Summary
We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.
Introduction
Gingivale weefsel rondom de menselijke en murine gebit en worden voortdurend blootgesteld aan het complex biofilm van de tand 1. De immuuncel netwerk toezicht op de gingivale barrière is essentieel voor het handhaven weefselintegriteit, waardoor homeostase met de lokale commensale microben en, tegelijkertijd, doeltreffende immuniteit tegen pathogene challenge 2. Om homeostase, wordt het immuunsysteem nauwkeurig afgestemd op de gingivale milieu waardoor een sterk gespecialiseerde immuuncel netwerk, maar weinig detail bekend van de gingivale immuuncelpopulaties en hun rol bij het handhaven weefsel immuniteit 2.
Wanneer immuun homeostase wordt verstoord op het tandvlees, hetzij door middel van verhoogde vatbaarheid gastheer en / of de aanwezigheid van dysbiotic microbiële gemeenschappen, een inflammatoire aandoening, parodontitis ontstaat 3 4. Parodontitis een gemeenschappelijke ontstekingsziekte, wat leidt tot verlies van tanden supporting structuren. In haar ernstige vormen het wordt gezien in ongeveer 10% van de bevolking 5. Ontrafeling van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij parodontitis gevoeligheid en de progressie is moeilijk gebleken 6. Echter diermodellen uiterst nuttig bij het begrijpen van de mechanismen van parodontitis initiatie en progressie 7 geweest. Modellen kunnen worden gebruikt om de sleutel celpopulaties en moleculaire mediatoren die essentieel voor immuun homeostase en aandrijving ontwikkeling van parodontitis zijn gedefinieerd. Dergelijke inzichten zal ons begrip van gingiva-specifieke controle van het immuunsysteem homeostase transformeren en verder ons huidige begrip van de ziekte pathogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven experimentele gevolgde procedures vereiste richtlijnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite, NIDCR / NIH.
1. Bereid in Advance
- Bereid compleet medium: RPMI aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 10% FBS.
- Bereid DNase media: 50 ml RPMI medium aangevuld met 7,5 ug DNase (Voeg verse, houdt op ijs te allen tijde).
- Bereid Collagenase-DNase media: 5 ml DNase media plus 3,2 mg / ml van Collagenase Type IV (Voeg verse, houdt op ijs te allen tijde).
- Pre-cool FACS buffer: 0,5% FBS verdund in PBS.
- Pre-cool centrifuge tot 4 ° C.
- Warm shaker incubator op 37 ° C.
2. Isolatie, Dissection en Cell Isolatie van Gingival Blocks
- Euthanaseren muizen door ze bloot te stellen aan CO 2 in een geschikte kamer, volgens de richtlijnen ARAC. <li> Open de borst- en buikholte naar het hart en de inwendige organen bloot. Te perfuseren, een insnijding in de onderste vena cava en perfuseren 3 ml PBS via de linker ventrikel met een 3 ml spuit met een 27 G naald.
- Immobiliseren van het lichaam en het hoofd van de muis op een pad met de buik naar boven.
- Snij elke commissure van de lip in de richting van de hals met een schaar, het scheiden van de huid die betrekking heeft op de onderkaak en halsgebied, het blootstellen van de onderliggende weefsels en spieren. Ontleden de onderlip aan de onderkaak bloot te leggen.
- Snijd tussen de onderste snijtanden aan beide zijden van de onderkaak scheiden en immobiliseren weerszijden om de mondholte.
- Visualiseren en ontleden de mond weg van de neusholte.
- Ontleden gebieden met een mes 10 en omvatten bovenkaak en onderkaak molaire gebieden met omgeving gingiva (figuur 1). Voeg verticale incisies anterieure en posterieure molaire eerste naar de derde molair en een horizontale snede inde rand van het tandvlees (witte kraag van weefsel rondom de tanden).
- Plaats de bovenkaak en onderkaak blokken in een 50 ml conische buis met 5 ml Collagenase / DNase (te houden op het ijs).
- Incubeer in een shaker incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur en gedurende de laatste 5 minuten incubatie voeg 50 ul van 0,5 M EDTA.
- Voeg 5 ml koude DNase media om de 50 ml buis met weefsels en draai voorzichtig te mengen.
- Breng de 4 blokken van weefsel op een petrischaal en bedek met 500 ul van DNase media. Verwijderen gingiva uit elk blok van weefsel, met behulp van een scalpel en wijst het mes in de gingivale en interdentale ruimten.
- Breng de weefsels en de inhoud van de petrischaal en de vorige DNase media tijdens dissectie, een nieuwe 50 ml buis door de cel zeef (70 um grootte). Wassen met DNase media (3-5 ml), alle van de gebruikte instrumenten en filter.
- Met de plunjer van een steriele 3 ml spuit, mash het weefsel tegen de zeef,filtering met koude DNase media (30-35 ml).
- Was de cel zeef met koud DNase media.
- Centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 6 minuten.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml van complete media.
- Tellen cellen (het verwachte bedrag moet liggen tussen 8 x 10 5-1,2 x 10 6 cellen met een levensvatbaarheid van> 80%) met behulp van een geautomatiseerde cel teller.
3. Stimulatie en FACS kleuring van Gingival Cells
- Stimuleren van de enkele celsuspensie met PMA (50 ng / ml) en Ionomycine (2,5 ug / ml) in aanwezigheid van 1 ul / ml Brefeldine A.
- Incubeer gedurende 3,5 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Spin down en wassen met PBS en centrifugeer bij 4 ° C; 314 g gedurende 6 minuten.
- Vlekken op de cellen met een levensvatbaarheid kleuring de instructies van de fabrikant.
- Vlek voor extracellulaire merkers (CD45, TCRγδ, TcR, CD4, CD8, TCRγδ of mieribodies keuze) volgens de instructies van de fabrikant.
- Was de cellen met koude FACS buffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
- Voorzichtig vortex de celpellet verstoren.
- Fixeer de cellen met 2% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met koude FACS-buffer, centrifuge bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 minuten en kleuring voor intracellulaire cytokinen.
- Vul het FACS buizen met een oplossing van koude 0,5% saponine verdund in FACS buffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
- Voeg 300 ul van 0,5% saponine oplossing voor de FACS buizen, incubeer 15 min in het donker bij 4 ° C en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
- Vlekken op de cellen voor intracellulaire merkers (IL-17A en IFNy of cytokines keuze) volgens de instructies van de fabrikant. Was de cellen met 0,5% saponine-oplossing en centrifuge bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
- Was opnieuw met FACSbuffer en centrifugeer bij 4 ° C, 314 g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de cellen in 300 pl FACS-buffer.
- Analyseer resultaten op een flowcytometer.
4. Flowcytometrieanalyse
- Visualiseren cellen die moeten worden geanalyseerd op vooruit (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SCC) en de poort naar puin uit te sluiten.
- Selecteer enkele cellen met voorwaartse verstrooiing gebied (FSC-A) vs. hoogte (FSC-H) parameters.
- Poort levende cellen die (zoals aangeduid door levensvatbaarheid kleuring) en positief voor de marker CD45 + hematopoietische voor verdere analyse (Figuur 2A en 2C) zijn.
- Continue analyse van specifieke markers zoals getoond in figuur 2 en figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De toepassing van het protocol illustreren, tonen we representatieve resultaten onderzoeken de immuuncel netwerk in de gingiva van muizen met en zonder parodontitis (WT versus LFA - / - figuur 2A - C). Representatieve FACS plots tonen levende CD45 + hematopoietische cellen in de gingiva (Figuur 2A, 2C). Isolatie en verwerking van immuuncellen met dit protocol levert voldoende cellen ex vivo stimulatie en karakterisatie van cytokine secretie patronen voeren. Hier tonen wij IL-17 en IFN-γ kleuring in totaal CD45 + cellen in de stationaire toestand (WT) en in muizen vertonen parodontitis (door LFA deficiëntie) (Figuur 2B - D). Deze gegevens tonen het potentieel van deze techniek om cytokine profielen opneemt tijdens weefsel steady state (WT) en voor lokale parodontitis (LFA - / -). microfoone vatbaar voor parodontitis we verder gekenmerkt het tandvlees immuuncel samenstelling in het bijzonder van de T-cel en Innate lymfocyten (ILC) compartimenten (figuur 3A - B). We waren in staat om de productie van IL-17 en IFN-γ in de TcR + CD4 + T cel definiëren, TcR + CD8 + T-cellen, TCRγδ + T-cellen, NK en ILC compartimenten (Figuur 3C).
Figuur 1:. Isolatie van murine gingiva illustratie tonen de grenzen van dissectie in de bovenkaak en het geïsoleerde gingivale segment worden gebruikt gingivale weefsel dissectie. (B) Segment van muizen bovenkaak (molaire gebied) met een schets voor blok dissectie en geïsoleerde blok. Hematoxyline en eosine vlek (H & E) van een maxillaire kies segment met tandvlees l weefsels beschreven wordt in laag (C) en hogere vergroting in (D). Original vergrotingen aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve FACS gegevens voor cytokine productie uit gingivale cellen. (A - C) FACS grafiek die poort voor live-CD45 + cellen in de muis tandvlees celpreparaten volgende ex vivo re-stimulatie met PMA en ionomycine in WT en LFA - / -. (B - D) representatief FACS plots tonen IFN-γ en IL-17 kleuring in totaal CD45 + cellen muis van tandvlees van muizen met / zonder parodontitis (door LFA-deficiëntie).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Cytokine-productie door immune populatie in ontstoken tandvlees (A) Vertegenwoordiger FACS plot tonen kleuring voor TcR versus TCRγδ gated op CD45 + cellen. Gating op TcR + cellen, CD4 middelste grafiek toont versus TcR kleuring (maakt analyse van TcR + CD4 + T-cellen, TcR + CD8 + T-cellen en TCRγδ + T-cellen). Gating op TcR - TCRγδ - cellen, rechts plot geeft grafisch weer CD45 versus NK1.1 kleuring (zorgt voor de analyse van NK-cellen). (B) Representatieve FACS plot tonen kleuring voor CD90.2 gated op CD45 + lineage negatieve cellen (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TcR -), die identificeert aangeboren lymfoïde cellen. (C) Representatieve FACS plots tonen IFN-γ en IL-17 kleuring in celpopulaties geïdentificeerd. Tandvlees voorbereidingen zijn vanaf 20 weken oude LFA - / - muizen die parodontitis te ontwikkelen; gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige techniek succes een groot aantal immuuncellen (van één enkele muis) geschikt oplevert, niet alleen voor de fenotypische karakterisatie, maar ook voor functionele studies ex vivo. Een andere groep eerder gepubliceerd protocol voor het isoleren en karakteriseren van muizen gingivale immuuncellen en introduceerde de waarde van het gebruik multicolor flowcytometrie in de studie van parodontitis in diermodellen 9. Na aanzienlijke problemen de belangrijkste wijziging in dit protocol werd dissectie van hele blokken weefsel omvatten teneinde zowel gingivale kraag ruimtes interdentale gingiva (figuur 1) omvatten. Met gingivale ontleding alleen vaak volledige dikte kleppen niet worden bereikt en een deel van het tandvlees wordt gemist name in de interdentale gebieden. Met deze aanpak wordt aantallen van immune cellen geoogst aanzienlijk toegenomen. Deze techniek maakt ook optimale isolatie van tandvleesweefsels zowel een maxillad onderkaak.
Kritische stappen voor dit protocol zijn onder andere een conservatieve dissectie van tandvlees ruimtes en een efficiënte snelheid van de dissectie. Specifiek dient blokken weefsel worden ontleed slechts minimale weefsel rond tanden (gingiva) en niet buccale weefsels omvatten. Blocks moet snel worden ontleed en weefsels en cellen moeten op ijs te blijven om een optimale levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren.
Ten behoeve van het oplossen van problemen is het belangrijk te vermelden dat de lage opbrengst aan cellen kan worden als gevolg van ontoereikende incubatietijd met collagenase, ongepaste concentratie van collagenase en / of onvoldoende dissectie van het tandvlees van het weefsel blokken. Wat dat betreft, kan dissectie van tandvlees met behulp van vergrootglas loepen (2X-6X) nuttig zijn. Lage levensvatbaarheid van cellen kan worden gerelateerd aan traagheid van de procedure, media, buffers en cellen niet permanent blijven op ijs.
Beperkingen van dit protocol, die inherent zijn aan het type weefsel dissected is de grootte van de gingivale weefsel, vergeleken met andere anatomische barrière plaatsen bestudeerd (bijv. huid of maagdarmkanaal) waarin grotere weefsels beschikbaar.
Toch is de techniek hier gepresenteerde heeft ons toegelaten om de dominante celpopulaties karakteriseren in de LFA - / - model die spontaan ontwikkeld parodontitis. In LFA - / - muizen identificeerden we een dominante IL-17 cytokine handtekening tijdens de ontwikkeling van parodontitis 10. Gebruik meerkleuren flowcytometrische analyse konden we de cellulaire bron van IL-17 11 definiëren. Bij deze ziekte instelling IL-17 werd geproduceerd door TCRγδ T-cellen, CD4 + T-cellen en aangeboren lymfoïde cellen (ILC) lokaal in de gingiva 10.
Met het grote aantal cellen die met deze methode en de mogelijkheid om zelfs kleine subpopulaties te identificeren, wordt het nu mogelijk om een veelomvattende begrijpening van de gespecialiseerde immuuncel netwerk bescherming van het tandvlees barrière integriteit. Dit kritisch inzicht zal ons toelaten om immuunreacties in het tandvlees milieu te beoordelen. Door toepassing van deze techniek kunnen we nu over tot bepaalde onderdelen van de gingiva immuuncel netwerk isoleren door flowcytometrische cell sorting, waardoor aanvullende analyses en kenmerken uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
