Summary
Wir haben ein Verfahren zur Isolierung, phänotypische Charakterisierung und funktionelle Analyse von Immunzellen aus murinen Gingiva etabliert.
Introduction
Zahnfleischgewebe umgeben den Menschen und der Maus Gebiss und werden ständig auf die komplexe Biofilm des Zahnes 1 ausgesetzt. Die Immunzellennetz der Zahnfleischschutz Überwachung ist entscheidend für Gewebeintegrität zu gewährleisten, mit den lokalen kommensale Bakterien gewährleisten Homöostase und, zur gleichen Zeit, zwei wirksame Immunität gegen pathogene Herausforderung bietet. Um das zu erreichen Homöostase wird das Immunsystem sorgfältig auf die Zahnfleischumgebung zugeschnitten eine hoch spezialisierte Immunzellen Netzwerk zu schaffen, noch so kleine Detail wird von den Zahnfleischimmunzellpopulationen bekannt und ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebe Immunität 2.
Wenn Immunhomöostase auf dem Zahnfleisch gestört ist, entweder durch eine erhöhte Anfälligkeit Host und / oder das Vorhandensein von dysbiotischen mikrobiellen Gemeinschaften, eine entzündliche Erkrankung entsteht Parodontitis 3 4. Parodontitis ist eine weitverbreitete entzündliche Erkrankung, was zu einem Verlust des Zahnes supporting Strukturen. In seiner schweren Formen wird in ca. 10% der Bevölkerung im allgemeinen 5 ersichtlich. Die Schlüsselfaktoren in Parodontitis Anfälligkeit und Progression beteiligt Sezieren hat sich als schwierig erwiesen, 6. Allerdings Tiermodellen haben im Verständnis der Mechanismen der Parodontitis Initiierung und Progression 7 äußerst nützlich. Die Modelle können die wichtigsten Zellpopulationen und molekulare Mechanismen zu definieren, verwendet werden, die Immunhomöostase und Antrieb sind entscheidend Entwicklung einer Parodontitis zu halten. Eine solche Erkenntnis wird unser Verständnis von Zahnfleisch-spezifische Steuerung von Immunhomöostase und weiterhin unser gegenwärtiges Verständnis der Krankheitsentstehung zu transformieren.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben gefolgt erforderlichen Richtlinien und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee, NIDCR / NIH genehmigt.
1. Bereiten Sie im Voraus
- Bereiten Sie die komplette Medien: RPMI mit 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FBS.
- Bereiten DNase Mittel: 50 ml RPMI-Medium mit 7,5 ug DNase ergänzt (Make frisch, auf Eis halten zu allen Zeiten).
- Bereiten Collagenase-DNase Medien: 5 ml DNase Medium plus 3,2 mg / ml Collagenase Typ IV (Make frisch, auf Eis halten zu allen Zeiten).
- Pre-kühlen FACS-Puffer: 0,5% FBS in PBS verdünnt.
- Pre-kühlen Zentrifuge bis 4 ° C.
- Warm Schüttelinkubator bis 37 ° C.
2. Isolierung, Dissection und Zellisolierung von Zahnfleischblöcke
- Euthanize Mäuse von ihnen auszusetzen 2 in einer entsprechenden Kammer zu CO, nach ARAC Richtlinien. <li> Öffnen Sie die Brust- und Bauchhöhle, das Herz und die inneren Organe freizulegen. Zu perfundieren, stellen einen Einschnitt in die untere Hohlvene und perfundieren 3 ml PBS über dem linken Ventrikel unter Verwendung einer 3 ml-Spritze mit einer 27 G Nadel.
- Immobilisieren den Körper und Kopf der Maus auf einen Block mit Magen nach oben zeigt.
- Schneiden Sie jede Kommissur der Lippe in Richtung des Halses mit einer Schere, trennt die Haut, die Unterkiefer und Hals-Region umfasst, Freilegen der darunter liegenden Gewebe und Muskeln. Präparieren Sie die Unterlippe des Unterkiefers zu entdecken.
- Schneiden zwischen den unteren Schneidezähnen auf beiden Seiten des Unterkiefers zu trennen und jede Seite immobilisieren, um die Mundhöhle gelangen.
- Visualisieren und sezieren den Gaumen von der Nasenhöhle.
- Sezieren Bereiche mit einem 10 Blatt und sind Ober- und Unterkieferbackenzahn Bereiche mit umgebenden Zahnfleischentzündung (Abbildung 1). Stellen vertikale Einschnitte gerade anterior zu den ersten Molaren und hinter der dritten Molaren und einer horizontalen Schnitt andie Grenze des Zahnfleisches (white collar des umgebenden Gewebes Zähne).
- Legen Sie die Ober- und Unterkieferblöcke in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 5 ml Collagenase / DNase (auf Eis halten).
- Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C für 1 Stunde und während der letzten 5 Minuten Inkubation werden 50 ul 0,5 M EDTA.
- In 5 ml kaltem DNase Medien auf die 50-ml-Tube mit Geweben und sanft zu mischen wirbeln.
- Übertragen Sie die vier Blöcke von Gewebe auf eine Petrischale geben und mit 500 ul DNase Medien. Entfernen Zahnfleisch aus jedem Block von Gewebe, eine Skalpellklinge mit und zeigt die Klinge in den Zahnfleisch und Interdentalräume.
- Übertragen die Gewebe und die Medien aus der Petrischale sowie den vorhergehenden DNase Medien bei der Präparation verwendet werden, auf eine neue 50-ml-Röhrchen durch die Zelle Sieb (70 & mgr; m groß). Wasche mit DNase Medien (3-5 ml) alle Instrumente verwendet und filtriert.
- Mit dem Kolben einer sterilen 3 ml Spritze, Maische, das Gewebe gegen das Sieb,Filterung mit kaltem DNase Medien (30 bis 35 ml).
- Waschen Sie die Zelle Sieb mit kaltem DNase Medien.
- Zentrifuge bei 4 ° C, 314 xg für 6 min.
- Überstand verwerfen, erneut zu suspendieren in 1 ml Vollmedien.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzählers (die erwartete Menge sollte zwischen 8 x 10 5 bis 1,2 x 10 6 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von> 80% liegen).
3. Die Stimulation und FACS-Färbung von Zahnfleisch Cells
- Stimulieren die Einzelzellsuspension mit PMA (50 ng / ml) und Ionomycin (2,5 & mgr; g / ml) in Gegenwart von 1 ul / ml Brefeldin A.
- Inkubieren für 3,5 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Spin down und waschen mit PBS und Zentrifuge bei 4 ° C; 314 g für 6 min.
- Stain die Zellen eine Lebensfähigkeit Fleck unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers.
- Stain für extrazelluläre Marker (CD45, TCRγδ, TCR & bgr;, CD4, CD8, TCRγδ oder Ameiseibodies der Wahl) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Waschen Sie die Zellen mit kaltem FACS-Puffer und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
- Sanft vortexen das Zellpellet zu stören.
- Fix die Zellen mit 2% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen mit kaltem FACS-Puffer, Zentrifuge bei 4 ° C, 314 xg für 5 min und Flecken zur intrazellulären Zytokine.
- Füllt die FACS-Röhrchen mit einer Lösung aus kaltem 0,5% Saponin verdünnt in FACS-Puffer und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
- Hinzufügen von 300 & mgr; l von 0,5% Saponin Lösung für die FACS-Röhrchen, Inkubieren für 15 min im Dunkeln bei 4 ° C und dann zentrifugiert bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
- Stain die Zellen für die intrazelluläre Marker (IL-17A und IFNy oder Cytokine der Wahl) nach den Anweisungen des Herstellers. Waschen Sie die Zellen mit 0,5% Saponin-Lösung und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
- Waschen Sie wieder mit FACSPuffer und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
- Wieder die Zellen in 300 ul FACS-Puffer.
- Analysieren Sie die Ergebnisse auf einem Durchflusszytometer.
4. Durchflusszytometrie Analyse
- Visualisieren Zellen analysiert auf zukunfts (FSC) und Seitenstreuung (SCC) und Gate werden Trümmer auszuschließen.
- Wählen Sie einzelne Zellen mit Vorwärtsstreubereich (FSC-A) vs. Höhe (FSC-H) Parameter.
- Gate-Zellen, die unter Spannung stehen (wie von Lebensfähigkeit Färbung angedeutet) und positiv für die hämatopoetischen Marker CD45 + für weitere Analysen (2A und 2C).
- Weiter Analyse von spezifischen Markern wie in 2 und 3 dargestellt.
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Representative Results
Zur Anwendung des Protokolls veranschaulichen, zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Immunzellennetz in das Zahnfleisch von Mäusen mit und ohne Parodontitis untersucht (WT vs. LFA - / - 2A - C). Repräsentative FACS Plots zeigen Live-CD45 + hämatopoetische Zellen im Zahnfleisch (2A, 2C). Isolation und Verarbeitung von Immunzellen mit diesem Protokoll liefert genügend Zellen ex vivo Stimulation und Charakterisierung von Zytokinsekretion Muster durchzuführen. Hier zeigen wir, IL-17 und IFN-γ-Färbung insgesamt CD45 + Zellen in dem stationären Zustand (WT) und in Mäusen zeigen Parodontitis (aufgrund von LFA-Mangel) (2B - D). Diese Daten zeigen das Potential dieser Technik zu Zytokinprofile während der Gewebe Steady-State (WT) und im Kontext der lokalen Parodontitis erfassen (LFA - / -). in mice anfällig für Parodontitis gekennzeichnet wir weiter den gingivalen Zusammensetzung Immunzelle insbesondere der T-Zelle und angeborene lymphoiden Zelle (ILC) Fächer (3A - B). Wir waren in der Lage, die Produktion von IL-17 und IFN-γ in der TCR & bgr; + CD4 + T-Zellen, TCR & bgr; + CD8 + T-Zellen, TCRγδ + T-Zellen, NK und ILC Abteile (3C) zu definieren.
Abb. 1: Isolierung von murinen Zahnfleisch Illustration die Grenzen der Dissektion im Oberkiefer und dem isolierten Zahnfleischsegment demonstrieren für Zahnfleischgewebe Präparation verwendet werden. (B) Segment von murinen Oberkiefer (Molaren) mit Umriss für Block Dissektion und isolierten Block. Hämatoxylin und Eosin-Färbung (H & E) einer Oberkiefermolaren Segment mit Zahnfleisch l Geweben beschrieben wird in niedrigen (C) und höhere Vergrößerung in (D) gezeigt. Original-Vergrößerung angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative FACS Daten für Zytokin-Produktion von Zahnfleischzellen. (A - C) FACS-Diagramm, Tor für Live-CD45 + Zellen in Maus Zahnfleischzellpräparaten infolge der Ex-vivo Restimulation mit PMA und Ionomycin in WT und LFA - / -. (B - D) Repräsentative FACS Plots zeigt IFN-γ und IL-17-Färbung insgesamt CD45 + Zellen Maus von Zahnfleisch von Mäusen mit / ohne Parodontitis (aufgrund LFA-Mangel).Iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: Zytokin-Produktion von Immun Populationen in entzündetem Zahnfleisch (A) Repräsentative FACS Diagramm, Färbung für TCR & bgr; gegenüber TCRγδ auf CD45 + Zellen gated. Gating auf TCR & bgr; + -Zellen, mittlere Darstellung zeigt CD4 gegen TCR & bgr; Färbung (zur Analyse von TCR & bgr; + CD4 + T-Zellen, TCR & bgr; + CD8 + T-Zellen und TCRγδ + T-Zellen ermöglicht). Gating auf TCR & bgr; - TCRγδ - Zellen, rechte Darstellung zeigt CD45 gegen NK1.1 Färbung (ermöglicht die Analyse von NK-Zellen). (B) Repräsentative FACS Diagramm, Färbung für CD90.2 gated auf CD45 + Abstammung negativen Zellen (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCR & bgr; -), die identifiziert angeborene lymphatischen Zellen. (C) Repräsentative FACS Plots zeigt IFN-γ und IL-17-Färbung in Zellpopulationen identifiziert. Zahnfleischzubereitungen sind 20 Wochen alten LFA - / - Mäuse, die Parodontitis zu entwickeln; Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die aktuelle Technik erfolgreich eine große Zahl von Immunzellen führt (aus einer einzigen Maus) geeignet, nicht nur für die phänotypische Charakterisierung, sondern auch für funktionelle Studien ex vivo. Eine andere Gruppe war zuvor ein Protokoll veröffentlicht zu isolieren und murine gingival Immunzellen zu charakterisieren und stellte den Wert der mehrfarbigen mit Durchflusszytometrie in der Studie von Parodontitis in Tiermodellen 9. Nach erheblichen Fehlersuche den Schlüssel Änderung in diesem Protokoll war zu Präparation ganzer Blöcke von Gewebe enthalten, um zu schließen sowohl Zahnfleischkragen Flächen und Interdentalzahnfleischentzündung (Abbildung 1). Mit allein Zahnfleisch Dissektion, oft voller Dicke Klappen nicht erreicht werden und ein Teil des Zahnfleisches wird vermisst vor allem in den Interdentalräume. Unter Verwendung dieses Ansatzes Zahlen von Immunzellen geerntet werden deutlich erhöht. Diese Technik ermöglicht es auch für eine optimale Isolierung von Zahnfleischgewebe sowohl von Oberkiefer eind Kiefers.
Kritische Schritte für dieses Protokoll sind eine konservative Präparation von Zahnfleischbereichen und eine effiziente Rate der Präparation. Insbesondere sollten Blöcke von Gewebe befreit werden nur minimale Gewebe aufzunehmen um Zähne (Zahnfleisch) und nicht die Mundgewebe. Blockiert ist zu schnell seziert und Geweben und Zellen auf Eis bleiben optimale Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.
Zum Zweck der Fehlersuche ist es wichtig, dass geringe Ausbeute an Zellen zu beachten, kann mit Kollagenase, unangemessene Konzentrationen von Collagenase und / oder inadäquat Präparation des Zahnfleisches von den Gewebeblöcke unzureichender Inkubationszeit zusammenhängen. In diesem Sinne, Präparation von Zahnfleisch mit Vergrößerungslupen (2X-6X) kann hilfreich sein. Niedrige Lebensfähigkeit der Zellen kann in dem Verfahren zu Langsamkeit und Medien, Puffer und Zellen nicht restlichen kontinuierlich auf Eis zusammenhängen.
Beschränkungen dieses Protokoll, inhärenter Teil des Gewebetyp disWindparkbetrieb ist die Größe der Zahnfleischgewebe im Vergleich zu anderen anatomischen Barriere Seiten studiert (ex. Haut- oder Magen-Darm-Trakt), in denen größere Gewebe zur Verfügung stehen.
Dennoch präsentierten die Technik hat uns erlaubt, die dominierenden Zellpopulationen in den LFA zu charakterisieren - / - Modell, das Parodontitis spontan entwickelt. In LFA - / - Mäusen identifizierten wir eine dominante IL-17 Zytokin-Signatur bei der Entwicklung von Parodontitis 10. Verwendung von Mehrfarben-Durchflusszytometrie-Analyse konnten wir die zellulären Quellen von IL-17 11 zu definieren. Bei dieser Krankheit IL-17 wurde durch Einstellen TCRγδ T-Zellen, CD4 + T-Zellen und angeborene Lymphoidzellen (ILC) lokal innerhalb der Gingiva 10 hergestellt.
Mit der beträchtlichen Anzahl von mit dieser Methode auf isolierte Zellen und die Fähigkeit, auch kleine Teilpopulationen zu identifizieren, wird es nun möglich sein, eine umfassende Entwicklung verstehening der spezialisierten Immunzellen Netzwerk Zahnfleischschutz Integrität zu wahren. Diese kritische Einsicht wird uns erlauben, Immunreaktionen in der Zahnfleisch Umwelt zu bewerten. Durch die Verwendung dieser Technik können wir jetzt gehen auf bestimmte Bestandteile des Zahnfleisches Immunzellnetzwerk isolieren, indem durchflusszytometrischen Zellsortierung, sodass weitere Analysen und Charakterisierungen durchgeführt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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