Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Abstract

ההתפשטות מהירה של תאים, ביטוי ספציפי הרקמות של גנים ואת הופעתה של רשתות איתות לאפיין התפתחות עוברית מוקדמת של כל בעלי החוליות. קינטיקה ומיקום של אותות - אפילו בתוך תאים בודדים - בעובר המתפתח משלים זיהוי של גנים התפתחותיים חשובים. טכניקות Immunostaining מתוארים כי הוכחו להגדיר את קינטיקה של אותות בעלי חיים תאיים ושלמים במבנים קטנים כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון, הדמיה ועיבוד תמונות באמצעות מיקרוסקופ מתחם confocal-סריקת לייזר ניתן להשלים כמה כמו 36 שעות.

דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם רצוי חוקרים המבקשים לבצע מחקרים בתוך בעלי החוליות היא הזולה רלוונטי מחלות אנושיות. knockouts או knockdowns הגנטיים חייב להיות מאושר על ידי האובדן של מוצר החלבון בפועל. אישור כזה של אובדן חלבוןיכול להיות מושג באמצעות הטכניקות המתוארות כאן. רמזים לתוך מסלולי איתות ניתן לפענח גם באמצעות נוגדנים כי הם תגובתי עם חלבונים ששונו שלאחר translationally ידי זרחון. שמירה ואופטימיזציה של המדינה פוספורילציה של אפיטופ לכן זה קריטי כדי קביעה זו לבין מושגת על ידי פרוטוקול זה.

מחקר זה מתאר שיטות לתקן עוברים במהלך 72 שעות של פיתוח הראשון שיתוף בתרגום במגוון אפיטופים רלוונטי עם cilia בתוך שלפוחיות (KV) של Kupffer, הכליה ואת האוזן הפנימית. טכניקות אלו הם ישירים, אינם דורשים דיסקציה יכול להסתיים בתוך פרק זמן קצר יחסית של זמן. הקרנת ערימות תמונת confocal לתוך תמונה אחת היא אמצעי שימושי של הצגת נתונים אלה.

Protocol

הנהלים דג הזברה בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה.

1. הכנת ריאגנטים

  1. 4% PFA / PBS. לשקול 8 גרם של paraformaldehyde (PFA) ב למכסה המנוע קטר. עוד בזמן שהיה במנדף, לפזר את PFA היבשים ~ 80 מ"ל מזוקקים H 2 O עם ערבוב וחימום עד 50 ° C. תוך ערבוב, מוסיפים 3 - 10 טיפות של 1N NaOH טריים עד PFA נמס לגמרי פתרון מבהיר. מסירים מהאש ומוסיפים 100 מ"ל 2x פוספט בופר (PBS). תביאו נפח 200 מ"ל עם מזוקקים H 2 O. מגניב RT ולאשר pH של 7.4 לפני השימוש. חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס אבל להשתמש בתוך שבוע.
  2. להשתמש 100% מתנול ללא כל תוספות. השתמש 95% אתנול ללא כל תוספות.
  3. כן Tween פוספט שנאגר (PBT). מוסף מלוח פוספט שנאגר (PBS) עם 0.1% Tween-20. להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון המניה 20% Tween-20 עד 100 מ"ל 1x PBS. חנות ב RT.
  4. כן פוספט שנאגר Triton-X (PBTx). מוסף PBS עם 0.1% Triton X-100. הוסף 0.5 מ"ל של המניה 20% טריטון X-100 ל -100 מ"ל של PBS. חנות ב RT.
  5. כן 10% NGS / PBTx. סרום עיזים רגיל (NGS) בלוקים הלא ספציפי אתרי קישור. NGS חנות aliquots ב -20 ° C. כדי להשתמש, להוסיף 1 מ"ל ל 9 מ"ל PBTx.
  6. כן 50% גליצרול / PBS. מערבבים היטב בחלקים שווים של PBS 2x ו -100% גליצרול. חנות ב RT.

קיבוע העובר 2.

  1. . (. למשל, β-יקטין: CAAX-GFP) גידול השג סוג בר (AB ו WIK) או מהונדס עוברי דרך הזדווגויות טבעיות. אם תרצה, להזריק עוברים עם בונה או morpholinos, כמתואר. 15,16
  2. הרם עוברים. איסוף עוברים דגירה על 28.5 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) לחסום פיגמנטציה כמתואר. 17 p>
  3. תקן. כאשר עובר הגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי, 18,   להרדים את העוברים באמצעות MESAB, להוציא מים מערכת כמה שיותר ולהוסיף PFA / PBS 4% טרי במשך 3 - 4 שעות ב RT. הערה: לפעמים פחות מ -20 שעות שלאחר ההפריה (hpf), לתקן לפני dechorionation. לפעמים אחרי 20 hpf, dechorionate לפני קיבוע באמצעות שני זוגות מלקחיים נקודת קנס תחת מיקרוסקופ לנתח.
  4. שינוי פתרונות. העבר עוברים באמצעות pipet נשא רחב, כמתואר. 17 פתרונות שינוי 1.5 מ"ל כתרים צינורות microcentrifuge, פשוט בכך שהוא מאפשר עוברים להתיישב על ידי כוח המשיכה ללא צנטריפוגה.
  5. פוסט מקבע לאחר 3 -. 4 שעות, להסיר PFA / PBS, להחליף עם 100% מתנול ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה 48 לפחות. הערה: לקבלת immunoreactivity מקסימלי P-CaMK-II, להגביל את זמן אחסון מתנול הכולל לשבוע אחד.
"> 3. עובר פריטי Immunostaining

  1. מניחים מינימום של 10 עוברי עבור כל תנאי הניסוי ב צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge כתרים, תווית אותם.
  2. אפשר העוברים להתיישב. סר וזורק מתנול רעננותם עם שטיפות מתקדמות המכילות 0.5 מיליליטר של הפחתה ריכוזית אתנול, כמצוין לשלב הבא. כל צעד הוא לשטוף 5 דקות עם נדנדה.
  3. בהדרגת רעננותם עם 5 פתרונות אלה: 66% אתנול / 33% PBTx, 33% אתנול / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (זהו החוזרים הראשונים של PBTx), 100% PBTx (זהו חוזר שני של PBTx).
  4. הסר לשטוף PBTx האחרון. הוסף 0.5 מ"ל 10% NGS / PBTx. דגירה במשך שעה 1 לפחות ב RT עם נדנדה עדין ולאחר מכן להסיר ולסלק פתרון.
  5. כן פתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול ב 10% NGS / PBTx. אם שיתוף immunostaining, השתמש נוגדן זיקה חזקה יותר הראשון. לצורך המחקר, דגירה עם נוגדנים חד שבטיים טובולין אנטי acetylated עכבר מדולל 1: 500. לקבלת examplדואר, אם יש 10 דגימות, לשלב 6 μl של פתרון נוגדן המניה עם 3 מ"ל של 10% NGS / PBTx ולאחר מכן להפיץ 0.3 מ"ל של זה לתוך צינור אחד.
  6. להוסיף 0.2 - 0.5 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל על צינור אחד לטבול כל העוברים. דגירה עם נדנדת O / N העדין ב RT.
  7. בבוקר, להסיר ולסלק פתרון נוגדנים. הוסף 0.5 מ"ל 2% NGS / PBTx לשטוף נוגדן ראשוני עודף. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים.
  8. דים האורות תקורה לדלל את נוגדנים משני fluorescently- מצומדות המתאים 10% NGS / PBTx כך שכל מצב מכיל 0.5 מ"ל לפחות. עם נוגדן ראשוני טובולין אנטי acetylated העכבר, השתמש עז צבע ירוק ניאון IgG אנטי עכבר ביחס של 1: דילול 500.
  9. דגירה נוגדנים משני למשך 4 שעות עם נדנדה עדין ב RT בחושך. מעתה ואילך, תהליך דגימות תחת אורות מעומעמים דגירה במיכל כהה או על ידי לפפה בנייר אלומיניום.
  10. בסוף הדגירה, להסיר ולסלק את פתרון נוגדנים משני. הוסף 0.5 מ"ל 2% NGS / PBTx לשטוף. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים.
  11. אם-immunostaining שיתוף, להשיג את הנוגדן הראשוני השנייה מזן שונה הנוגדן הראשוני הראשון. במחקרים אלה, בצע את נוגדן אנטי phospho CaMK-II ארנב ידי נוגדנים משני IgG נגד ארנב עז צבען מצומדות אדום ניאון.
  12. לדלל ארנב נגד phospho CaMK-II נוגדן 1:20. עבור כל צינור של עוברים, להשעות ב 0.3 מ"ל 10% NGS / PBTx, ולאחר מכן להוסיף 15 μl של פתרון נוגדן המניות.
  13. ודא כי עוברי שקועים ואורות מעומעמים. דגירה עם נדנדת O / N העדין ב RT בחושך.
  14. בבוקר תחת אורות עמומים, להסיר ולסלק פתרון נוגדנים. הוסף 0.5 מ"ל 2% NGS / PBTx. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים.
  15. שמור אורות תקורה עמומות לדלל מספיק של fluorescently-conju המתאיםנוגדנים משני מגודרים כך שכל מצב בו לפחות 0.5 מיליליטר. במחקר זה, לדלל את נוגדנים משני IgG נגד ארנב עיזים אדומות ניאון מצומדות צבע (מסלול אדום) 1: 500 ב 10% NGS / PBTx.
  16. דגירה נוגדנים משני השני למשך 4 שעות עם נדנדה עדין ב RT בחושך.
  17. בסוף הדגירה זה ותחת אורות עמומים, להסיר ולסלק את פתרון נוגדנים משני. הוסף 0.5 מ"ל PBTx. נער בעדינות במשך 5 דקות. סר וזורק פתרון. חזור פעמיים. חנות באחת PBTx או 50% גליצרול / PBS תלוי ההליך הדמיה.

4. הדמיה Confocal ועיבוד

  1. הר עובר הדמיה. מניחים 1 - 5 עוברים בשקופית זכוכית. ליצור תא בין coverslip הראשי לשקופית באמצעות שברי coverslip בכל צד של החדר. בדרך כלל, ארבעה # 1 coverslips משמש כדי להפוך ערימות spacer אלה ללא הדבקה.
    הערה: אין הרכבה בינונית הכרחית.
  2. השתמש טבילת שמן 100Xהמטרה להביא עובר יחיד אל המוקד באמצעות האור המועבר. כבה האור. הפעל מיקרוסקופ confocal. ודא לייזרים מתאימים (ירוק ו / או אדום) מופעלים accessary מוקד מרחוק עוסק.
  3. הפעל את תוכנית confocal. ב "הבר הרוכש", בחר את המטרה הנכונה. ב "בסיסי XY" בר, להגדיר את גודל התמונה 1,024 על ידי לחיצה על כפתור 1,024.
  4. ב "לייזר וגלאים" בר, לחץ על התיבה האדומה 488 ותיבת 568 ירוק להפעיל לייזר גלאי עבור כל ערוץ. גדר החריר עד בינוני ולהתאים את הרווח הבר "הרווח" של כל ערוץ לדמיין.
  5. בשורת "רוכשת הגדרות", לחץ על "חי" כדי להתחיל רכישת תמונות. בשורת "הגדרות תצוגה", בטל את "כוח אינטגרל זום" תיבת למרכז בחלון "חי".
  6. בשורת "רוכש הגדרות", תחת לשונית "Z", צעד דרך שכבות של תמונה. לאחר בחירה נוmber סעיפים אופטי לשלב לתוך התמונה, לעבור בשלב כלשהו "המרכז" של מטוס- z.
  7. בכרטיסייה "Z", לחץ על התיבה "הפניה" אדום קטן. זה יהיה לאפס את RFA בנקודה נבחרה "המרכז". בתיבת הדו שכותרתו "גודל שלב", לבחור את עובי השכבות (בין 0.25 מיקרומטר ו -2.0 מיקרומטר הוא אידיאלי). שימו לב בתיבה "קובץ הגודל" ולנסות להגביל ל -1 GB.
    הערה: בדרך כלל, עד 40 חלקים אופטיים של 0.5 - 1.0 מיקרומטר מתקבלת, אך מספר סעיפים יכולים להיקבע באופן אמפירי.
  8. כדי למצוא את קיצוני העליון של התמונה, לחץ על העיגול שליד "למעלה" ולעבור דרך שכבות z. כעת לחץ על העיגול שליד "תחתית", המחשב ייקח את התמונה בחזרה שכבת כמרכז. שוב לעבור דרך שכבות כדי למצוא את הקיצוני התחתון של התמונה.
  9. לחץ על "Live" שוב "ההגדרות רוכשות" תיבה כדי לעצור את הליזררְכִישָׁה. בלוח זה, לחץ על התיבות האדומות שכותרתו הממוצעת מחסנית Z. תיבות אלה יהפכו לירוק.
  10. בתיבת "רוכשת הגדרות", לחץ על "יחיד" כדי לרכוש את סדרת תמונות כולו. אתה יכול לעקוב אחר התקדמות כפי שהוא סורק בשני ערוצים ודרך z-הערימה כולה.
  11. כדי לשמור, לחץ על החלון נפח ולחץ על "שמירה בשם" ואת שם הקובץ. שמור כקובץ ".ids". נפח לעבד את הקובץ בעוד Z- מחסנית הוא עדיין פתוח, בחר את הנתונים לנתץ התפריט ולחץ על "נפח לדקלם". שמור את הקובץ שניתן כקובץ TIFF. זהו הדימוי המוקרן המוצגים בפרסום זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תנאים אופטימליים חזותי phospho-אפיטופים

שיטות המתארות את immunolocalization של אפיטופים חלבון עוברי דג זברה כבר דלילות יחסית בהשוואה לאלו ללוקליזציה mRNAs באמצעות כלאה באתרה. Fixatives המשמשים לאיתור אפיטופים חלבונים בתאים ריסי של עוברי דג הזברה כללו 4% PFA / PBS ו מקבע של דנט, שהוא תערובת של מתנול DMSO. 19 לוקליזציה של RNA על ידי הר שלם הכלאה באתרו (בכך) בדרך כלל מושגת באמצעות PFA ואחריו אחסון מתנול 100%. 20,21 המחקרים שלנו גילו כי שילוב מקבע משאלה, כאשר הגבילו הזמן מתנול כדי שניים עד שבעה ימים, היה עולה לאין ערוך על כל מקבע אחר עבור immunolocalization עם נוגדן P-CaMK-II . האות שהושגה עם זה שילוב PFA / מתנול הייתה also באופן משמעותי יותר מאשר כאשר מקבע של דנט, 4% PFA / PBS או מתנול שימשו לבד, תלוי בזמן התפתחותית ומיקום בתוך העובר.

כאשר אופטימיזציה של הטכניקה המתוארת כאן ועבור כל זמן מקבע והתפתחותיות בשימוש, מדגם מלא הוכן שבו כל הפעולות היו במעקב, חוץ מזה את הנוגדן הראשוני הושמט. דגימות בקרה כאלה לא היו אות ניאון כאשר צלמו באותם התנאים האמורים. שליטה זו מומלצת עבור חוקרים אחרים משכפלים גישה זו עם כל נוגדן.

השילוב מקבע PFA / מתנול הניב את האות P-CaMK-II החזק והיה גם תואם עם immunostaining עבור טובולין acetylated, אשר מהווה סמן תקן cilia. מבחינה התפתחותית, איבר ריסי הראשונה שנובע כבר צלמה במחקרים אלה היא השלפוחית ​​של Kupffer (KV). הערך KV ממוקם בקצה האחורי של notochord כמוצג על 12-somite (15 hpf) שלב (איור 1). ערך KV הוא איבר חולף והוא אחראי על סימטריה בין שמאל וימין. מתברר בשלב 2-somite (12 hpf) ונעלם סביב הבמה 18-somite. מכות cilia העיקרי ליצור זרימה מעגלית של נוזל, מה שמוביל העלאת Ca 2+ בתאים ריסי רירית KV ואת ההפעלה של CaMK-II במקומות בדידים (איור 1). P-CaMK-II תגובתיות מופיעה ונעלמה בצד אחד של KV כל עוד cilia המכים. 12 בשלב מוקדם זה, הכולל עוברי רמות CaMK-II עדיין רק חצי הרמה ליום 24 hpf ועשירית אחד ברמה ב 3 ימים של התפתחות. 11 אולי בגלל הביטוי CaMK-II הכולל הוא נמוך יחסית ב 15 hpf, כל שיפור הטכניקה immunostaining בשלב זה חשוב במיוחד.

between 24 ו -72 hpf של פיתוח, P-CaMK-II נראה על פני השטח apical של תאים ריסי רירית אזורים ספציפיים של צינוריות pronephric (איורים 2,3). Immunoreactivity של CaMK-II הכוללת לאורך צינור pronephric כולו וברחבי somites הסמוך (איור 2) מראה כי רק קבוצת משנה של עובריים CaMK-II מופעל (P-CaMK-II).

תנאי קיבוע תואמים שימור קרינת GFP

טכניקות קיבוע אלה גם עולים בקנה עם שמירת חלבון פלואורסצנטי ירוקה (GFP) קרינה ללא שיפור (איור 3). בשנות ה GFP-tagged CaMK-II לבנות המשמש בנתון זה, GFP שומרת הקרינה מספיק כי קיבעון PFA / מתנול immunostaining הבאים. בתצוגה וההגברה הגדולה של התאים המצפים את צינור pronephric (איור 3), הדואר ביטוי פסיפס של GFP-CaMK-II ניתן לצפות בתאים יש גם immunostained עבור P-CaMK-II.

האוזן העוברית דג הזברה היא רקמה אחרת שבה הגובה של Ca 2 +, הפועלים באמצעות CaMK-II, משפיע התפתחותה. 14 אוזני דג זברה בדרך כלל מופיעות בסביבות יום אחד של פיתוח. בשלב זה, CaMK-II מופעל בעוצמה בבסיס של kinocilia וברמות נמוכות לאורך kinocilium (איור 4). זו קבוצה של תמונות מראה כי טכניקת קיבעון immunolocalization זה יכול לזהות מכתים בתוך ריסים, מבנה שעל החתך הוא פחות מ -1 מיקרומטר. cilia אלה לשמור על המבנה שלהם לאורך כל התהליך קיבעון immunostaining זה.

דוגמה נוספת של counterstaining שני צבעים באוזן הפנימית במועד מאוחר יותר של התפתחות הושגה על ידי מכתים עם שני Alexa 488phalloidin ו טובולין acetylated אנטי ואחריו Alexa 568 מתויג נוגדנים משני (איור 5). ראוי לציין כי שיטת קיבוע PFA / מתנול שומרת על F יקטין טובולין, וזה לא נכון של כל fixatives. דוגמא זו מוצגת כתמונת צבע הממוזגת לאוזן כולה ולאחר מכן עבור תת אזורים. 14

דוגמא מייצגת סופית של counterstaining שני צבעים הושגה עם זן של הדג שיצר עוברות עם GFP קרום במיקוד (איור 6). GFP קרום ממוקד אינו מחובר לכל פרוטאין אחרים הולך לאיבוד כאשר חילוץ עם מתנול, ולכן הדימוי הזה התקבל דגים שתוקנו עם PFA לבד. תוצאה זו מרמזת כי הטיפול מתנול תמציות ממברנות, ולכן אינה מומלצת חלבונים שעשויים להיות קרום כבול באופן בלעדי. אות P-CaMK-II בנתון זה היא פחתה ביחס מושג שאם methanol שימשו גם, אבל זה מוכיח כי בשלב זה ומיקום (כליות) של העובר המתפתח, האות חזק מספיק כדי להתגלות ללא טיפול מתנול. זה לא נכון בשלב KV;. כלומר, מתנול נדרש לדמיין immunostaining P-CaMK-II. דוגמא זו מוצגת רק כתמונה ממוזגת איפה צינור pronephric של הכליות צמודה שרירי תא מטען.

לסיכום, שיטת קיבוע PFA / מתנול המתואר כאן תואם שימור GFP ועם מכתים עבור F- אקטין, טובולין acetylated, CaMK-II סך P-CaMK-II.

איור 1
איור 1. P-CaMK-II counterstained עבור acetylated טובולין (cilia) ב KV דג הזברה. צפיות של שלב somite יחיד חי 12 (12 אס) העובר מגלה את מיקומו האחורי של KV ידי arrowhead (תצוגה לרוחב, א) ואת מעגל בתוך הקופסה (תצוגת הגחון, B). עובר בשלב זה נקבע באמצעות PFA / מתנול. עוברים היו immunostained עבור טובולין acetylated ואחריו נוגדנים משני אלקסה 488 -labelled (מסלול ירוק). לאחר מכן, נוגדן הארנב polyclonal נגד P-CaMK-II היה ואחריו נוגדנים משני אלקסה 568- שכותרתו (מסלול אדום). שני ערוצים תחזיות תמונה פלורסנט נרכשו כמתואר בהגדלות גדולות בהדרגה (C, D). בר סולם = 10 מיקרומטר. נתון זה שונה מן פרסום קודם. 12 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. P-CaMK-II counterstained עבור סה"כ CaMK-II יחד כליה דג הזברה. העובר dechorionated יחיד 30 hpf נקבע באמצעות PFA / מתנול. עוברים הוכתמו אז עבור CaMK-II הכולל ואחריו נוגדנים משני שכותרתו Alexa 488 (ירוק). בשלב הבא, את הנוגדן הראשוני P-CaMK-II היה ואחריו נוגדנים משני שכותרתו Alexa 568 (אדום). מכתים מגלה העשרת מופעל CaMK-II (באדום) יחד למשטח הפסגה של בתאים המרפדים את צינורות של הכליה דג הזברה pronephric ואילו CaMK-II הכולל הוא מועשר על גבולות somite של רקמת שריר סמוכים וברחבי סרקומר. בר סולם = 50 מיקרומטר. תמונות אלה נרכשו בהגדלה נמוכה יותר מתואר בטקסט על מנת להמחיש את הכליה כולה. נתון זה שונה מן פרסום קודם. 13 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3. P-CaMK-II מונה צילמו עבור GFP בתאים כליה דג הזברה. 30 זה העובר hpf שהוזרק עם cDNA קידוד GFP-CaMK-II שלילי דומיננטי. 13 זריקות כאלה בדרך כלל מראים ביטוי פסיפס. העובר נקבע באמצעות PFA / מתנול ואז immunostained עבור P-CaMK-II באמצעות נוגדן משנית שכותרתו Alexa 568. הדמיה מגלה כי GFP נמשכת דרך קיבוע PFA / מתנול, התייבשות, חסימת immunostaining. בר סולם = 10 מיקרומטר. נתון זה שונה מן פרסום קודם. 13 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4 P-CaMK-II counterstained עם acetylated טובולין ב האוזן הפנימית דג הזברה. 30 זה העובר hpf נקבע באמצעות PFA / מתנול. הנוגדן טובולין אנטי acetylated היה אחריו על מנת ידי נוגדנים משני אלקסה 488 -labeled, נוגדן P-CaMK-II ואת נוגדנים משני שכותרתו Alexa 568. מכתים מגלה כי P-CaMK-II נוכח לאורך ריסי אוזן פנימיות ושיתוף localizes עם טובולין acetylated. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. נתון זה שונה מן פרסום קודם. 14 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. יקטין acetylated טובולין ב אוזן פנימית דג הזברה. ילד בן שלושה ימים (72 hpf) עובר דג זברה היה קבוע immunostained עבור acetylated tubulin באמצעות Alexa 568 נוגדנים משני -labeled, ואחריו להדמיה אקטין באמצעות Alexa 488 phalloidin. צילה וכן עצבוב axonal של האוזן מתגלה על ידי טובולין acetylated (באדום) ומבנים F- אקטין כוללים סיבי שריר (בירוק). שני אזורי סנסוריים ריסים של אוזן דג הזברה מוצגים ביתר פירוט: המקולה הקדמית (בבוקר) ואת האחורי crista (PC). בר סולם = 10 מיקרומטר. נתון זה שונה מן פרסום קודם. 14 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
. איור 6 P-CaMK-II מונה צילמו עבור ממברנה GFP ב כליה דג הזברה תמונה ממוזגת אחת זה שבו β-אקטין:. CAAX-GFP העובר (30 hpf) היה קבוע מוכתם עבור P-CaMK-השני ואחריה נוגדנים משני שכותרתו Alexa 568. מכתים מגלה העשרת מופעל CaMK-II (באדום) יחד למשטח הפסגה של בתאים המרפדים את צינורות של הכליה דג הזברה pronephric. תאי ductal כליות אלה שוכנים ממש מתחת רקמת שריר ושניהם מסומנים על ידי ביטוי של GFP ממוקד קרום (בירוק). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה PFA / מתנול פותחה במעבדה זה במטרה העיקרית של אופטימיזציה של immunolocalization של epitope phospho-T 287 -CaMK-II במהלך ההתפתחות דג הזברה. שיטה זו מקומי בהצלחה P-CaMK-II במהלך היווצרות של מספר איברים ריסי כולל KV דג הזברה, 12 האוזן הפנימית 14 וכליות. 13 במיוחד בשלב KV, טכניקה זו היה צורך. ההצלחה של שיטה זו היא כנראה עקב שילוב של א) ומזעור autofluorescence, ב) שמירה על epitope phospho-CaMK-II ו- C) נגישות משופרת של epitope לנוגדנים.

מגבלה עיקרית של גישה זו היא הזמן של אחסון מתנול. בעוד immunoreactivity של P-CaMK-II היא מקסימלית לאחר יומיים מתנול ב -20 ° C, תגובתיות של epitope זה הולך לאיבוד לאחר שבוע של אחסון מתנול. זה לא ברור אם בשלב זה קבוצת פוספט הוא ח.י.drolyzed או denaturation נוספת מתרחשת כי ירידות immunoreactivity. מתנול / EGTA ב -20 ° C. הוא מקבע מהיר מסורתית לשימור מבנים עשיר טובולין במהלך פיתוח של העוברי מוקדם. 22 עם זאת, מתנול לבד אינם רצויים לשימור מבני מורפולוגיה או אפילו כמו שלד התא יקטינו חייבת להיות קדמו PFA.

יתרונות נוספים של גישה זו הם כי הוא גם משמר אפיטופים אחרים כגון טובולין F יקטין acetylated ואינו מבטל את קרינת יליד GFP. Fixatives אחר, כגון המקבע של דנט, עדיף על אפיטופים אחרים 13 ולהישאר תואם מכתים P-CaMK-II, למרות מכתים P-CaMK-II הוא חלש המקבע של דנט מאשר PFA / מתנול. מאז-חלבוני phospho רווחות מסלולי איתות כי הם פעילים במהלך ההתפתחות מוקדמת, המקבע של דנט PFA / מתנול מומלץ כשתי fixatives עבור אפיטופים-phospho אחרים זבועובר rafish. בפיתוח יישומים עם טכניקה זו עבור חלבונים אחרים ונוגדנים שלהם, זה כבר מועיל להיות נוגדנים כי הם גם תגובתי על immunoblots וכדי יש משובטים ביטוי יתר חלבונים שבה נוגדנים ניתן תוקף. 12

זה שווה את המאמץ כדי לייעל טכניקות immunolocalization כי זה א) יכול לאמת דיכוי גנים ברמת החלבון ו ב) מאפשר פיתוח מודלים של פעולה. במעבדה זו, תוצאות של מבחנים אלה אפשרו גיבוש המודלים שבאמצעותם פונקציות CaMK-II. לדוגמא, מיקומו KV הוא חולף וא-סימטרי, כמו התפקיד של האיבר הזה. בכליה, מיקומו בצד הפסגה של תאי ductal pronephric מציע תפקידים המגיבים לאותות מן דביק. לבסוף, הפעלת אנזים זה puncta הספציפי האינטנסיבי בבסיס kinocilia האוזן מרמז אות Ca 2+ מקומית. השיטות שתוארו כאןגם צריך להיות שימושי לכל חוקר המבקש להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של כל סוג תא עוברי בשני ערוצי ניאון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0,817,658.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Tags

כימיה גיליון 108 קיבוע אפיטופים-phospho סידן cilia מיקרוסקופיה Kupffer של שלפוחיות כליות אוזן דג הזברה
Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothschild, S. C., Francescatto, L., … More

Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter