Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
ここでは、「既製」圧力噴射システムで信頼性が高く、正確な注射と高品質の単セル記録を実行する方法を詳細に説明しています。薬剤送達のこの方法は、以前に(17に概説)サルの挙動で使用されてきたが、ここに提示システムは、以下のレビューの利点を有します。
図4(a)に示すように 、ここで説明したシステムは、記録部位のすぐ近くで、薬理学的注射でとせずに、単一ニューロン活動の安定した測定を提供することができます。 図4Bに示すように、対照物質、生理食塩水の注入は、発火率の変化をもたらしませんでした。この制御は、注入プロセス自体が記録されたニューロンの発火特性に測定可能な影響を及ぼさないことを示しています。
空間的なニューロンの構成、記録電極、およびマイクロピペットが重要ですこれらの実験で重要。記録時の組織におけるそれらの相対位置の正確な測定が可能ではないですが、我々が検討し、分散の可能なソースのために制御することができます。まず、容量注入中に関心のニューロンが記録された信号の安定性に影響を与え、記録電極から離れて変位するおそれがあります。そのためには、信号の安定性を確認するために注入ブロックの前後の発火率を比較することが賢明です。次に、記録装置のガイドチューブ構成は、電極とマイクロピペットとの間の距離を定義する( 例えば 、この実験に用いた同心の3チャネルシステム305ミクロン)。システムは、組織内の電極とマイクロピペットの深さの正確な位置制御を提供するので、それらの間の距離は注意深く(ステップ3.5)を記録し、記録時に共通の深さでそれらを保持する前に、相対的な深さを較正することによって最小限に抑えることができます。
ENT "> 潜在的な制限マイクロピペットの直径がやや大きく、材料がより壊れやすいようにシステムにマイクロピペットを挿入すると、電極挿入よりも厳しいです。加えて、それはマイクロピペットの上部を破壊する高いリスクを伴うようマイクロピペットのピンにチューブを接合することは困難です。しかし、正常にロードされたマイクロピペットの寿命があっても日常的に使用して、数ヶ月です。
実際には、我々はまだシステムのアフレコ洗浄中に噴射システム内の閉塞を発生していません。それにもかかわらず、何も「オンライン」のチェックは不可能であり、(そのようなマイクロピペットの先端で組織としての)物理的な閉塞は、物質の注入を防止するかもしれないという危険性があります。従って、このような実験の制御と注入ブロック間の発火率の有意な変化を示すさらなる分析における細胞のみを含むように、保守的にデータを分析することをお勧めかもしれません。
その小さい直径にもかかわらず、微小電極とピペットは、脳組織を変位され、いくつかの局所的な組織の損傷を引き起こし得ます。これは、手動で番目のチップを配置することによって最小化することができますちょうど硬膜上記電子案内管。電極はその後、硬膜を貫通し、その完全性は、オンラインでのインピーダンスを測定することにより推定されます。その後、マイクロピペットが挿入されています。このアプローチを使用する場合は、硬膜上記組織の定期的な除去は、さらに電極やピペット破損のリスクを軽減することをお勧めします。
代替的な方法と比較し
ここで使用されるシステムは、他の圧力噴射システムと比較して明らかな利点を示しています。一強い利点は、他の利用可能なプローブ17の半分の大きさであるため、神経組織の損傷を最小限にマイクロピペット(約100ミクロン)の直径です。以前の設計とは対照的に、現在のシステムは、空間的に分離された記録電極とマイクロピペットを用いています。他のシステムは、電極とピペットの間に小さい距離を提供するが、ここで説明するシステムは、このようにpermi、電極とピペットの独立した深さの変更を可能にしますレコーディング・セッション内の変数の相対的な距離をめの設定。注入システムは、確立された記録装置の延長であるように重要なのは、記録品質に関して妥協がなされる必要はありません。唯一のマイクロピペット、従って一つの物質は、このプロトコルで使用されるが、1つの実験手順内のいくつかの物質を注入することができます。これを達成するために、いくつかのマイクロピペットは、別個のガイド管にねじ込ま、個々の注入ポンプに取り付けられた注射器に接続することができます。一つのコンピュータプログラムは、電極とマイクロピペットを進めるために、実験中圧インジェクションを行うために必要とされるように、最終的に、システムを制御することは、容易です。
イオントフォレーシスに圧力注入を比較すると、相対的な長所と短所があります。例えば、圧力注入は、このように、神経変位の危険性を増加させる、イオントフォレーシスよりも組織内に導入される大きな容積を必要とします。現在のプロトcolがnLの範囲内のボリュームを使用して、我々はほとんど記録され、セルの信号品質の顕著な変化を経験しませんでした。システムはまた、行動操作に有用である可能性があるが、神経細胞の記録の安定性に影響を与える可能性があり、より大きなボリュームを注入することを可能にします。帯電した物質を使用するための要件がないとしてイオントフォレーシスを超える圧力注入の明らかな利点は、使用可能な物質の大きい品種です。しかし、pH値をチェックする必要があり、実験と対照物質との間で比較( 例えば 、生理食塩水)。
質問は、神経活動を操作するための代わりに、このような光遺伝学などの新しい技術の圧力注入の老舗の方法を使用することをなぜ発生する可能性があります。よくげっ歯類に設立されたが、光遺伝学は、まだ確実アカゲザルで確立されていません。特に、それはまだ特定の神経伝達物質のタイプの細胞の局所操作は選択できません。長期的には、我々が表示さ認知機能の神経基盤を解明にoptogentic操作の利点を持つ薬理学的操作の利点の組み合わせのための大きな可能性。
ここでは、圧力噴射がアカゲザルの挙動、薬理学的に覚醒の脳内の局所的に制限された領域を操作するために使用することができる方法を示しています。我々は、この方法は、神経活動のダイナミクスに神経調節貢献を調査するために他の科学者を鼓舞することを願っています。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、STの「感覚処理の細胞機構」(プロジェクトC04)共同研究センター889を介してドイツ学術協会の助成金によってサポートされていました。我々は、技術支援のために、ドイツ霊長類センター、博士カタリーナDebowskiとアンナMagerhansの幹細胞単位でシーナプルーマー、レオノーレBurchardt、ディルクPrüsse、クラウスハイジックと、技術および動物関連のサポートのためのラルフBrockhausenと私たちの協力者に感謝します濾過プロセス。
(-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
Deionized water | |||
Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |