Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в<em> Arabidopsis</em> Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
Стенка растительной клетки является динамической структурой. Растущие клетки окружены первичной клеточной стенки, организация, которая позволяет клеткам расширяться. Клетки, которые перестают расти депозит более жесткую вторичную стенку, которая повышает механическую поддержку завода. Обе клеточные стенки состоят из микрофибрилл целлюлозы , внедренных в матрицу из полисахаридов различной структуры (например, гемицеллюлоза и пектин) , которые различаются по различным стадии развития и тканей 1,2. Целлюлоза синтезируется в виде цепочек (1,4) & beta; -D-глюкана, которые тесно выровнены с образованием микрофибрилла кристаллической структуры. Аморфная целлюлоза относится к регионам, где менее упорядоченные глюкана цепи. Соотношение между кристаллическими и аморфными областями является одним параметром считается, влияет на механические свойства клеточной стенки, обеспечивая механическую прочность и вязкоупругой характеристику, соответственно 3. Несколько методовразработана для обнаружения и количественного определения двух форм расположения целлюлозы, в том числе рентгеновской дифракции и кросс – поляризационной / магический угол спиннинг твердотельный ЯМР 4. Рентгеновской дифракции может быть использован для определения доли кристаллических по сравнению с аморфными областями целлюлозы в образце 5. Альтернативный метод использует фракционирование содержания клеточной стенки в нерастворимый в кислоте и кислотно-растворимого материала, чтобы проводить различие между кристаллической и аморфной целлюлозы или других полимеров, соответственно. При таком подходе, включение меченой глюкозы ([14 C] глюкоза) используется для количественного определения 6,7 целлюлозы. Эти методы требуют больших объемов растительного материала для анализов целых органов, в лучшем случае, и, следовательно, являются недостаточно чувствительны к изменению тканесецифического в структуре клеточной стенки. Визуализация микрофибрилл целлюлозы на клеточном разрешение может быть достигнуто в исследованиях живых изображений в сочетании с флуоресцентными красителями 8,9, который может идентифицировать изменения вориентация микрофибрилл целлюлозы. Тем не менее, эти красители не используются для количественной оценки, они не являются специфическими для кристаллической целлюлозы и может помешать нормальной структуры клеточной стенки 8. Polscope является метод визуализации , который зависит от способности кристаллической целлюлозы , чтобы разделить световые лучи и замедлить часть света 10. Свет отсталость является самым сильным для микроволокон, которые лежат перпендикулярно к направлению распространения света. Для получения микроволокон с аналогичной ориентации, тем выше степень кристалличности, чем больше света retardance 11. Следовательно, polscope используется для изучения как относительные уровни и ориентации микрофибрилл целлюлозы.
Корни демонстрируют линейный рост, в ходе которого клетки , происходящий в ниши стволовых клеток, на кончике корня, претерпевают ряд клеточных делений, прежде чем они быстро расширяться 12. Клетки, содержащие корень расширения в однонаправленном (анизотропной)манера, как это диктуется малых гормонов сигнальной молекулы , которые влияют на свойства клеточной стенки 13. Дифференциальная реакция на гормоны, во времени и пространстве, служат средством обеспечения роста 14 сбалансированный орган. Следовательно, высокое разрешение анализ структуры клеточной стенки может предоставить важную информацию, необходимую, чтобы лучше понять связь между ответами типа специфических клеток для всего роста органов. Здесь мы сообщаем о реализации polscope для изучения тканеспецифичную накопление кристаллической целлюлозы в Arabidopsis корни, как это наблюдается в высококачественных анатомических участках. Этот метод недавно обнаружили типоспецифической клеток накопление кристаллической целлюлозы в ответ на пространственное возмущение гормональной активности 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем метод для определения накопления кристаллической целлюлозы в различных тканях , образующих корни Arabidopsis, сохраняя при этом анатомической информации. Таким образом, он обеспечивает дополнительный шаг к пониманию процессов роста в растениях на клеточном разр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. Control of Arabidopsis root development. Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
