Summary
Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.
Introduction
Тканях десны окружают человека и мыши зубной и постоянно подвергаются комплексной биопленки зуба 1. Сеть иммунной клетки полицейской десневого барьер жизненно важно для поддержания целостности тканей, обеспечивая гомеостаз с местными микробами синантропных и, в то же время, обеспечивая эффективный иммунитет против патогенного вызов 2. Для достижения гомеостаза, иммунная система тщательно адаптировать к десневой среды, создающей высоко специализированной сети иммунных клеток, пока известно мало подробностей известно о десневых популяциях клеток иммунной системы и их роль в поддержании тканей иммунитет 2.
Когда иммунного гомеостаза нарушается на десны, либо через повышенной восприимчивости хозяина и / или в присутствии дисбиотических микробных сообществ, воспалительного состояния, периодонтит возникает 3 4. Пародонтит является распространенным воспалительным заболеванием, что приводит к потере зуба сupporting структуры. В своих тяжелых формах она наблюдается примерно 10% от общей численности населения 5. Анатомический ключевые факторы, влияющие на периодонтита восприимчивости и прогрессирования оказалось трудным 6. Тем не менее, модели на животных были чрезвычайно полезны в понимании механизмов инициации пародонтита и прогрессирования 7. Модели могут быть использованы для определения ключевых клеточных популяций и молекулярные медиаторы, которые имеют жизненно важное значение для поддержания иммунного гомеостаза и развитие привода пародонтоза. Такое понимание превратит наше понимание десны конкретных контроля иммунного гомеостаза и углубить наше нынешнее понимание патогенеза заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные в данном протоколе последующим необходимые принципы и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета, NIDCR / NIH.
1. Подготовьте заранее
- Подготовьте полной среде: RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 10% FBS.
- Подготовьте ДНКазную СМИ: 50 мл RPMI среде с 7,5 мкг ДНКазы (Make свежий, держать на льду во все времена).
- Подготовьте коллагеназы-ДНКазы носитель: 5 мл ДНКазы сред плюс 3,2 мг / мл коллагеназы типа IV (Make свежей, держать на льду во все времена).
- Предварительно круто FACS буфера: 0,5% FBS разводили в PBS.
- Предварительно круто центрифуги до 4 ° С.
- Теплый шейкер-инкубатор до 37 ° С.
2. Изоляция, Вскрытие и Выделение клеток из десневого блоков
- Эвтаназии мышей, подвергая их CO 2 в соответствующем камере, в соответствии с директивами ARAC. <LI> Открыть грудной и брюшной полости, чтобы разоблачить сердце и внутренние органы. Чтобы заливать, сделать разрез в нижней полой вене и заливать 3 мл PBS через левый желудочек с помощью 3 мл шприц с иглой 27 G.
- Остановите тело и голову мыши на слой с желудком вверх.
- Разрежьте каждый спайки губ к шее с помощью ножниц, отделяя кожу, которая покрывает нижней челюсти и шеи область, обнажая лежащие ткани и мышцы. Рассеките нижнюю губу, чтобы раскрыть нижнюю челюсть.
- Вырезать между нижними резцами, чтобы отделить обе части нижней челюсти и иммобилизации каждую сторону для доступа к полости рта.
- Визуализация и рассекают небо от носовой полости.
- Рассеките области с использованием 10 лезвие и включают верхней и нижней челюсти молярных областей с окружающими десны (рисунок 1). Сделать вертикальные надрезы только кпереди от первого моляра и кзади от третьего моляра и горизонтальной разрез награница десны (белый воротничок тканей, окружающих зубы).
- Поместите верхней и нижней челюсти блоков в 50 мл коническую трубку с 5 мл коллагеназы / ДНКазы (держать на льду).
- Инкубируйте в шейкере инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч и в течение последних 5-минутной инкубации добавляют 50 мкл 0,5 М ЭДТА.
- Добавьте 5 мл холодной ДНКазы СМИ к 50 мл пробирку с тканями и нежно вихревой перемешать.
- Передача 4 блока ткани на чашке Петри и накрыть 500 мкл ДНКазы СМИ. Удалить десны от каждого блока ткани, используя лезвие скальпеля и указывая лезвие в десневых и межзубных областях.
- Передача ткани и носитель из чашки Петри, а также предыдущих медиа ДНКазы используемых во время вскрытия, в новом 50 мл трубки через клеточный фильтр (размер 70 мкм). Промыть ДНКазы СМИ (3-5 мл) на всех инструментах, используемых и фильтра.
- Используя поршень из стерильной 3 мл шприц, пюре ткани против сито,фильтрации с холодным ДНКазы сред (от 30 до 35 мл).
- Промыть фильтр клеток с холодной ДНКазы СМИ.
- Центрифуга при 4 ° С, 314 мкг в течение 6 мин.
- Жидкость над осадком сливают, вновь приостановить в 1 мл полной среды.
- Граф клеток (ожидаемая сумма должна быть в пределах от 8 до 10 х 5 до 1,2 х 10 6 клеток с жизнеспособностью> 80%) с использованием автоматизированного счетчика клеток.
3. Стимулирование и FACS окрашивания десны клеток
- Стимулируют одноклеточной суспензии с РМА (50 нг / мл) и Ionomycin (2,5 мкг / мл) в присутствии 1 мкл / мл брефелдин А.
- Инкубируйте в течение 3,5 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
- Спин вниз и промыть PBS и центрифуге при 4 ° С; 314 мкг в течение 6 мин.
- Пятно клеток с использованием жизнеспособность пятно следующей инструкции производителя.
- Пятно внеклеточного маркеров (CD45, TCRγδ, TCR & beta;, CD4, CD8, TCRγδ или муравьевibodies выбора) в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Вымойте клеток с холодным буфером FACS и центрифуге при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
- Аккуратно вихрь, чтобы разрушить осадок клеток.
- Устранить клетки с 2% параформальдегидом в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Вымойте клеток с холодным буфером FACS, центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин и пятно на внутриклеточных цитокинов.
- Заполните трубы FACS с раствором холодной 0,5% сапонина, разведенного в FACS буфере и центрифугируют при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
- Добавить 300 мкл 0,5% раствора сапонина к трубкам FACS, инкубировать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С и затем центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
- Пятно клетки для внутриклеточных маркеров (IL-17A и IFN & gamma или цитокинов выбора), следуя инструкциям изготовителя. Вымойте клеток с 0,5% раствором сапонина и центрифуге при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
- снова промыть водой с FACSбуфер и центрифуги при 4 ° С, 314 мкг в течение 5 мин.
- Повторное приостановить клеток в 300 мкл буфера FACS.
- Анализ результатов по цитометра потока.
4. проточной цитометрии анализ
- Визуализация клеток для анализа на вперед (FSC) и боковое рассеивание (SCC) и ворот, чтобы исключить мусор.
- Выберите отдельные клетки с площадью рассеяния вперед (FSC-A) против высоты параметров (FSC-H).
- Клетки Gate, которые живут (как обозначено на жизнеспособность окрашиванием), и положительным для кроветворной маркер CD45 + для дальнейшего анализа (фиг.2А и 2С).
- Продолжить анализ специфических маркеров, как показано на рисунках 2 и 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать применение протокола, мы показываем репрезентативные результаты Рассматривая сеть иммунных клеток в десне мышей с и без периодонтита (WT против LFA - / -, рис 2a - C). Представительные FACS графики показывают живые CD45 + гемопоэтических клеток в десны (рис 2А, 2С). Выделение и обработка иммунных клеток по этому протоколу дает достаточное количество клеток для выполнения экс виво стимуляцию и характеристику паттернов секреции цитокинов. Здесь мы покажем IL-17 и IFN-gamma окрашивание в общем CD45 + клеток в стационарном состоянии (WT) и мышей выставляется периодонтит (из-за дефицита LFA) (фиг.2В - D). Эти данные показывают, потенциал этой техники для захвата профили цитокинов во тканей устойчивом состоянии (WT) и в контексте местной пародонтита (МАФ - / -). В микрофоне восприимчивы к периодонтита мы дополнительно характеризуется десневого состав иммунных клеток особенно в Т-клетке и Врожденное Лимфоидная клеток (КМП) отсеков (фиг.3А - B). Мы смогли определить выработку IL-17 и IFN-gamma внутри клетки TCR & beta; + CD4 + Т-, TCR & beta; + CD8 + Т-клеток, TCRγδ + Т-клеток, NK и ILC отсеки (рис 3C).
Рисунок 1:. Выделение мышиной десны Иллюстрация демонстрируя границах диссекции в верхней и изолированной сегмента десневого которые будут использоваться для рассечения тканей десны. (B) Сегмент мышиный челюстно (области моляров) с контуром для блока вскрытия и изолированной блок. Гематоксилином и эозином пятно (H & E) из верхнечелюстной молярной сегменте с десной л ткани, описанные показано на низком уровне (C) и более высокое увеличение в (D). Оригинальные увеличениях указанные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2: Типичные FACS данные для продукции цитокинов из десневых клеток. (А - С) FACS график, показывающий ворота для живых CD45 + клеток в препаратах мыши десневых клеток следующих экс естественных повторного стимулирования с PMA и Ionomycin в WT и LFA - / -. (B - D) Представитель FACS участков, показывающие IFN- и IL-17 окрашивание в общей CD45 + клеток мыши из десны мышей с / без периодонтита (за счет LFA-дефицитом).Иль / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3:. Продукция цитокинов иммунными населения в воспаленной десны (А) представитель FACS график, показывающий окрашивание для TCR & beta; по сравнению с TCRγδ закрытого на CD45 + клеток. Стробирования на TCR & beta; + клеток, средний график показывает CD4 против TCR & beta; окрашивания (позволяет анализировать TCR & beta; + CD4 + Т-клеток, TCR & beta; + CD8 + Т-клеток и TCRγδ + Т-клеток). Память на TCR & beta; - TCRγδ - клеток, правый график показывает CD45 против NK1.1 окрашивания (позволяет для анализа клеток NK). (B) представитель FACS график, показывающий окрашивание для CD90.2 закрытого на CD45 + клона негативных клеток (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCR & beta; -), который идентифицирует врожденные лимфоидных клеток. (C) Представительные FACS участки, показывающие IFN- и IL-17 окрашивание в клеточных популяций, выявленных. Десневые препараты из 20 недельных LFA - / - мышей, которые развиваются периодонтит; Данные представляют три независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тока методика успешно дает большое количество иммунных клеток (от одной мыши) подходит не только для фенотипического описания, но также и для функциональных исследований экс виво. Другая группа ранее опубликованные протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать иммунные клетки мышиной десневые и введены ценность использования многоцветной проточной цитометрии при изучении периодонтита в животных моделях 9. После обширных Устранение неполадок ключевую модификацию в этом протоколе было включать рассечение целых блоков ткани, чтобы включить обе десны области воротник и межзубные десны (рисунок 1). С одной только десневого диссекции, часто на полную толщину створки не будут достигнуты и часть десны пропустили особенно в межзубных областей. Используя этот подход, количество иммунных клеток, полученных значительно увеличены. Эта техника также позволяет оптимально изоляции тканей десны как из верхней челюсти апd челюсть.
Критические шаги для этого протокола включают консервативную рассечение десны районах и эффективную скорость рассечения. В частности, блоки ткани должны быть расчленены, чтобы включить только минимальное ткани вокруг зубов (десны) и не щечные тканей. Блоки должны быть расчленены быстро и тканей и клеток должны оставаться на льду, чтобы обеспечить оптимальную жизнеспособность клеток.
Для целей поиска неисправностей важно отметить, что низкий выход клеток может быть связано с неадекватным времени инкубации с коллагеназой, неуместных концентраций коллагеназы и / или недостаточной рассечения десны от тканевых блоков. На этой ноте, рассечение десны с помощью увеличительных луп (2X-6X) может быть полезным. Низкий жизнеспособность клеток может быть связано с запаздывание в процедуре и с медиа, буферы и клеток, не оставшихся непрерывно на льду.
Ограничения этого протокола, присущие типу дис тканейпересекаемое является размер десневых тканей, по сравнению с другими анатомические барьерных исследованных участках (Исх. кожных или желудочно-кишечного тракта), в которой крупные ткани доступны.
Тем не менее, метод, представленный здесь позволило нам охарактеризовать популяции доминирующих клеток в LFA - / - модель, которая спонтанно разработаны периодонтит. В LFA - / - мышей мы определили доминирующую IL-17 цитокинов подпись при развитии пародонтита 10. Использование многоцветного анализа методом проточной цитометрии, мы смогли определить клеточные источники IL-17 11. При этом заболевании заходящего IL-17 был произведен TCRγδ Т-клеток, CD4 + Т-клеток и врожденных лимфоидных клеток (КМП) локально в пределах десны 10.
С значительного числа клеток, выделенных с этой методологией и способность выявлять даже небольшие субпопуляции, теперь можно будет разработать всеобъемлющий понятьING специализированного иммунной ячейки сети, гарантирующей десневой целостности барьера. Эта критическая понимание позволит нам оценить иммунный ответ в десневой среды. Используя эту технику мы можем теперь приступить к выделить конкретные составляющие десны сети иммунных клеток путем сортировки проточной цитометрии клеток, позволяя дополнительные анализы и характеристики должны быть предприняты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
