उत्परिवर्ती की पृष्ठभूमि, एपिडर्मल कोशिकाओं गैर बालों की कोशिकाओं बुलाया के एक सबसेट (चित्रा 2A, बी), यह पड़ोसी कोशिकाओं की दिशाहीन सेल विस्तार, और पूरे जड़ विकास को रोकता है 15 करने के लिए। Polscope विश्लेषण तंत्र इस निषेध अंतर्निहित प्रकट करने के लिए किया गया था। जड़ जंगली प्रकार से और गैर-बाल कोशिकाओं में BRI1 व्यक्त लाइनों से प्राप्त की अनुदैर्ध्य वर्गों केवल, सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु (चित्रा -2 सी, डी, और के रूप में 9.2.3 में समझाया) के समान रुख दिखाया है, क्रिस्टलीय के रिश्तेदार संचय की तुलना सक्षम करने के लिए मेरिस्टेमेटिक और elongating कोशिकाओं, इन क्षेत्रों (चित्रा 2 ई, एफ) से लिया पार वर्गों का उपयोग करने में सेलूलोज। इस विश्लेषण से पता चला है एक correlatगैर-बाल कोशिकाओं में BRI1 अभिव्यक्ति और क्रिस्टलीय सेलूलोज के स्थानीय संचय के बीच आयन। ऊपर का पालन करें प्रयोगों से पता चला है कि isoxaben की कम मात्रा से सेल्यूलोज synthase के हल्के निषेध इन कोशिकाओं है, जो बारी में, आंशिक रूप से विकास निषेध बहाल, दिशाहीन सेल विस्तार और रूट की लंबाई 15 बढ़ावा देने के द्वारा में क्रिस्टलीय सेलूलोज के स्तर को कम कर दिया।
चित्रा 1:। ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी प्रणाली Polscope प्रणाली (डी) एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (ए), एक सीसीडी डिजिटल कैमरा (बी), विश्लेषक और एक हरे रंग की लिक्विड क्रिस्टल इसके प्रकाश स्रोत (सी) के शीर्ष पर स्थित से लैस होते हैं। Abrio सॉफ्टवेयर छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। यहां क्लिक करें टीओ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 2: सेल दीवार संरचना का विश्लेषण Polscope। (ए) Arabidopsis प्राथमिक उसके घटक ऊतकों के रेडियल संगठन दिखा जड़ के पार अनुभाग। इनमें से एपिडर्मल गैर बालों की कोशिकाओं (एन); बालों की कोशिकाओं (एच) और कोर्टेक्स (सी) के रूप में चिह्नित कर रहे हैं। बार, 10 माइक्रोन। (बी) व्यक्त BRI1-GFP जड़ों के Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों गैर बालों की कोशिकाओं को निशाना बनाया। सफेद, पीआई धुंधला है कि कोशिकाओं, हरा, BRI1-GFP अभिव्यक्ति का प्रतीक है। बार, 20 माइक्रोन। (सी) जंगली प्रकार से और गैर-बाल कोशिकाओं में BRI1 व्यक्त पौधों से प्राप्त जड़ों के अनुदैर्ध्य वर्गों। सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के कोण (यानी, रंग और सेल लंबे अक्ष, रूट की लंबी अक्ष को दर्शाती के बीच कोण) दो पंक्तियों के बीच इसी तरह की है। सेल की दीवार इसकी एल साथ सेल flankingओंग अक्ष घेर लिया है; कोण निशान छायांकित सेल की दीवार जो मापा जाता है प्रतिनिधित्व करते हैं। बार, 50 माइक्रोन। (डी) एपिडर्मल सेल दीवारों में सेलूलोज सूक्ष्मतंतु कोण की मात्रा। नोट मेरिस्टेमेटिक कोशिकाओं में मौजूद कोणों के उच्च परिवर्तनशीलता (यानी, मेरिस्टेमेटिक जोन, MZ) के रूप में बॉक्स साजिश से परिलक्षित, संक्रमण क्षेत्र (चतुर्थ) में कोशिकाओं की तुलना में। जंगली प्रकार और पौधों गैर बालों की कोशिकाओं में BRI1 व्यक्त बीच इसी तरह की औसत सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु कोण उनके इसी विकासात्मक क्षेत्र की कोशिकाओं में क्रिस्टलीय सेलूलोज संचय की तुलना में सक्षम बनाता है। प्रत्येक नमूने में औसत कोण ये वही संयंत्र पृष्ठभूमि के (एफई) ट्रांसवर्स जड़ वर्गों, प्रकाश retardance मोड में दिखाया गया है एक लाल रेखा ने संकेत दिया है।। 17 एनएम - रंग पैमाने के 0 प्रकाश retardance प्रतिनिधित्व करता है। विभज्योतक (ई) और बढ़ाव के लिए इसी वर्गों (एफ) जोनों दिखाए जाते हैं। बार, 50 माइक्रोन। बाहरी एपिडर्मल सेल की दीवार और भीतरीcortical कोशिका दीवार घेर लिया है। (G) retardance मूल्यों polscope छवियों से गणना के रूप में की मात्रा। मान बाहरी एपिडर्मल सेल की दीवार और भीतरी cortical सेल की दीवार के बीच retardance के अनुपात के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। ध्यान दें कि केवल इन कोशिकाओं में BRI1 व्यक्त लाइनों में गैर-बाल कोशिकाओं में क्रिस्टलीय सेलूलोज के उच्च बयान। + एसई मतलब है, 40 <n <600; (**) पी <0.01; (***) पी <0.001 एक दो पूंछ टी परीक्षण में। चित्रा अपनाया और 15 से संशोधित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ, हम Arabidopsis जड़ों रचना विभिन्न ऊतकों में क्रिस्टलीय सेलूलोज के संचय के निर्धारण के लिए एक तरीका मौजूद है, संरचनात्मक जानकारी को बनाए रखते हुए। जैसे, यह एक सेलुलर संकल्प पर पौधों में विकास की प्रक्रिया को समझने की दिशा में एक अतिरिक्त कदम प्रदान करता है। इस विधि को भी अतिरिक्त पौधों की प्रजातियों और अंगों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।
अंकों की संख्या जब विधि को लागू करने पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, क्रिस्टलीय सेलूलोज एक दिया जड़ खंड में संचय और अलग जीनोटाइप से वर्गों में उपचार के बीच ऊतकों के बीच तुलना की जा सकती है, अगर उनकी सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण के समान है। सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु उन्मुखीकरण सेल की दीवार 18 में से एक के चेहरे युक्त अनुदैर्ध्य अनुभाग में चुना गया है। इसलिए, अनुदैर्ध्य वर्गों की श्रृंखला, सबसे भीतरी लोगों के लिए बाहर से, जड़ों से अलग ऊतकों को कवर, Analys सक्षमविभिन्न ऊतकों में सेलूलोज सूक्ष्मतंतु के उन्मुखीकरण, किसी दिए गए विकास के चरण में की है। यहाँ दिखाए गए उदाहरण में, एपिडर्मिस की मेरिस्टेमेटिक कोशिकाओं 140 डिग्री के एक औसत सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के कोण के साथ सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के झुकाव की एक विस्तृत श्रृंखला, के एक औसत सेल्यूलोज सूक्ष्मतंतु के कोण के साथ है, जबकि एपिडर्मिस की elongating कोशिकाओं को एक और अधिक संगठित संरचना है 120 डिग्री। इन मापों जंगली प्रकार और ब्याज की उत्परिवर्ती के बीच इसी तरह के थे, जिससे उनके रिश्तेदार क्रिस्टलीय सेलूलोज संचय के एक विश्वास तुलना की अनुमति के लिए इसी प्रकार की कोशिकाओं और विकास के क्षेत्र में।
दूसरे, विभिन्न वर्गों की चौड़ाई में परिवर्तनशीलता प्रकाश retardance के स्तर को मापा प्रभावित कर सकता। यह एक अलग ऊतक (कोर्टेक्स कोशिकाओं) का retardance माप के लिए ब्याज (एपिडर्मल कोशिकाओं) के ऊतक के कच्चे retardance माप सामान्य से यहां उन्हें धोखा दिया है। सामान्यीकृत मूल्यों की गिरफ्तारीई तो तुलना (चित्रा 2 ई-जी देखें)।
अंत में, अनुप्रस्थ वर्गों जड़ के साथ, विभिन्न विकास क्षेत्रों पर कब्जा। क्रॉस सेक्शन में इन क्षेत्रों की पहचान डेटा की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। अनुभाग में सबसे बाहरी पार्श्व जड़ टोपी सेल परत की हानि एक सीधा क्षेत्र मार्कर शामिल। सामान्य में, कोशिकाओं को अपनी तेजी से विस्तार जब पार्श्व जड़ टोपी का सबसे पुराना सेल कोशिका मृत्यु प्रोग्राम किया आए शुरू, जिसके बाद, असुरक्षित एपिडर्मिस सबसे बाहरी ऊतक 19 हो जाता है।
वर्तमान में, तरीकों कि बनाम अनाकार सेल्यूलोज डोमेन क्रिस्टलीय के अनुपात के एक सेलुलर संकल्प उपाय प्रदान कमी कर रहे हैं। वास्तव में, यह भी यहाँ प्रस्तुत विधि से एक सीमा है। हालांकि, क्रिस्टलीय सेल्यूलोज से प्रति के संचय संवाद करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण अग्रिम है, क्रिस्टलीय सेलूलोज के रूप में उच्च के रिश्तेदार का स्तर संभावना एक अधिक rendersवृद्धि की तन्यता ताकत के साथ मजबूत सेल की दीवार। उच्च संकल्प उपकरणों के विकास ठीक संरचना का निर्धारण करने के लिए अपने यांत्रिक गुणों के साथ सेल की दीवार एक भविष्य चुनौती बनी हुई है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100 µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. Control of Arabidopsis root development. Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
