Summary
Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.
Introduction
Tissus gingivaux entourent la dentition humaine et murine et sont constamment exposés à biofilm complexe de la dent 1. Le réseau des cellules immunitaires de police la barrière gingivale est essentiel au maintien de l'intégrité des tissus, assurant l'homéostasie avec les microbes commensaux locales et, dans le même temps, fournir une immunité efficace contre une infection pathogène 2. Pour atteindre l'homéostasie, le système immunitaire est soigneusement adaptée à l'environnement gingival création d'un réseau de cellules immunitaires très spécialisé, mais peu de détails sont connus des populations de cellules immunitaires gingivales et leur rôle dans le maintien du tissu immunité 2.
Lorsque l'homéostasie immunitaire est perturbé à la gencive, soit par augmentation de la sensibilité et / ou la présence de communautés microbiennes dysbiotic, un état inflammatoire hôte, la parodontite pose 3 4. La parodontite est une maladie inflammatoire commune, conduisant à la perte de la dent sstructures bandages en. Sous ses formes graves, il est vu dans environ 10% de la population générale 5. Disséquer les facteurs clés impliqués dans la parodontite susceptibilité et la progression est avéré difficile 6. Cependant, les modèles animaux ont été extrêmement utiles pour comprendre les mécanismes de la parodontite initiation et la progression 7. Les modèles peuvent être utilisés pour définir les populations de cellules principales et des médiateurs moléculaires qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie immunitaire et le développement d'entraînement de la parodontite. Une telle perspicacité va transformer notre compréhension du contrôle spécifique de la gencive de l'homéostasie immunitaire et approfondir notre compréhension actuelle de la pathogenèse de la maladie.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites dans ce protocole ont suivi les directives nécessaires et ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité, NIDCR / NIH.
1. Préparez à l'avance
- Préparer des milieux complètes: RPMI supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 10% de FBS.
- Préparer des milieux de DNase: 50 ml de milieu RPMI supplémenté avec 7,5 pg de DNase (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps).
- Préparer les médias collagénase-DNase: 5 ml de milieu DNase, plus de 3,2 mg / ml de collagénase de type IV (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps).
- tampon FACS pré-cool: 0,5% de FBS dilué dans du PBS.
- centrifugeuse pré-refroidir à 4 ° C.
- Chaud agitateur incubateur à 37 ° C.
2. Isolement, Dissection, et Cell Isolation de gingivaux Blocks
- Euthanasier les souris en les exposant à de CO 2 dans une chambre appropriée, conformément aux lignes directrices de l'ARAC. <li> Ouvrez la cavité thoracique et abdominale pour exposer le coeur et les organes internes. À perfuser, faire une incision dans la veine cave inférieure et perfuser 3 ml de PBS par l'intermédiaire du ventricule gauche en utilisant une seringue de 3 ml avec une aiguille 27 G.
- Immobiliser le corps et la tête de la souris sur un bloc avec le ventre vers le haut.
- Couper chaque commissure de la lèvre vers le cou avec des ciseaux, la séparation de la peau qui recouvre la mandibule et le cou région, exposant les tissus sous-jacents et les muscles. Disséquer la lèvre inférieure pour découvrir la mandibule.
- Couper entre les incisives inférieures pour séparer les deux côtés de la mandibule et immobiliser chaque côté pour accéder à la cavité buccale.
- Visualiser et disséquer le palais loin de la cavité nasale.
- Disséquer zones en utilisant une lame 10 et inclure des zones molaires maxillaires et mandibulaires avec entourant gencive (figure 1). Faire des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire et une incision horizontale aula frontière de la gencive (en col blanc des tissus entourant les dents).
- Placez le maxillaire et mandibulaire blocs dans un tube conique de 50 ml avec 5 ml collagénase / DNase (garder sur la glace).
- Incuber dans un incubateur secoueur à 37 ° C pendant 1 h et pendant les 5 dernières minutes de l'incubation ajouter 50 pi de 0,5 M d'EDTA.
- Ajouter 5 ml de milieu de DNase froid au tube de 50 ml avec des tissus et agiter doucement pour mélanger.
- Transférer les 4 blocs de tissus sur une boîte de Pétri et couvrir avec 500 pi de DNase médias. Retirer la gencive de chaque bloc de tissu, en utilisant une lame de scalpel et montrant la lame dans les zones interdentaires et gingivales.
- Transférer les tissus et les médias de la boîte de Pétri, ainsi que les médias de DNase précédents utilisés lors de la dissection, dans un nouveau tube de 50 ml à travers le tamis de la cellule (70 pm de taille). Laver avec les médias de DNase (3-5 ml) tous les instruments utilisés et filtre.
- En utilisant le piston d'une seringue stérile de 3 ml, écraser le tissu contre le tamis,filtration avec des milieux de DNase froide (30 à 35 ml).
- Laver le tamis cellulaire avec les médias de DNase froid.
- Centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 6 min.
- Jeter le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de milieu complet.
- Compter les cellules (la quantité attendue doit être comprise entre 8 x 10 5 à 1,2 x 10 6 cellules avec une viabilité> 80%) en utilisant un compteur de cellules automatisé.
3. Stimulation et FACS coloration des cellules gingivales
- Stimuler la suspension de cellules individuelles avec du PMA (50 ng / ml) et de l'ionomycine (2,5 pg / ml) en présence de 1 pl / ml de brefeldine A.
- Incuber pendant 3,5 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Isoler et laver avec du PBS et centrifuger à 4 ° C; 314 g pendant 6 min.
- Colorer les cellules en utilisant un colorant de viabilité en suivant les instructions du fabricant.
- Teinture pour les marqueurs extracellulaires (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ ou de fourmisibodies de choix) selon les instructions du fabricant.
- Laver les cellules avec du tampon FACS froid et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
- vortexer doucement pour perturber le culot cellulaire.
- Fixer les cellules avec 2% de paraformaldehyde pendant 20 minutes à température ambiante.
- Laver les cellules avec du tampon FACS à froid, centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 5 min et les taches de cytokines intracellulaires.
- Remplir les tubes FACS avec une solution froide de 0,5% de saponine dilué dans du tampon pour FACS et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
- Ajouter 300 ul de solution de saponine à 0,5% dans les tubes FACS, incuber pendant 15 min à l'obscurité à 4 ° C puis centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
- Colorer les cellules de marqueurs intracellulaires (IL-17A et IFNy ou des cytokines de choix) selon les instructions du fabricant. Laver les cellules avec une solution de saponine à 0,5% et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
- Laver ensuite avec FACSun tampon et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans 300 ul de tampon FACS.
- Analyser les résultats sur un cytomètre de flux.
4. Analyse de cytométrie en flux
- Visualiser les cellules à analyser sur l'avant (FSC) et de diffusion latérale (SCC) et la porte d'exclure les débris.
- Sélectionnez les cellules individuelles avec zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) par rapport à la hauteur (FSC-H) paramètres.
- Cellules de grille qui sont en direct (comme indiqué par la viabilité coloration) et positif pour le marqueur CD45 + hématopoïétiques pour une analyse ultérieure (figure 2A et 2C).
- Poursuivre l'analyse de marqueurs spécifiques comme le montre la Figure 2 et la Figure 3.
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Representative Results
Pour illustrer l'application du protocole, nous montrons des résultats représentatifs examinant le réseau des cellules immunitaires dans la gencive de souris avec et sans la parodontite (WT vs LFA - / -, Figure 2A - C). FACS représentatifs parcelles montrent cellules CD45 + hématopoïétiques vivantes dans la gencive (figure 2A, 2C). L'isolement et le traitement des cellules immunitaires avec ce protocole rendements suffisamment de cellules pour effectuer stimulation ex vivo et la caractérisation de modèles de sécrétion de cytokines. Ici, nous montrons l'IL-17 et IFN-γ coloration de CD45 + totaux cellules à l'état d'équilibre (WT) et chez des souris présentant une parodontite (due à une carence LFA) (Figure 2B - D). Ces données révèlent le potentiel de cette technique pour capturer des profils de cytokines pendant tissus état d'équilibre (WT) et dans le contexte de la parodontite locale (LFA - / -). en microe sensibles à la parodontite nous caractérise en outre la composition des cellules immunitaires gingival particulier de la cellule T et une cellule lymphoïde Innate (ILC) compartiments (figure 3A - B). Nous avons pu définir la production d'IL-17 et d'IFN-γ dans la cellule TCRβ + T CD4 +, + TCRβ des cellules T CD8 +, des cellules T TCRγδ +, NK et les compartiments de la CDI (figure 3C).
Figure 1:. Isolement de gencive murin illustration montrant les frontières de dissection dans le maxillaire et le segment isolé gingival à être utilisée pour la dissection de tissu gingival. (B) Segment du maxillaire murin (zone molaire) avec un contour pour le bloc dissection et le bloc isolé. Hématoxyline-éosine (H & E) d'un segment molaire maxillaire avec gencive l tissus exposés est représenté à faible (C) et plus fort grossissement (D). Grossissements originales indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: les données FACS représentatifs pour la production de cytokines à partir de cellules gingivales. (A - C) FACS parcelle porte montrant pour CD45 + cellules vivantes dans des préparations de cellules gingivales de la souris suivantes ex vivo re-stimulation avec PMA et ionomycine dans le document WT et LFA - / -. (B - D) parcelles de FACS représentatifs montrant l'IFN-γ et l'IL-17 coloration au total CD45 + des cellules de souris gencive de souris avec / sans parodontite (due à une carence en LFA).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. La production de cytokines par les populations immunitaires dans gencives enflammées (A) représentant FACS parcelle coloration montrant pour TCRβ contre TCRγδ fermée sur les cellules CD45 +. Gating sur les cellules TCRβ +, l'intrigue du milieu montre CD4 par rapport TCRβ coloration (permet d'analyser les cellules TCRβ + T CD4 +, des cellules TCRβ + T CD8 + et les cellules TCRγδ + T). Déclenchement sur TCRβ - TCRγδ - cellules, graphique de droite montre CD45 par rapport NK1.1 coloration (permet l'analyse des cellules NK). (B) représentant FACS tracé montrant coloration pour CD90.2 débloqué CD45 + lignée cellules négatives (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) qui identifie les cellules lymphoïdes innées. (C) emplacements de FACS représentatifs montrant l'IFN-γ et l'IL-17 coloration dans des populations de cellules identifiées. Préparations gingivales sont âgés de 20 semaines LFA - / - souris qui développent la parodontite; données sont représentatives de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La technique actuelle obtient avec succès un grand nombre de cellules immunitaires (à partir d'une seule souris) adapté, non seulement pour la caractérisation phénotypique, mais aussi pour des études fonctionnelles ex vivo. Un autre groupe avait déjà publié un protocole pour isoler et caractériser les cellules immunitaires gingivales murin et introduit la valeur de l'utilisation de la cytométrie de flux multicolore dans l'étude de la parodontite chez des modèles animaux 9. À la suite de dépannage considérable la modification clé dans ce protocole devait inclure dissection des blocs entiers de tissu afin d'inclure les deux zones de cols gingivales et gencive interdentaire (Figure 1). Avec dissection gingival seul, souvent volets d'épaisseur totale ne sont pas atteints et une partie de la gencive est manqué en particulier dans les espaces interdentaires. En utilisant cette approche, le nombre de cellules immunitaires récoltées sont significativement augmentés. Cette technique permet également d'isolation optimale des tissus gingivaux tant du maxillaire und mandibule.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent une dissection prudente des zones gingivales et un taux efficace de dissection. Plus précisément, des blocs de tissus doivent être disséqués pour inclure uniquement tissulaire minimale autour des dents (gencive) et les tissus buccaux pas. Les blocs doivent être disséqués rapidement et tissus et de cellules devraient rester sur la glace pour assurer la viabilité cellulaire optimale.
Aux fins de dépannage, il est important de noter que le faible rendement des cellules peut être liée à l'insuffisance de temps d'incubation avec de la collagénase, les concentrations inappropriées de la collagénase et / ou l'insuffisance dissection de la gencive à partir des blocs de tissus. Sur cette note, la dissection de la gencive à l'aide loupes (2X-6X) peut être utile. Faible viabilité des cellules peut être liée à la lenteur de la procédure et de médias, des tampons et des cellules ne restent pas en permanence sur de la glace.
Limitations de ce protocole, inhérentes au type de DIS de tissusdisséqués est la taille des tissus gingivaux, par rapport à d'autres sites de barrière anatomique étudiée (ex. peau ou tractus gastro-intestinal), dans laquelle les grandes tissus sont disponibles.
Néanmoins, la technique présentée ici a permis de caractériser les populations de cellules dominantes dans la LFA - / - modèle qui développe spontanément parodontite. Dans LFA - / - souris, nous avons identifié une signature dominante de cytokine IL-17 au cours du développement de la parodontite 10. Utilisation multicolore analyse par cytométrie en flux, nous avons pu définir les sources cellulaires de l'IL-17 11. En fixant l'IL-17 cette maladie a été produite par les cellules T, TCRγδ cellules T CD4 + et les cellules lymphoïdes innées (CIT) localement au sein de la gencive 10.
Avec le nombre important de cellules isolées de cette méthodologie et la capacité d'identifier même les petites sous-populations, il sera désormais possible de développer une approche globale comprendretion du réseau de cellules immunitaires spécialisées maintien de l'intégrité de la barrière gingivale. Cette vision critique nous permettra d'évaluer les réponses immunitaires de l'environnement gingival. En utilisant cette technique, nous pouvons maintenant passer à isoler des constituants spécifiques du réseau des cellules immunitaires de gencive par cytométrie de flux tri cellulaire, permettant des analyses et des caractérisations supplémentaires à entreprendre.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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