Summary
我们已经建立了隔离，表型特征，并从小鼠牙龈免疫细胞的功能分析的技术。
Introduction
牙龈组织包围人和鼠牙列和经常暴露于齿1的复杂生物膜。免疫细胞网络监管龈屏障对于维持组织完整性，确保与本地共生微生物稳态和，在相同的时间，提供对致病性挑战2有效免疫至关重要。实现动态平衡，免疫系统被仔细针对牙龈环境中创建一个高度专业化的免疫细胞网络，但小细节是已知的齿龈免疫细胞群及其在维持组织免疫2的作用。
当免疫稳态是在齿龈打乱，无论是通过增加宿主易感性和/或dysbiotic微生物群落，炎性病症的存在，牙周炎产生3 4。牙周炎是一种常见的炎性疾病，导致牙齿的S损失95的支持结构。在它的严重的形式，可以看出在一般人群5的约10％。解剖参与牙周炎的易感性和进展的关键因素已被证明难以6。然而，动物模型已经在理解牙周炎起始和进展7的机制是非常有用的。模型可以被用来定义密钥的细胞群体和分子介质是用于维持免疫稳态和牙周炎的驱动发展至关重要。这样的洞察力将改变我们的免疫稳态的具体牙龈调控的了解，进一步我们目前的发病机制的认识。
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Protocol
在此协议中描述的所有实验程序遵循必要的指导方针和机构动物护理和使用委员会，NIDCR / NIH获得批准。
1.提前准备
- 制备完全培养基：RPMI补充了2mM L-谷氨酰胺，100单位/ ml青霉素，100微克/毫升链霉素和10％FBS。
- 准备DNA酶媒体50 10ml补充7.5微克DNA酶的RPMI媒体（做出新的，保持在冰上在任何时候）。
- 准备胶原酶DNA酶媒体：5毫升DNA酶培养基加上3.2毫克/毫升胶原酶IV型的（做出新的，保持在冰上在任何时候）。
- 预冷FACS缓冲液：0.5％FBS的PBS稀释。
- 预冷离心机到4℃。
- 温暖的摇床孵化到37℃。
2.分离，解剖和细胞分离，从牙龈块
- 通过将它们暴露到CO 2在一个适当的腔室安乐死的小鼠，根据ARAC准则。 <li>打开胸，腹腔暴露心脏和内脏。灌注，使下腔静脉的切口和使用3毫升注射器用27克针通过左心室灌注3mL的PBS中。
- 固定在主体和鼠标的头部与胃朝上的垫。
- 切唇每对合缝用剪刀在脖子上，分离覆盖下颌和颈部区域，露出下面的组织和肌肉皮肤。解剖下唇发现下颌骨。
- 更低的门牙之间切割以分离下颌骨的两侧并固定各边访问口腔。
- 可视化和解剖腭从鼻腔了。
- 解剖用10个刀片的地区，包括周围的牙龈（图1）和上颌下颌磨牙区。使垂直切口只是前第一磨牙和后部的第三磨牙和一个水平切口牙龈的边界（组织周围牙齿的白领）。
- 放置在用5ml胶原酶/ DNA酶（保持在冰上）50ml锥形管中的上颌和下颌的块。
- 孵育在摇床培养箱中于37℃进行1小时，最后5分钟温育的过程中添加50微升的0.5M EDTA中。
- 5毫升冷DNA酶媒体加入50毫升管用纸巾轻轻摇晃混匀。
- 传输上的培养皿的组织的4块，用500微升DNA酶介质覆盖。从组织的每个块取出牙龈，用手术刀片，指着叶片进入龈和牙间区。
- 从培养皿以及解剖过程中使用的前一脱氧核糖核酸酶媒体通过细胞过滤网（70微米大小）转移组织和媒体，到一个新的50ml管中。用DNase媒体（3-5毫升），所有使用的手段和过滤器的清洗。
- 使用无菌3毫升注射器推杆，捣烂组织对滤网，冷DNA酶介质（30至35毫升）过滤。
- 用冷水DNA酶媒体细胞过滤。
- 离心机在4℃，314×g离心6分钟。
- 弃去上清液，在1毫升完整的媒体重新挂起。
- 计数细胞用自动细胞计数器（预期量范围应细胞的> 80％生存力8 1.2 6之间×10 5〜×10）。
3.刺激和FACS牙龈细胞染色
- 刺激用PMA（50纳克/ ml）和离子霉素（2.5微克/毫升）的单细胞悬浮液中的1微升/毫升布雷菲德菌素A的存在
- 孵育在37℃下3.5小时和5％ 的 CO 2。
- 降速并在4℃下用PBS离心洗涤; 314×g离心6分钟。
- 染色使用按照制造商的说明书一活力染色的细胞。
- 染色的细胞外标记（CD45，TCRγδ，TCRβ，CD4，CD8，TCRγδ或蚂蚁按照制造商的指示选择ibodies）。
- 洗用冷FACS缓冲液，并离心将细胞在4℃，314×g离心5分钟。
- 轻轻涡旋破坏细胞沉淀。
- 固定，用2％多聚甲醛将细胞在室温下20分钟。
- 洗用冷FACS缓冲液，离心将细胞在4℃，314×g离心5分钟，染色细胞内细胞因子。
- 填用冷的0.5％皂素在FACS缓冲液和离心稀释的溶液中的FACS管在4℃，314×g离心5分钟。
- 添加300微升0.5％的皂苷溶液至FACS管，孵育在黑暗中15分钟，在4℃，然后在4℃，314×g离心5分钟离心。
- 染色为按照制造商的指示细胞内标记物（IL-17A和IFNγ或选择的细胞因子）的细胞。洗用0.5％皂角苷溶液和离心机的细胞在4℃，314×g离心5分钟。
- 用FACS洗一遍缓冲液和在4℃，314×g离心5分钟离心。
- 重新悬浮在300μl的FACS缓冲液中的细胞。
- 分析上的流式细胞仪的结果。
4.流式细胞仪分析
- 可视化的细胞上向前（FSC）和侧向散射（SCC）和栅极进行分析，以排除碎片。
- 选择单细胞前向散射面积（FSC-A）对高度（FSC-H）的参数。
- 栅极细胞是活的（由活力染色所示）和阳性供进一步分析（图2A 和 2C）造血标记物CD45 +。
- 如图2和图3继续特异性标记物的分析。
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Representative Results
为了说明该协议的应用，我们显示代表性结果检查在有和没有牙周炎小鼠齿龈免疫细胞网络（WT与LFA - / - ， 图2A - C）。代表性FACS图显示出在齿龈（图2A，2C）活的CD45 +造血细胞。免疫细胞与本协议的分离和加工产生足够的细胞进行体外刺激和细胞因子的分泌模式的表征。这里，我们表明，IL-17和IFN-γ染色的总CD45 +细胞在稳定状态（WT）和在小鼠中表现出牙周炎（由于LFA缺乏症）（图2B - D）。这些数据揭示了该技术的潜在期间组织稳态（WT）和在本地牙周炎的上下文中捕获的细胞因子谱（LFA - / - ）。在MICÈ易患牙周炎我们进一步的特征在于特别是T细胞和先天淋巴细胞（ILC）隔室（图3A - B）的齿龈免疫细胞组合物。我们能够以限定TCRβ+ CD4 + T细胞中产生IL-17和IFN-γ，TCRβ+ CD8 + T细胞，TCRγδ+ T细胞，NK细胞和ILC隔间（图3C）。
图1：鼠齿龈分离插图表明解剖上颌骨和分离的牙龈段的寄宿用于齿龈组织解剖。鼠颌骨（摩尔区）（B）段与轮廓块解剖和隔离块。 HE染色与牙龈一个上颌磨牙段（H＆E）概述在低（C）的示升组织和在（D）的较高放大倍数。表示的原来的放大倍率。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：用于从牙龈细胞因子产生代表的FACS数据 。 （A - C）FACS情节展示门活CD45 +细胞在小鼠牙龈细胞制剂以下体外再刺激与PMA和WT和LFA离子霉素- / - 。 （B - D）的代表性FACS图显示出IFN-γ和IL-17染色在从- / -小鼠的齿龈总CD45 +细胞鼠标无牙周炎（由于LFA-缺乏症）。尔斯/ ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：细胞因子的产生由在发炎齿龈免疫种群 （A）的代表性的FACS积表示染色TCRβ与TCRγδ上的CD45 +细胞门控。门控TCRβ+细胞 ，中间的图显示的CD4与TCRβ染色（允许TCRβ+ CD4 + T细胞，TCRβ+ CD8 + T细胞和 TCRγδ+ T细胞分析）。 TCRγδ - -对TCRβ门控单元，右图显示CD45与NK1.1染色（允许NK细胞分析）。 （B）中示出了用于CD90.2染色代表性的FACS情节门上的 CD45 +谱系阴性细胞（CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c的-细胞CD11b - Ly6G -的Ly6C - TCRγδ - TCRβ - ）标识先天淋巴样细胞。 （C）的代表性FACS图显示出在鉴定细胞群体的IFN-γ和IL-17染色。齿龈制剂20周龄LFA - / -小鼠中开发牙周炎;数据代表三个独立的实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
当前技术成功地产生合适的大量免疫细胞（从单个小鼠），不仅对表型特征，也用于功能研究离体 。另一组先前公布的协议，以分离和表征鼠牙龈免疫细胞和导入用多色牙周炎的动物模型9的研究流式细胞仪的值。经大量排除在本协议中的关键改变是包括组织的全块解剖，以包括牙龈领区和齿间牙龈（图1）。与单纯的牙龈切除，常全层皮瓣没有实现，而且牙龈的部分尤其是在齿间地区错过。使用这种方法，收获的免疫细胞的数目都显著增加。这种技术还允许两个从上颌骨的齿龈组织的最优隔离ð下颌骨。
此协议的关键步骤包括牙龈领域的保守解剖和解剖的有效速率。具体来说，应该解剖组织块，包括牙齿周围（牙龈）只有最小的组织，而不是颊组织。块应迅速解剖组织和细胞应保持在冰上，以确保最佳的细胞活力。
的故障排除的目的，需要注意的是细胞的低产可以与胶原酶，胶原酶和/或从组织块齿龈的清扫不足的不适当浓度孵育时间不足是重要的。关于这一点，使用放大镜牙龈放大镜（2X-6X）的夹层可以帮助。细胞的低存活率可以与在程序中和介质，缓冲液和未在冰上持续剩余的细胞，以迟到。
该协议的局限性，固有的组织解散的类型剪刀剪下是牙龈组织的大小，相对于其他解剖阻挡部位研究的（例如，皮肤或消化道），其中较大的组织是可用的。
尽管如此，这里提出的技术已经使我们表征占主导地位的细胞群中LFA - / -自发研制牙周炎模型。在LFA - / -小鼠 ，我们牙周炎10的发展过程中确定的主导IL-17细胞因子的签名。使用多色流式细胞术分析，我们能够限定的IL-17 11的细胞来源。在这种疾病中设置的IL-17是由TCRγδT细胞，CD4 + T细胞和先天淋巴样细胞（ILC）局部齿龈10内产生的。
用这种方法，并确定连小亚群的能力分离细胞的大量，现在将有可能制定一个全面的了解ING专业的免疫细胞网络维护牙龈屏障的完整性。这个关键的洞察力将使我们能够评估牙龈环境免疫反应。通过采用这项技术，我们现在可以继续通过流式细胞仪的细胞分选来分离齿龈免疫细胞网络的具体成分，允许将要进行更多的分析和表征。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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