Réalisé Evolution Méthode<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Library Création et dépistage

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

L' évolution dirigée dans Saccharomyces cerevisiae offre de nombreux avantages attrayants lors de la conception d' enzymes pour des applications biotechnologiques, un processus qui implique la construction, le clonage et l' expression de bibliothèques de mutants, couplé à haute fréquence recombinaison homologue de l' ADN in vivo. Ici, nous présentons un protocole pour créer et bibliothèques de mutants d'écran dans la levure basé sur l'exemple d'un champignon aryl-alcool oxydase (AAO) pour renforcer son activité totale. Deux segments de protéines ont été soumis à l' évolution concentrée dirigée par mutagenèse aléatoire et in vivo la recombinaison de l' ADN. Surplombs de ~ 50 pb flanquant chaque segment a permis au réassemblage correcte du gène AAO-fusion dans un vecteur linéarisé donnant naissance à un plasmide à réplication autonome complète. Bibliothèques de mutants fonctionnels enrichis avec des variantes AAO ont été criblés dans S. Les surnageants cerevisiae avec un dosage à haut débit sensible à la base de la réaction de Fenton. Le processus général deconstruction d'une banque de S. cerevisiae décrit ici peut être facilement appliquée à évoluer beaucoup d' autres gènes eucaryotes, en évitant des réactions PCR supplémentaires, in vitro recombinaison de l' ADN et ligature étapes.

Introduction

Évolution moléculaire dirigée est une méthode robuste, rapide et fiable pour concevoir des enzymes ^{1, 2.} Par séries itératives de mutation aléatoire, recombinaison et de criblage, des versions améliorées des enzymes peuvent être générés qui agissent sur ​​de nouveaux substrats, dans de nouvelles réactions, dans la non-naturelle environnements, ou même pour aider la cellule à atteindre de nouveaux objectifs métaboliques ^3-5. Parmi les hôtes utilisés dans l' évolution dirigée, la levure Saccharomyces cerevisiae du brasseur propose un répertoire de solutions pour l'expression fonctionnelle des protéines eucaryotes complexes qui ne sont pas autrement disponibles dans homologues procaryotes ^6,7.

Utilisé de façon exhaustive dans les études de biologie cellulaire, ce petit modèle eucaryote présente de nombreux avantages en termes de modifications post-traductionnelles, la facilité de manipulation et de transformation d' efficacité, sont tous les traits qui importants à l' ingénieur enzymes par évolution dirigée ^8. En outre, la haute fréquencede recombinaison homologue de l' ADN dans S. cerevisiae couplé à son appareil de relecture efficace ouvre un large éventail de possibilités de création de la bibliothèque et de l' assemblage de gènes in vivo, de favoriser l'évolution des différents systèmes d' enzymes uniques aux voies artificielles complexes ^9-12. Notre laboratoire a passé la dernière décennie la conception d' outils et de stratégies pour l'évolution moléculaire des différentes ligninases dans la levure (des oxydoréductases impliquées dans la dégradation de la lignine lors de la pourriture du bois naturel) ^13-14. Dans cette communication, nous présentons un protocole détaillé pour préparer et bibliothèques de mutants d'écran dans S. cerevisiae pour un modèle flavooxidase, -aryl-alcool oxydase (AAO ¹⁵⁾ -, qui peut être facilement traduits à de nombreuses autres enzymes. Le protocole implique une méthode d'évolution ciblée dirigée (MORPHING: Mutagène organisée par recombinaison homologue Process in vivo Regroupement) assistée par l'appareil de cellule de levure ^16,da test de criblage très sensible basé sur la réaction de Fenton, afin de détecter l' activité AAO sécrété dans le bouillon de culture ^17.

Protocol

1. Mutant Library Construction Choisissez les régions à soumettre à MORPHING avec l'aide d'algorithmes de calcul sur la base des modèles disponibles sur la structure cristalline ou homologie 18. Ici, cibler deux régions de AAO de Pleurote du panicaut pour la mutagenèse aléatoire et la recombinaison (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), tout en amplifiant le reste du gène (844 pb) par PCR haute fidélité (Figure 1). Note:</str…

Representative Results

AAO de P. eryngii est un flavooxidase extracellulaire qui fournit des peroxydases fongiques par H 2 O 2 pour commencer à attaquer la lignine. Deux segments de AAO ont été soumis à l' évolution centrée dirigée par MORPHING afin d'améliorer son activité et son expression dans S. cerevisiae 19. Indépendamment des enzymes étrangers hébergés par S. cerevisiae, la question la plus critique lors de la construction …

Discussion

Dans cet article, nous avons résumé la plupart des trucs et astuces employées dans notre laboratoire pour concevoir des enzymes par l' évolution dirigée dans S. cerevisiae ( en utilisant AAO comme exemple) afin qu'ils puissent être adaptés pour une utilisation avec de nombreux autres systèmes enzymatiques eucaryote en suivant simplement l'approche commune décrite ici.

En termes de création de la bibliothèque, MORPHING est une méthode en un seul pot rapide à …

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)