Introduction
La parete cellulare vegetale è una struttura dinamica. cellule in crescita sono circondate da una parete cellulare primaria, la cui organizzazione permette alle cellule di espandersi. Cellule che cessano di crescere deposito una parete secondaria più rigida che migliora il supporto meccanico della pianta. Entrambe le pareti cellulari sono composti microfibrille di cellulosa annegate in una matrice di polisaccaridi di diverse strutture (ad esempio, emicellulosa e pectina) che variano di tutti i diversi stadi di sviluppo e tessuti 1,2. Cellulosa viene sintetizzato come catene di (1,4) -β-D-glucano che sono strettamente allineati a formare la microfibril di una struttura cristallina. cellulosa amorfo si riferisce alle regioni in cui le catene glucano sono meno ordinate. Il rapporto tra il cristallino ei domini amorfi è un parametro pensato per influenzare le proprietà meccaniche della parete cellulare, fornendo resistenza meccanica e caratteristico viscoelastico rispettivamente 3. Diversi metodi sono statisviluppato per rilevare e quantificare le due forme di disposizione di cellulosa, tra i quali la diffrazione a raggi X e polarizzazione incrociata / angolo magic filatura NMR allo stato solido 4. Diffrazione di raggi X può essere utilizzato per determinare la percentuale di cristallina rispetto domini cellulosa amorfi nel campione 5. Un metodo alternativo utilizza frazionamento di contenuti parete cellulare in materiale acido insolubile e acido solubile, per distinguere tra il cristallino e cellulosa amorfa o altri polimeri, rispettivamente. In questo approccio, incorporazione di glucosio marcato ([14 C] glucosio) viene utilizzato per quantificare il 6,7 cellulosa. Questi metodi richiedono grandi quantità di materiale vegetale per le analisi di organi interi, nella migliore delle ipotesi, e, di conseguenza, sono adeguatamente sensibili a variazioni tessuto-specifica nella struttura della parete cellulare. Visualizzazione microfibrille di cellulosa ad una risoluzione cellulare può essere ottenuto in studi di imaging vivi combinati con coloranti fluorescenti 8,9, che può identificare variazionil'orientamento delle microfibrille di cellulosa. Tuttavia, questi coloranti non sono utilizzati per la quantificazione, non sono specifici a cristallino cellulosa e possono interferire con la normale struttura della parete cellulare 8. PolScope è una tecnica di imaging che si basa sulla capacità di cellulosa cristallina dividere fasci di luce e ritardare parte della luce 10. ritardo luce è più forte per microfibrille che giacciono perpendicolarmente alla direzione di propagazione della luce. Per microfibrille con orientamento simile, maggiore è il grado di cristallinità, maggiore è il ritardo di luce 11. Quindi, PolScope viene usato per studiare sia i livelli relativi e l'orientamento delle microfibrille di cellulosa.
Radici presentano crescita lineare, durante il quale le cellule originari alla nicchia di cellule staminali, sulla punta della radice, subire una serie di divisioni cellulari, prima che rapidamente si espandono 12. Le cellule che compongono la radice si espandono in un unidirezionale (anisotropico)maniera, come dettato dalle piccole ormoni molecola di segnalazione che hanno un impatto le proprietà della parete cellulare 13. Risposte differenziale ormoni, nel tempo e nello spazio, forniscono un mezzo per assicurare una crescita equilibrata organo 14. Quindi, l'analisi ad alta risoluzione di struttura della parete cellulare in grado di fornire importanti informazioni necessarie per comprendere meglio la connessione tra le risposte specifiche per tipo di cellule per la crescita dell'intero organo. Qui, si segnala la realizzazione di PolScope per studiare l'accumulo di tessuto-specifica di cellulosa cristallina nelle radici di Arabidopsis, come osservato nelle sezioni anatomiche di alta qualità. Questo metodo ha recentemente scoperto l'accumulo specifico tipo di cellule di cellulosa cristallina in risposta alla perturbazione spaziale delle attività ormonale 15.
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Protocol
1. crescita delle piante
- Superficie sterilizzare i semi.
- Sterilizzare semi (fino a 30 mg) con il metodo a umido oa secco. Ad esempio, per il metodo di sterilizzazione a secco, aggiungere 1 ml glaciale HCl 37% in 50 ml di candeggina, in un bicchiere di vetro in un essiccatore chiuso per almeno 4 ore e fino a tutta la notte. Eseguire questo passaggio in una cappa chimica.
- Diffondere i semi sterili su piastre di agar con impianto di 0,8% a 0.5x Murashige & Skoog (MS). Avvolgere le piastre con parafilm o nastro poroso e coprire con un foglio di alluminio.
- Conservare le piastre a 4 ° C per 1 - 4 giorni per promuovere la germinazione uniforme.
- Trasferire le piastre ad una camera di crescita adatto per la coltivazione di piante di Arabidopsis. Posizionare le piastre verticalmente per mantenere la crescita delle radici sopra del mezzo agar e per impedire la penetrazione.
- piantine di trasferimento di fissativo 7 giorni dopo la germinazione (DAG).
2. Fissazione
- Preparare 50 ml Richardson Solution combinando volumi uguali di 1% borace (agente di buffer), 1% Blu di metilene e l'1% Azure (coloranti istologici) in acqua bidistillata. Filtrare attraverso una siringa Driven 0,22 micron Unità di PVDF filtro prima dell'uso.
- Preparare 50 ml di fissativo: 1,25% glutaraldeide in 0,05 M di sodio Cacodylate (agente tampone).
Nota: Questi materiali sono tossici e devono essere trattati in una cappa chimica. - Aggiungere 100 pl di soluzione di Richardson (vedere 2.1) alla soluzione di fissaggio (vedi 2.2) per ottenere la soluzione finale fissazione.
- Mark ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con il nome del campione corrispondente.
- Mettere 2 - 3 ml di soluzione finale di fissaggio (vedi 2.3) nei pozzetti, in modo che le piantine, una volta trasferiti, saranno interamente coperti in un liquido.
- Trasferire accuratamente, usando pinze, fino a 10 piantine a ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con Parafilm. Conservare a 4 ° C, al buio, per almeno una notte, e fino ad una settimana.
3. disidratazione
- <li> Disidratare piantine. trasferirli tra i pozzi di nuovi 6 pozzetti, contenente concentrazioni crescenti di etanolo, come elencato qui: 10% di etanolo per 15 min; 30% di etanolo per 15 min; 50% di etanolo per 15 min; 70% di etanolo per 15 min; 85% di etanolo per 15 min; 95% di etanolo per 15 min; 95% di etanolo a 4 ° C, overnight, al minimo. Maneggiare piantine da loro afferrando con cura dai loro cotiledoni, preferibilmente con una pinza di plastica.
4. Infiltrazione
- Preparare mezzo di infiltrazione. Mescolare il contenuto di 1 sacchetto del kit historesin attivatore con 50 ml kit liquido resina di base in una piccola bottiglia di vetro. Mescolare con calamita per 20 min. medio infiltrazione può essere conservato a 4 ° C per alcune settimane.
- Mark ciascun pozzetto di una nuova piastra da 6 pozzetti con il nome del campione corrispondente e riempire con 2 - 3 ml di terreno infiltrazione.
- Trasferire le piantine dalla soluzione di etanolo al 95% al mezzo di infiltrazione con pinze. Assicurarsi che le piantine sono fully coperti dal mezzo.
- Conservare a 4 ° C per almeno 4 giorni, per garantire la massima penetrazione nei tessuti vegetali.
5. Blocco Preparazione
- Mettere piccole etichette, matita contrassegnati con il nome del campione, all'interno di ogni ben di embedding stampi.
- Preparare mezzo di inclusione con l'aggiunta di 1 ml di indurente a 15 ml di mezzo di infiltrazione (vedi 4.1). Non tentare di preparare un volume minore di 15 ml, per evitare problemi di polimerizzazione.
- Riempire la metà di ciascun pozzetto nello stampo con 200 microlitri mezzo di inclusione e coprire con un pezzo proiezione Overhead tagliare alla forma dello stampo, ma per la taglia 1 mm maggiore su ogni lato. Incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore, per permettere la polimerizzazione. Non superare 5 ore.
- Preparare una serie supplementare di mezzo di inclusione (vedi 5.2) e tenere in ghiaccio, al fine di evitare la polimerizzazione mentre apici radicali vengono disposti nello stampo.
- Tagliare ogni punta della radice in un ambito dissezione utilizzando bisturi e con molta attenzione posizione It: verticalmente per le sezioni trasversali o orizzontalmente per sezione longitudinale, a circa 2 - 3 mm dal bordo dello stampo. Riempire lo stampo completamente con soluzione bloccante e la copertura con un film in testa. Si noti che la soluzione di saturazione si restringerà leggermente una volta polimerizzato.
- Mantenere a temperatura ambiente per 2 ore, al minimo.
- Per asciugare i blocchi, mettere in una scatola con gel di silice asciutta e lasciare a temperatura ambiente per una notte, al minimo.
6. sezionamento
- Preparare coltelli in vetro da canne di vetro con un produttore di coltello. Utilizzare i coltelli di vetro per il sezionamento dei tessuti. Tagliare la bacchetta di vetro in un quadrato e poi tagliare il quadrato in diagonale per la produzione di due coltelli, utilizzando uno strumento di diamante di punteggio.
- blocco di un tratto in 2 - 3 micron fette di larghezza, utilizzando una macchina di sezionamento. Mettere le fette su un vetrino, sulla parte superiore delle goccioline di acqua distillata e posizionare il vetrino su un blocco di calore impostato su fuoco basso (50 - 60 ° C), fino acqua evapora.
- Diluire soluzione Richardson (vedi 2.1) allo 0,2% della soluzione originale e utilizzare 1 ml di esso per coprire le fette. Posizionare sul blocco di calore per 5 secondi e poi lavare con acqua distillata.
- Asciugare il vetrino su una piastra calda. Osservare sotto un ambito dissezione e segnare il retro del vetrino con un marcatore, per indicare la posizione delle fette di interesse, per facilitare la loro successiva identificazione al microscopio.
- Aggiungere 100 ml di mezzo di montaggio e coprire con un vetrino.
8. Acquisizione di immagini
- Posizionare il vetrino coperto che contiene le sezioni di radice sotto un microscopio ottico dotato di sistema PolScope adatto per ottenere le informazioni ritardante e di un filtro polarizzatore / interferenza ottica (Figura 1 dC).
- Selezionare ingrandimento che permette chiara visualizzazione dell'intero campione (ad esempio, 40X in questo studio) e mettere a fuoco il Microscopioe su un campo vuoto che contiene la sezione di blocco, ma nessuna sezione radice. Prova a trovare una regione pulita senza macchie. Utilizzare questa regione per impostare lo sfondo.
- Impostare il sistema di imaging e parametri software: Imposta l'intervallo a 17 nm. Applica "Esposizione automatica" e ottenere un'immagine di sfondo dal campo vuoto (vedi 8.2). Una immagine di sfondo viene utilizzato per esperimento.
9. Analisi PolScope di cellulosa microfibril Orientamento
- Analisi di sezioni longitudinali.
- Inserire una diapositiva contenente sezioni longitudinali al microscopio e ottenere un'immagine ritardanti di esso. Mettere a fuoco il microscopio su una sezione principale di interesse. Fornire un nuovo nome di file.
- Scattare una foto Abrio (immagine con informazioni ritardo) attraverso la finestra "Live Abrio". Assicurarsi di catturare una sezione che comprende la parete cellulare, che può essere identificato dalla cellulosa macchiato corre lungo la periferia della cellula, come mostrato nella Figura 2C.
- Analisi delle immagini.
- Fare doppio clic sull'immagine rilevante nella serie di immagini. Selezionare "Colore Orientamento Pseudo" nella scheda "Impostazioni di visualizzazione".
- Per stimare l'angolo di cellulosa microfibril, corrispondere la relativa ombra della parete cellulare a quella nella ruota dei colori.
NOTA: La ruota colore nella Figura 2C riflette l'asse lento della luce disteso lungo la microfibril che indica la direzione lungo l'asse delle microfibrille. L'angolo di microfibrille di cellulosa è l'angolo indicato dal colore e l'asse lungo della cella. Ad esempio, la cella allungamento nel cestello mostra colore ciano, inclinata di circa 90 ° rispetto all'asse delle cellule. - Per quantificare l'angolo medio microfibril nella parete cellulare, utilizzare lo strumento "ritardante e Azimuth Stamp" dalla barra degli strumenti del software. Durante la selezione lo strumento, punta e clicca sulla regione di interesse per l'immagine ottenuta.
NOTA: Questo will risultato nella visualizzazione degli angoli (azimut) in gradi (Figura 2C). - In un accesso aperto polarizzata software di analisi di immagine di luce alternativa, il pranzo plug-in "Pol-Analyzer" dal menu plugin. Nella nuova finestra che si apre, selezionare la scheda "Birifrangenza" e aprire e quindi salvare il file di sfondo e il file di immagine.
- Nella finestra di immagine, selezionare "Spec." e regolare la 'dimensione dei pixel ROI' (uso di 5 pixel per questo studio). Nella "Spec." finestra, selezionare "Mostra valori nella tabella dei risultati".
- Utilizzare lo strumento Poligono per segnare la regione di interesse nella finestra dell'immagine. Selezionare "Linee Orientamento" per ottenere l'orientamento del microfibril cellulosa.
NOTA: Ciò comporta la visualizzazione degli angoli (azimut) in gradi.
NOTA: L'angolo medio calcolato da uno dei due metodi dovrà essere poi normalizzata al posizionamento della sezione di radice lungo la slitta. Per correggere la deviazione dallail posizionamento orizzontale della sezione di radice intera lungo la slitta, quantificare l'angolo medio microfibril della parete cellulare fiancheggiano la cella lungo il suo asse lungo (cioè perpendicolare alla sezione e lungo l'asse crescita delle radici, Figura 2C). Questo angolo è di 180 °, quando la parte di radice viene accuratamente posizionato lungo la slitta. Per calcolare l'angolo microfibril, sottrarre l'angolo microfibril media misurata della parete cellulare fiancheggiante da 180 °. Aggiungere la differenza portato all'angolo media misurata microfibril della parete cellulare che giace piatto sul vetrino.
10. Analisi PolScope del cristallino cellulosa accumulo
- Utilizzare sezioni trasversali (cross). Si noti che l'accumulo di cellulosa cristallina può essere paragonata solo tra cellule quando i loro microfibrille di cellulosa sono allineate con un angolo simile (come determinato a 9).
- Fare doppio clic sull'immagine rilevante nella serie di immagini. Selezionare "Pseudo colore "nella scheda" Impostazioni di visualizzazione ".
- Per misurare ritardante. Zoom-in sull'immagine. Selezionare "Regione" e contrassegnare tutte le regioni di interesse. Passare alla scheda "misure" e "Copia negli Appunti" tutti i valori.
- Trasferire i dati in Excel ed estrarre le informazioni richieste (media regione di ritardata propagazione). Normalizzare i dati.
NOTA: per tenere conto delle differenze di spessore tra le fette, esprimono i valori relativi ad un bordo specifico parete cellulare nella diapositiva. Per normalizzare, dividere il ritardo di media corrispondente alla parete cellulare di interesse dal ritardo della media di una parete cellulare diverso nella stessa immagine. Ad esempio, la parete cellulare epidermico esterno era normalizzata alla parete cellulare corticale interna nel nostro studio.
- Trasferire i dati in Excel ed estrarre le informazioni richieste (media regione di ritardata propagazione). Normalizzare i dati.
- Ripetere le misurazioni per almeno 3 sezioni per radice, con un minimo di 3 radici per campione.
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Representative Results
Studiamo l'impatto delle risposte specifiche per tipo di cellula brassinosteroids (BRS), usando la radice Arabidopsis come modello organo 15-17. Quando il recettore BRI1 BR si rivolge, sullo sfondo di BRI1 mutante, a un sottoinsieme di cellule epidermiche chiamate cellule non-capelli (Figura 2A, B), inibisce l'espansione delle cellule unidirezionale di cellule vicine, e la crescita integrale della radice 15. analisi PolScope è stata eseguita a rivelare il meccanismo alla base di questa inibizione. Sezioni longitudinali della radice ottenuto da wild type e dalle linee esprimenti BRI1 in cellule non-capelli solo, mostravano simile orientamento delle microfibrille di cellulosa (Figura 2C, D, e come spiegato in 9.2.3), consentendo il confronto della relativa accumulazione di cristallina cellulosa in cellule meristematiche e allungando, utilizzando sezioni trasversali prese da queste zone (Figura 2E, F). Questa analisi ha mostrato una correlation tra espressione BRI1 in cellule non-capelli e l'accumulo locale di cellulosa cristallina. Follow up esperimenti hanno dimostrato che l'inibizione mite cellulosa sintasi da basse concentrazioni di isoxaben abbassa il livello di cellulosa cristallina in queste cellule, che a sua volta, parzialmente restaurato inibizione della crescita, promuovendo l'espansione delle cellule unidirezionale e la lunghezza della radice 15.
Figura 1:. Luce polarizzata Sistema Microscopia Il sistema PolScope costituito da un microscopio ottico (A), dotato di una fotocamera CCD digitale (B), analizzatore e un cristallo liquido verde situato in cima alla sua sorgente luminosa (C) (D). software Abrio è stato utilizzato per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. clicca qui to vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi PolScope di Composizione parete cellulare. (A) Sezione della radice primaria Arabidopsis mostrando organizzazione radiale dei suoi tessuti costituenti. Di questi, le cellule epidermiche non capelli (N); cellule ciliate (H) e la corteccia (C) sono contrassegnati. Bar, 10 micron. (B) le immagini al microscopio confocale di radici che esprimono BRI1-GFP mirati a cellule non-capelli. Bianco, PI colorazione che segna il cellule, Verde, espressione BRI1-GFP. Bar, 20 micron. (C) sezioni longitudinali delle radici ottenute da wild type e da piante che esprimono BRI1 in cellule non-capelli. L'angolo di microfibrille di cellulosa (cioè, l'angolo tra il colore e l'asse lungo cellulare, che riflette l'asse lungo della radice) è simile tra le due linee. La parete cellulare che fiancheggia la cellula lungo il suo lasse ong è circondata; contrassegno angolo rappresentano la parete cellulare ombreggiata che viene misurata. Bar, 50 micron. (D) Quantificazione dell'angolo microfibril di cellulosa nelle pareti delle cellule epidermiche. Si noti l'elevata variabilità degli angoli presenti nelle cellule meristematiche (vale a dire, la zona meristematica, MZ) rispetto alle cellule nella zona di transizione (TZ), come risulta dal diagramma a riquadri. Il simile angolo medio di cellulosa microfibril tra wild type e piante che esprimono BRI1 in cellule non-capelli consente il confronto di accumulo di cellulosa cristallina nelle cellule della loro zona di sviluppo corrispondente. L'angolo medio di ciascun campione è indicato da una linea rossa. Sezioni (EF) trasversale alla radice di questi stessi sfondi vegetali, mostrate in modalità ritardo della luce. scala di colori rappresenta la luce ritardata propagazione di 0-17 nm. Sezioni corrispondenti al meristema (E) e l'allungamento (F), le zone mostrate. Bar, 50 micron. La parete esterna delle cellule epidermiche e interioreparete cellulare corticale sono circondati. (G) Quantificazione dei valori ritardanti, come calcolato dalle immagini PolScope. I valori sono espressi come rapporto tra ritardante tra la parete cellulare epidermica esterna e la parete cellulare corticale interna. Si noti che l'elevata deposizione di cellulosa cristallina in cellule non ciliate linee esprimenti BRI1 solo in queste cellule. Media + SE; 40 <n <600; (**) P <0.01; (***) P <0.001 in una t-test a due code. Il dato è stato adottato e modificato da 15. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo un metodo per determinare l'accumulo di cellulosa cristallina nei diversi tessuti che compongono le radici di Arabidopsis, mantenendo informazioni anatomiche. Come tale, fornisce un ulteriore passo verso la comprensione processi di crescita nelle piante con una risoluzione cellulare. Questo metodo può essere applicato anche per lo studio di specie vegetali aggiuntivi e organi.
Un certo numero di punti deve essere considerato quando si applica il metodo. Prima accumulo, cellulosa cristallina in una determinata sezione di radice può essere paragonato tra tessuti, tra sezioni di diversi genotipi e tra trattamenti se l'orientamento dei loro microfibrille di cellulosa è simile. Microfibrille di cellulosa orientamento è determinato in sezione longitudinale contenente una faccia della parete cellulare 18. Quindi, la serie di sezioni longitudinali, che copre i tessuti distinte delle radici, dall'esterno verso il maggior quelli interni, abilitazione analysè dell'orientamento microfibrille di cellulosa nei diversi tessuti, in un determinato stadio di sviluppo. Nell'esempio qui illustrato, le cellule meristematiche dell'epidermide avere una vasta gamma di microfibrille di cellulosa orientamenti un angolo medio microfibrille di cellulosa di 140 °, mentre le cellule in allungamento dell'epidermide hanno una struttura più organizzata, con un angolo medio microfibrille di cellulosa di 120 °. Queste misure erano simili tra wild type e il mutante di interesse, consentendo in tal modo un confronto sicuri della loro accumulo cellulosa cristallina relativa, nei corrispondenti tipi di cellule e di zona di sviluppo.
In secondo luogo, la variabilità nella larghezza delle diverse sezioni può influenzare i livelli di luce ritardo della misurati. Questo è aggirato qui normalizzando le misure ritardanti grezzi del tessuto di interesse (cellule epidermiche) per la misurazione ritardata propagazione di un tessuto diverso (cellule della corteccia). I valori normalizzati are poi confrontato (Vedi Figura 2E-G).
Infine, le sezioni trasversali lungo la radice, catturano diverse zone di sviluppo. Identificazione di queste zone in sezione trasversale è importante per l'interpretazione dei dati. Perdita dello strato di cellule più esterno laterale cappa radicolare nella sezione comprendono zone marker semplice. In generale, le cellule iniziano la loro rapida espansione quando la cellula più antica del tappo radici laterali subisce la morte cellulare programmata, dopo di che, l'epidermide non protetti diventa il tessuto più esterno 19.
Attualmente, i metodi che forniscono una misura risoluzione cellulare del rapporto tra il cristallino contro i domini cellulosa amorfi sono carenti. Infatti, questo è anche uno limitazione del metodo qui presentato. Tuttavia, la sua capacità di comunicare l'accumulo di cellulosa cristallina di per sé è un progresso significativo, come alti livelli relativi di cellulosa cristallina probabile rende un piùparete cellulare robusto con una maggiore resistenza alla trazione. Sviluppo di strumenti ad alta risoluzione per determinare con precisione la composizione della parete cellulare a fianco le sue proprietà meccaniche rimane una sfida futura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100 µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
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