Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Ici, nous avons illustré en détail comment effectuer des injections fiables et précises et les enregistrements mono-cellulaires de haute qualité avec un système d'injection de pression "off-the-shelf". Bien que cette méthode d'administration du médicament a déjà été utilisé dans le comportement des singes (revue dans 17), le système présenté ici présente des avantages, examinés ci – dessous.
Comme cela est illustré sur la figure 4A, le système décrit ici peut fournir une mesure stable de l' activité du neurone unique avec ou sans injections pharmacologiques dans le voisinage immédiat du site d'enregistrement. Comme le montre la figure 4B, l'injection d'une substance de contrôle, une solution saline, n'a pas conduit à un changement de cadence de tir. Ce contrôle démontre que le procédé d'injection elle-même n'a aucune influence mesurable sur les propriétés de cuisson des neurones enregistrés.
La configuration spatiale de neurones, l'électrode d'enregistrement et micropipette est cruciale importance dans ces expériences. Bien qu'une mesure précise de leur position relative dans le tissu lors de l'enregistrement est pas possible, nous pouvons considérer et de contrôle pour les sources possibles de variance. Tout d'abord, lors de l'injection de volume il existe un risque que le neurone d'intérêt peut être déplacé à une distance de l'électrode d'enregistrement, ce qui affecte la stabilité des signaux enregistrés. Pour cette raison, il est prudent de comparer le taux d'allumage avant et après le bloc d'injection afin de vérifier la stabilité du signal. D' autre part, la configuration du tube de guidage du système d'enregistrement définit la distance entre les électrodes et micropipette (par ex., 305 um dans le système 3-canal concentrique utilisé dans cette expérience). Le système offre un contrôle de position précise pour la profondeur des électrodes et micropipette dans le tissu, la distance entre eux peut être minimisée en calibrant soigneusement la profondeur relative avant l'enregistrement (étape 3.5), et de les garder à une profondeur commune pendant les enregistrements.
ent "> limitations potentiellesL'insertion de la micro-pipette dans le système est plus exigeant que l'insertion de l'électrode, que le diamètre de la micropipette est légèrement plus grand et le matériau est plus fragile. En outre,joignant le tube à la broche de la micropipette est difficile car il implique un risque élevé de rupture de la partie supérieure de la micropipette. Cependant, la durée de vie d'un micropipette chargé avec succès est de plusieurs mois, même avec une utilisation quotidienne.
Dans la pratique, on n'a pas encore rencontré un blocage dans le système d'injection pendant le post-enregistrement nettoyage du système. Néanmoins, aucun contrôle "en ligne" est possible, et il y a un risque qu'un blocage physique (tel que le tissu à la pointe de micropipette) pourrait empêcher l'injection de substance. Il pourrait donc être souhaitable d'analyser les données de façon conservatrice, comme incluant uniquement les cellules dans une analyse plus approfondie qui montrent des changements significatifs dans la cuisson des taux entre contrôle et d'injection des blocs de l'expérience.
En dépit de leur petit diamètre, microélectrodes et pipettes vont déplacer les tissus du cerveau et peuvent causer des dommages aux tissus locaux. Ceci peut être minimisé en positionnant manuellement la pointe de thtubes de guidage e juste au-dessus de la dure-mère. Les électrodes pénètrent alors la dure-mère et leur intégrité est déduite en mesurant leurs impédances en ligne. Par la suite, la micropipette est insérée. Lors de l'utilisation de cette approche, l'élimination régulière du tissu au-dessus de la dure-mère est recommandé de réduire davantage le risque d'électrode ou d'une pipette de rupture.
Comparaison des méthodes alternatives
Le système utilisé ici présente des avantages évidents par rapport à d'autres systèmes d'injection sous pression. Un avantage fort est le diamètre de la micropipette (environ 100 pm), ce qui est la moitié de la taille d'autres sondes disponibles 17 et minimise ainsi les dommages aux tissus nerveux. Contrairement aux modèles précédents, le système actuel emploie spatialement séparé électrode d'enregistrement et de micropipette. Bien que d'autres systèmes offrent une plus petite distance entre l'électrode et la pipette, le système décrit ici permet de modifier la profondeur indépendantes des électrodes et une pipette, ainsi permiPrép distances relatives variables au sein d'une session d'enregistrement. Fait important, aucun compromis quant à la qualité de l'enregistrement doit être effectué, selon le système d'injection est une extension d'un dispositif d'enregistrement établi. Bien qu'un seul micropipette et donc une substance est utilisée dans ce protocole, il est possible d'injecter plusieurs substances au sein d'un procédé expérimental. Pour ce faire, plusieurs micropipettes peuvent être vissés dans les tubes de guidage séparés et reliés à des seringues montées dans les pompes d'injection individuelles. Enfin, la commande du système est aisée, car un seul programme d'ordinateur est nécessaire pour faire avancer les électrodes et micropipette, et d'effectuer l'injection sous pression pendant l'expérience.
En comparant l'injection sous pression à iontophorèse, il y a des avantages et des inconvénients. Par exemple, l'injection sous pression nécessite un plus grand volume à introduire dans le tissu que l'iontophorèse, augmentant ainsi le risque de déplacement des neurones. Le proto courantcol utilisé volumes dans la gamme nL, et nous avons rarement connu des changements notables dans la qualité du signal d'une cellule enregistrée. Le système permet également de plus grands volumes à injecter, ce qui est potentiellement utile pour les manipulations comportementales, mais pourrait avoir une incidence stabilité de l'enregistrement neuronal. Un net avantage de l'injection de pression sur l'ionophorèse est la plus grande variété de substances utilisables comme il n'y a pas d'obligation d'utiliser des substances chargées. Cependant, les valeurs de pH doivent être vérifiés et comparés entre les substances expérimentales et de contrôle (par exemple., Une solution saline).
La question peut se demander pourquoi utiliser la méthode établie de longue date de l'injection au lieu de nouvelles techniques de pression tels que optogénétique pour manipuler l'activité neuronale. Bien que bien établie chez les rongeurs, optogénétique est pas encore établie de manière fiable chez les singes rhésus. En particulier, elle ne permet pas encore la manipulation locale de cellules sélectives pour un type de neurotransmetteur particulier. À plus long terme, nous voyonsun grand potentiel pour la combinaison des avantages des manipulations pharmacologiques avec les avantages des manipulations optogentic dans l'élucidation de la base neurale de fonctions cognitives.
Ici, nous avons montré que l'injection sous pression peut être utilisé pour manipuler le plan pharmacologique d'une zone limitée localement dans le cerveau d'éveil, comportant des singes rhésus. Nous espérons que cette méthode inspire d'autres scientifiques pour enquêter sur les contributions neuromodulateurs à la dynamique de l'activité neuronale.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft par le biais du Centre de recherche en collaboration 889 «Mécanismes cellulaires du traitement sensoriel" à ST (Projet C04). Nous remercions Sina Plümer, Leonore Burchardt, Dirk prusse, Klaus Heisig et Ralf Brockhausen pour le soutien technique et liées aux animaux et nos collaborateurs dans l'unité de cellules souches du Primat Centre allemand, Dr. Katharina Debowski et Anna Magerhans, pour l'assistance technique dans le processus de filtration.
(-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
Deionized water | |||
Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |