Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Her har vi illustrert i detalj hvordan du skal utføre pålitelige og presise injeksjoner og høy kvalitet encellede innspillinger med en "off-the-sokkel" trykkinnsprøytning. Selv om denne metoden for levering av legemidler har tidligere blitt brukt i oppfører aper (anmeldt i 17), systemet som presenteres her har fordeler, anmeldt nedenfor.
Som vist i figur 4A, kan systemet som beskrives her tilveiebringe stabil måling av enkelt neuron aktivitet med og uten farmakologiske injeksjoner i umiddelbar nærhet av registreringsstedet. Som vist i figur 4B, injeksjon av en styre stoff, saltvann, ikke føre til en endring i skuddtakt. Denne kontrollen viser at injeksjonsprosessen i seg selv ikke har noen målbar innflytelse på avfyrings egenskapene til de registrerte nerveceller.
Den romlige konfigurasjon av nervecellen, innspilling elektrode, og mikropipette er av avgjørende betydning i disse eksperimentene. Selv om en nøyaktig måling av deres relative posisjoner i vevet under opptak ikke er mulig, kan vi vurdere og kontrollere for mulige kilder til avvik. Først i løpet av volum injeksjon er det en risiko for at neuron av interesse kan forskyves bort fra opptaks elektrode, som påvirker stabiliteten av registrerte signaler. Av den grunn er det klokt å sammenligne avfyringshastighet før og etter injeksjonen blokken for å kontrollere signalstabilitet. For det andre føringsrøret konfigurasjonen av opptakssystem definerer avstanden mellom elektrodene og mikropipette (f.eks., 305 mikrometer i det konsentrisk 3-kanalsystem som brukes i dette eksperimentet). Ettersom systemet gir presis posisjonskontroll for dybden av elektroder og mikropipette i vevet, kan avstanden mellom dem reduseres ved nøye kalibrering relativ dybde før opptak (trinn 3.5), og holde dem på et felles dybde under opptak.
ent "> Potensielle begrensningerInnsetting av mikropipette i systemet er mer krevende enn elektrode innsetting, som diameteren av mikropipette er litt større og materialet er mer skjøre. I tillegg,bli med i røret til pin av mikropipette er utfordrende som det innebærer en høy risiko for å bryte den øvre delen av mikropipette. Men levetiden for en vellykket lastet mikropipette er flere måneder, selv med daglig bruk.
I praksis har vi ennå ikke møtt en blokkering i innsprøytningssystemet under post-opptak rengjøring av systemet. Likevel er ingen "online" check mulig, og det er en risiko for at en fysisk blokkering (for eksempel vev ved mikropipette spissen) kan hindre substans injeksjon. Det kan derfor være fordelaktig å analysere dataene konservativt, slik som blant annet bare de celler i ytterligere analyse som viser signifikante endringer i avfyringshastigheter mellom kontroll og injeksjons blokker av forsøket.
Til tross for sin lille diameter, vil mikroelektroder og pipetter fortrenge hjernevev og kan føre til at noen lokal vevsskade. Dette kan minimeres ved manuelt å plassere spissen av the lederør like over dura mater. Elektrodene deretter trenge gjennom dura og deres intactness utledes ved å måle deres impedanser online. Deretter blir det satt inn mikropipette. Ved bruk av denne tilnærmingen, er regelmessig fjerning av vev over dura anbefalt for ytterligere å redusere risikoen for elektrode eller pipette brekkasje.
Sammenligning med alternative metoder
Systemet som brukes her viser klare fordeler sammenlignet med andre trykkinnsprøytning. En sterk fordel er diameteren til mikropipette (ca. 100 um), som er halvparten av størrelsen på andre tilgjengelige sonder 17 og derfor minimaliserer nevrale vevsskade. I motsetning til tidligere design, syssels dagens system romlig separert opptak elektrode og mikropipette. Selv om andre systemer gir en mindre avstand mellom elektrode og pipette, det systemet som er beskrevet her tillater uavhengige dyptgående endringer av elektroder og pipette, og dermed Permitte opp variable relative avstander innenfor en innspilling. Viktigere, ingen kompromisser angående opptakskvalitet må gjøres, som innsprøytningssystemet er en forlengelse av et etablert opptaksenhet. Selv om bare en mikropipette, og således en substans er brukt i denne protokollen, er det mulig å injisere flere stoffer i en eksperimentell prosedyre. For å oppnå dette, kan flere mikropipetter være gjenget inn i separate føringsrørene og forbundet med sprøyter som er montert i individuelle injeksjonspumper. Til slutt kontrollerer systemet er enkelt, da bare ett datamaskinprogram som er nødvendig for å fremme elektrodene og mikropipette, og for å utføre trykkinjeksjons under forsøket.
Sammenligning trykk injeksjon til iontoforese, er det relative fordeler og ulemper. For eksempel krever press injeksjon større volumer som skal innføres i vevet enn iontoforese, og dermed øke risikoen for neuronal forskyvning. Den nåværende protocol brukt volumer i NL-serien, og vi opplevde sjelden merkbare endringer i et registrert cellens signalkvalitet. Systemet tillater også større mengder som skal injiseres, noe som er potensielt nyttig for atferdsmessige manipuleringer, men kan påvirke stabiliteten av neuronal opptak. En klar fordel med press injeksjon iontoforese er større utvalg av brukbare stoffer som det ikke er krav om å bruke ladede stoffer. Imidlertid bør pH-verdien kontrolleres og sammenlignes mellom forsøks- og kontroll-midler (f.eks., Saltvann).
Spørsmålet kan oppstå hvorfor bruke veletablert metode for press injeksjon i stedet for nyere teknikker som optogenetics for å manipulere nevrale aktiviteten. Selv godt etablert i gnagere, optogenetics er ennå ikke sikkert etablert i rhesusaper. Spesielt er det ikke ennå tillater lokalt manipulering av celler som er selektive for en spesiell nevrotransmitter type. På lengre sikt ser vistore muligheter for kombinasjon av fordelene med farmakologiske manipulasjoner med fordelene ved optogentic manipulasjoner i belyse det nevrale basis av kognitive funksjoner.
Her har vi vist hvordan press injeksjon kan brukes for å manipulere farmakologisk et lokalt begrenset område i hjernen hos våkne, oppfører rhesusaper. Vi håper at denne metoden inspirerer andre forskere å undersøke neuromodulatory bidrag til dynamikken i neuronal aktivitet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft gjennom Collaborative Research Center 889 "Cellular Mekanismer av Sensory Processing" til ST (Prosjekt C04). Vi takker Sina Plumer, Leonore Burchardt, Dirk Prusse, Klaus Heisig og Ralf Brockhausen for teknisk og dyrerelaterte støtte og våre samarbeidspartnere i stamcelle Enhet for den tyske Primate Center, Dr. Katharina Debowski og Anna Magerhans, for teknisk bistand i filtrering prosessen.
(-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
Deionized water | |||
Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |