Summary
הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.
Introduction
רקמות חניכיימיים המקיפות את האדם השיניים בעכברים ונחשפות כל זמן אל ביופילם המורכב של שן 1. רשת תא חיסון שיטור מכשול החניכיים היא חיונית לשמירה על שלמות רקמות, הבטחת הומאוסטזיס עם חיידקי commensal מקומיים, בעת ובעונה אחת, מתן חסינות יעיל נגד אתגר פתוגניים 2. כדי להשיג הומאוסטזיס, מערכת החיסונית מותאם בקפידה לסביבת חניכיימיים יצירת רשת תא חיסון בעלי התמחות גבוהה, עדיין קצת בפירוט ידוע של אוכלוסיות תאי חיסון חניכיימיים ותפקידם בשמירת רקמה חסינה 2.
כאשר הומאוסטזיס חיסוני מופר על החניכיים, בין אם באמצעות רגישות מארחת מוגברת ו / או נוכחות של קהילות מיקרוביאלי dysbiotic, מצב דלקתי, חניכיימיים עולות 3 4. חניכיים היא מחלה דלקתית נפוצה, שמוביל לאובדן השן sמבני upporting. במקרים חמורים שלה הוא נתפס בתוך כ -10% מכלל אוכלוסיית 5. הביתור הגורמים המרכזיים המעורבים הרגישות חניכיים והתקדמות הוכיחה קשה 6. עם זאת, במודלים של בעלי החיים היו מאוד שימושיים בהבנת מנגנוני חניכת חניכיימיים והתקדמות 7. מודלים יכולים להיות מועסקים על מנת להגדיר את אוכלוסיות תאי מפתח ומתווכים מולקולריים כי הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס חיסון ופיתוח כונן של מיסב שן. תובנה כזו תהפוך הבנתנו שליטת חניכיימיים הספציפיות של הומאוסטזיס חיסונית לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של בהיווצרות מחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה בעקבות הנחיות נדרשות ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי, NIDCR / NIH.
1. להכין מראש
- הכן התקשורת השלם: RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו FBS 10%.
- כן תקשורת DNase: 50 מיליליטר של תקשורת RPMI השלים עם 7.5 מיקרוגרם DNase (הפוך טרי, לשמור על הקרח בכל עת).
- הכן התקשורת Collagenase-DNase: 5 מ"ל של התקשורת DNase בתוספת 3.2 מ"ג / מ"ל של IV סוג Collagenase (הפוך טריים, לשמור על הקרח בכל עת).
- טרום מגניב חיץ FACS: 0.5% FBS מדולל PBS.
- צנטריפוגות טרום מגניב עד 4 מעלות צלזיוס.
- חממה שייקר חם 37 ° C.
בידוד 2., Dissection, ובידוד התא מפני חניכיים בלוקים
- להרדים עכברים על ידי חשיפה אותם ל- CO 2 בתא מתאים, על פי הנחיות AraC. <li> פתח את חלל בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואיברים פנימיים. כדי perfuse, עושים חתך את הווריד הנבוב נחות perfuse 3 מ"ל של PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G.
- לשתק את הגוף ואת הראש של עכבר על הכרית עם בטן כלפי מעלה.
- חותכים כל שליבה של השפה לכיוון הצוואר במספריים, הפרדת העור שמכסה באזור הלסת התחתונה והצוואר, חשיפת רקמות השרירים הבסיסית. לנתח את השפה התחתונה לחשוף את הלסת התחתונה.
- חותך בין החותכות התחתונות להפריד משני צידי הלסת התחתונה ואת לשתק כל צד לגשת חלל הפה.
- דמיינו לנתח את החיך משם מחלל האף.
- לנתח אזורים באמצעות 10 להב וכוללים אזורי טוחנת בלסת העליונה mandibular עם הסובבים החניכיים (איור 1). ודא חתכים אנכיים רק קדמי טוחן ואת האחורי הראשונים הטוחן השלישי חתך אופקיהגבול של החניכיים (הצווארון הלבן של השיניים לרקמות).
- מניחים את לסתי וחוסם mandibular צינור חרוטי 50 מ"ל עם 5 מ"ל Collagenase / DNase (לשמור על הקרח).
- דגירה באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ובמהלך הדגירה 5 דקות של האחרון להוסיף 50 μl של 0.5 מ 'EDTA.
- הוסף 5 מ"ל של התקשורת DNase קר אל הצינור 50 מ"ל עם רקמות בעדינות מערבולת לערבב.
- מעבירים את 4 בלוקים של רקמות על צלחת פטרי ולכסות עם 500 μl של התקשורת DNase. סר חניכיימיים מכל גוש הרקמות, באמצעות סכין אזמל ומכוון את הלהב לתוך אזורי החניכיים ו-שיניים.
- מעבירים את הרקמות ואת התקשורת מצלחת פטרי כמו גם בתקשורת DNase שהופעלה במהלך לנתיחה, לצינור חדש 50 מ"ל דרך מסננת התא (70 מיקרומטר גודל). לשטוף עם התקשורת DNase (3-5 מ"ל) כל המכשירים המשמשים ולסנן.
- באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר סטרילי, ומועך את הרקמה נגד המסננת,סינון עם התקשורת DNase קר (30 עד 35 מ"ל).
- שטוף את מסננת התא עם תקשורת DNase קרה.
- צנטריפוגה ב 4 ° C, 314 XG במשך 6 דקות.
- בטל supernatant, מחדש להשעות ב 1 מ"ל של מדיה מלאה.
- ספירת תאים (סכום הצפוי צריך לנוע בין 8 x 10 5 כדי 1.2 x 10 6 תאים עם כדאיות של> 80%) באמצעות דלפק תא אוטומטי.
3. גירוי ו FACS צביעת תאים חניכיים
- לעורר את ההשעיה תא בודד עם PMA (50 ng / ml) ו ionomycin (2.5 מיקרוגרם / מ"ל) בנוכחות של 1 μl / מ"ל של Brefeldin א
- דגירה של 3.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- ספין למטה לשטוף עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס; 314 XG במשך 6 דקות.
- כתם תאים באמצעות כתם כדאי בעקבות ההוראות יצרן.
- כתם על סמנים תאיים (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ או נמלהibodies בחירה) בעקבות הוראות יצרן.
- שוטפים את התאים עם חיץ צנטריפוגות קר FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
- בעדינות מערבולת לשבש את התא גלולה.
- תקן את התאים עם paraformaldehyde 2% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- שוטפים את התאים עם חיץ FACS קר, צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות ו כתם ציטוקינים תאיים.
- ממלאים את צינורות FACS עם תמיסה של saponin 0.5% קר מדולל חיץ צנטריפוגות FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
- הוספת 300 μl של פתרון saponin 0.5% אל צינורות FACS, דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
- כתם תאים עבור סמנים תאיים (IL-17A ו IFNγ או ציטוקינים בחירה) בעקבות הוראות יצרן. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות saponin 0.5% ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
- שטפו שוב עם FACSחיץ צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות.
- מחדש להשעות את התאים 300 μl של חיץ FACS.
- נתחו את התוצאות על cytometer הזרימה.
4. ניתוח cytometry זרימה
- דמיינו תאים להיות מנותח על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SCC) ושער להוציא פסולת.
- בחר תאים בודדים עם שטח פיזור קדימה (FSC-A) לעומת פרמטרים גובים (FSC-H).
- שער תאים כי הם חיים (כפי שצוין על ידי מכתים כדאי) וחיוביים עבור + CD45 סמן hematopoietic לניתוח נוסף (איור 2 א ו 2 ג).
- המשך ניתוח של סמנים ספציפיים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להמחיש יישום של פרוטוקול, אנו מציגים תוצאות נציג לבחינת הרשת התא החיסונית החניכיים של עכברים עם ובלי חניכיים (WT לעומת LFA - / -, איור 2 א - ג). מגרשי FACS נציג להראות תאי CD45 + hematopoietic חי החניכיים (איור 2 א, 2 ג). בידוד ועיבוד של תאי מערכת החיסון עם פרוטוקול זה מניב מספיק תאים כדי לבצע vivo לשעבר גירוי ואפיון דפוסי הפרשת ציטוקינים. כאן אנו מראים IL-17 ו מכתים IFN-γ בתאים הכולל CD45 + במדינה יציבה (WT) ובעכברים מפגין חניכיים (עקב מחסור LFA) (איור 2 ב - D). נתונים אלו חושפים את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי ללכוד פרופילים ציטוקינים במהלך מצב יציב רקמות (WT) והן בהקשר של פריודונטיטיס המקומי (LFA - / -). מיקרופוןהדואר רגיש חניכיימיים נוסיף שאפיין את רכב תא חיסון החניכיים במיוחד של תאי T ותא הלימפה מולדת (ILC) תאים (איור 3 א - ב). הצלחנו להגדיר את הייצור של IL-17 ו- IFN-γ בתוך תא TCRβ + CD4 + T, תאי TCRβ + CD8 + T, תאי TCRγδ + T, NK ותאי ILC (איור 3 ג).
איור 1:. בידוד של החניכיים murine איור הממחיש את הדיירים של דיסקציה של maxilla ומגזר חניכיים מבודד לשמש לנתיחה רקמת החניכיים. מגזרי (B) של maxilla בעכברים (באזור הטוחן) עם מתווה לנתיחה לחסום ולחסום מבודדים. Hematoxylin ו כתם Eosin (H & E) של קטע טוחנת לסתי עם החניכיים רקמות l התוו מוצג הנמוך (C) גדלה גבוהה (ד '). בהגדלה מקורית מצוינת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נציג נתונים FACS עבור ייצור ציטוקינים מתאי חניכיים. (A - C) FACS עלילה מראה שער תאי CD45 + חיו בהכנות תא עכבר חניכיימיים הבאות vivo לשעבר מחדש גירוי עם PMA ו ionomycin ב WT ו LFA - / -. (B - D) מגרשים נציג FACS מראה IFN-γ ו- IL-17 מכתים עכבר הכולל CD45 + תאים החניכיים של עכברים עם / בלי חניכיים (בשל LFA-חסר).Iles / ftp_upload / 53,736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. ייצור ציטוקינים על ידי אוכלוסיות חיסוניות חניכיימיים מודלקות (א) עלילת הנציג FACS מציג מכתים עבור TCRβ לעומת TCRγδ מגודר על תאי CD45 +. Gating על TCRβ + תאים, העלילה באמצע תערוכות CD4 לעומת מכתים TCRβ (מאפשר ניתוח של תאים TCRβ + CD4 + T, תאים TCRβ + CD8 + T ו TCRγδ + T תאים). Gating על TCRβ - TCRγδ - תאים, העלילה ימין מראה CD45 לעומת מכתים NK1.1 (מאפשר ניתוח של תאי NK). (ב) עלילת הנציג FACS מציג מכתים עבור CD90.2 מגודרת על תאים שליליים CD45 + שושלת (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) אשר מזהה תאים הלימפה מולד. (ג) מגרשים נציג FACS מראה IFN-γ ו- IL-17 מכתים אוכלוסיות תאים המזוהים. ההכנות החניכיים הם בין 20 בן שבוע LFA - / - עכברים המתפתחים חניכיים; נתונים מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה הנוכחית בהצלחה מניבה מספר רב של תאי מערכת חיסון (מתוך עכבר אחת) מתאים, לא רק לאפיון פנוטיפי, אלא גם עבור מחקרים פונקציונליים vivo לשעבר. קבוצה נוספת פרסמה בעבר פרוטוקול לבודד ולאפיין תאים בעכברי חניכיימיים חיסוניים והציגה את שווי השימוש ססגוני cytometry זרימה בחקר חניכיימיים במודלים של בעלי חי 9. בעקבות תקלות ניכר שינוי המפתח בפרוטוקול זה היה לכלול דיסקציה של בלוקים שלמים של רקמות על מנת לכלול בשני התחומים צווארון חניכיים ו החניכיים interdental (איור 1). עם דיסקציה חניכיים לבד, לעתים קרובות דשי בעובי מלא אינן מושגות וחלק החניכיים הוא החמיץ במיוחד בתחומים interdental. בגישה זו, מספר רב של תאי חיסון שנקטף עולים במידה הניכרת. טכניקה זו מאפשרת גם לבידוד מיטבי של רקמות החניכיים הן מתוך maxillaלסת תחתונה ד.
צעדים קריטיים עבור פרוטוקול זה כוללים דיסקציה שמרנית תחומים חניכיים ושיעור יעיל של לנתיחה. באופן ספציפי, בלוקים של רקמה צריך להיות גזורים לכלול רקמות מינימאליות רק סביב שיניים (חניכיימיים) ורקמות buccal לא. בלוקים צריכים להיות גזורים במהירות רקמות ותאים צריכות להישאר על קרח כדי להבטיח כדאיויות תא אופטימליות.
לצורך פתרון בעיות חשוב לציין כי התשואה הנמוכה של תאים יכול להיות קשור זמן לקוי של הדגירה עם collagenase, ריכוזי הולם של collagenase ו / או דיסקציה לקוי של החניכיים מהבלוקים רקמות. ובנימה זו, דיסקציה של כירורגיים מגדלת באמצעות חניכיימיים (2X-6X) יכולה להיות מועילה. כדאיות נמוכה של תא יכולה להיות קשור איחור בהליך וכדי תקשורת, מאגרים ותאיים לא הנותרים ברציפות על קרח.
מגבלות של פרוטוקול זה, הטמון לסוג דיס רקמותsected הוא בגודל של רקמות חניכיימיים, בהשוואה לאתרים מחסום אנטומיים אחרים שנבדקה (לשעבר. עור או מערכת עיכול) שבו רקמות גדולות זמינות.
עם זאת, טכניקה מוצגת כאן אפשר לנו לאפיין את אוכלוסיות תאים הדומיננטיים LFA - / - מודל אשר ספונטני שפותח חניכיימיים. ב LFA - / - עכברים זיהו חתימה ציטוקינים דומיננטית IL-17 במהלך פיתוח של פריודונטיטיס 10. באמצעות ניתוח תזרים cytometric הססגוני הצלחנו להגדיר את המקורות הסלולר של IL-17 11. במחלה זו הגדרת IL-17 הופק על ידי תאי T TCRγδ, תאי CD4 + T ותאי הלימפה מולד (ILC) מקומי בתוך החניכיים 10.
עם מספר לא מבוטל של תאים מבודדים עם מתודולוגיה זו ואת היכולת לזהות אפילו תת-אוכלוסיות קטנות, זה עכשיו יהיה אפשרי לפתח מקיפה להביןing של רשת תא חיסון המיוחדת לשמירה שלמות מחסום חניכיימיים. ההבחנה חשובה הזאת תאפשר לנו להעריך תגובה חיסונית בסביבת החניכיים. על ידי העסקה בשיטה זו אנו מסוגלים כעת להמשיך לבודד מרכיבים ספציפיים של רשת תא החניכיים חיסוניות על ידי מיון תא התזרים cytometric, המאפשר ניתוחים נוספים ומאפיינים להתבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
