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Biology

Dirigido Método Evolução Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens atraentes no projecto enzimas para aplicações biotecnológicas, um processo que envolve a construção, clonagem e expressão de bibliotecas de mutantes, acoplada a alta frequência de recombinação homóloga de ADN in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo para criar e bibliotecas mutantes tela em leveduras com base no exemplo de um fúngica oxidase aril-álcool (AAO) para melhorar a sua actividade total. Dois segmentos de proteína foram sujeitos a evolução focalizado dirigido por mutagénese aleatória de ADN e na recombinação in vivo. Saliências de ~ 50 pb que flanqueia cada segmento permitiu a remontagem correcta do gene AAO-fusão num vector linearizado dando origem a um total de plasmídeo de replicação autónoma. Bibliotecas mutantes enriquecidos com variantes funcionais da AAO foram rastreados em S. cerevisiae sobrenadantes com um ensaio de elevado débito sensível com base na reacção de Fenton. O processo geral dea construção da biblioteca em S. cerevisiae aqui descrito pode ser facilmente aplicado a evoluir muitos outros genes eucarióticos, evitando reacções adicionais de PCR in vitro de recombinação de DNA e ligação etapas.

Introduction

Evolução molecular dirigida é um método robusto, rápido e fiável para conceber enzimas 1, 2. Através de ciclos iterativos de aleatória mutação, recombinação e selecção, versões melhoradas das enzimas pode ser gerado que actuam sobre novos substratos, em novas reacções, em não-naturais ambientes, ou até mesmo para ajudar a célula de atingir novos objectivos metabólicas 3-5. Entre os anfitriões utilizados na evolução dirigida, levedura Saccharomyces cerevisiae da cervejaria oferece um repertório de soluções para a expressão funcional de proteínas eucarióticas complexas que não estejam disponíveis em vias procariotas 6,7.

Utilizado exaustivamente em estudos de biologia celular, este pequeno modelo eucariótico tem muitas vantagens em termos de modificações pós-traducionais, a facilidade de manipulação e transformação eficiência, todos os quais são características importantes de engenheiro enzimas por evolução dirigida 8. Por outro lado, a alta frequênciarecombinação homóloga de ADN em S. cerevisiae acoplado ao seu aparelho à prova de leitura eficiente abre um vasto leque de possibilidades para a criação de biblioteca e montagem de gene in vivo, promovendo a evolução de diferentes sistemas de enzimas individuais para vias artificiais complexos 9-12. Nosso laboratório passou a última década projetando ferramentas e estratégias para a evolução molecular de diferentes ligninases em levedura (Oxirredutases envolvidas na degradação da lignina durante o decaimento de madeira natural) 13-14. Nesta comunicação, nós apresentamos um protocolo detalhado para preparar e bibliotecas mutantes tela em S. cerevisiae para um modelo flavooxidase, -aril-oxidase de álcool (AAO 15) -, que podem ser facilmente convertidos para muitas outras enzimas. O protocolo envolve um método evolução focada-dirigida (MORPHING: Processo mutagênicos Organizado recombinação homóloga in vivo pelo Agrupamento) assistida pelo aparelho celular de levedura 16, umda ensaio de rastreio muito sensível com base na reacção de Fenton, a fim de detectar a actividade AAO secretado para o caldo de cultura 17.

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Protocol

1. Construção do mutante Biblioteca

  1. Escolher as regiões a ser submetido à transição com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura de cristal ou homologia modelos disponíveis 18.
    1. Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1).
      Nota: Vários segmentos podem ser estudados por MORPHING de forma independente ou combinada 16.
  2. Ampliar as áreas visadas por PCR mutagênico. Criar áreas entre os segmentos (~ 50 pb cada) sobreposto por sobreposição de reacções de PCR das regiões definidas.
    1. Prepare PCR mutagénica de segmentos-alvo num volume final de 50 uL contendo uma cadeia molde de ADN (0,92 ng / uL), 90 nM de senso de oligo (RMLN para o segmento de MI e AAO-PA para o segmento M-II), 90 nM de uminiciador ntisense (AAO-92C para o segmento de MI e rMLC para segmento H-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM de cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO), MgCl 1,5 mM, MnCl2 0,05 mM de 2 e 0,05 U / ul de polimerase de ADN de Taq. Sequências de iniciadores são detalhadas na Figura 1.
    2. Usar o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 seg, 50 ° C durante 45 seg, 74 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 74 ° C durante 10 min (1 ciclo).
  3. Amplificar as regiões não-mutagénicos com ultra-alta polimerase fidelidade e incluem as áreas correspondentes que se sobrepõem os segmentos mutagénicos e / ou saliências vector linearizado.
    1. Prepare misturas reaccionais num volume final de 50 ul contendo: molde de ADN (de 0,2 ng / uL), 250 nM de oligo sentido HFF, 250 nM de oligo anti-sentido de HFR, dNTPs 0,8 mM (0,2 mM cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,02 U / ul de polimerase de ADN iproof. sequências de iniciadores são detalhados em <strong> Figura 1.
    2. Usar o seguinte programa de PCR: 98 ° C durante 30 seg (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 72 ° C durante 10 min (1 ciclo).
      Nota: Com condições descritas no 1.2 e 1.3 sobreposições de 43 bp (região plasmídeo-M1); 46 bp (região de região-HF M1); 47 pb (região-M2 região HF) e 61 pb (M2 região plasmídeo) são concebidos (Figura 1) para favorecer no splicing in vivo em leveduras.
    3. Purifica-se todos os fragmentos de PCR (mutagénicos e não mutagénicos) com um kit de extracção de gel comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Linearizar o vector de modo a que as regiões de cerca de 50 pb que flanqueia são criados que são homólogas às 5'- e 3'- extremidades do gene alvo.
    1. Prepara-se uma mistura de reacção contendo linearização 2 ug de ADN, 7,5 U de BamHI, 7,5 L Xho I, 20 ug de BSA e 2 ul de tampão Bam HI 10x num volume final de 20 ul.
    2. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h e 40 min. Posteriormente, proceder a inactivação a 80 ° C durante 20 min.
  5. Purifica-se o vector linearizado por extracção em gel de agarose a fim de evitar a contaminação com o plasmídeo circular residual (Figura 2).
    1. Carregar a mistura reaccional para a digestão mega-poço de um baixo ponto de fusão do gel de agarose semi-preparativa (0,75%, w: v), bem como uma alíquota (5 pi) da mistura de reacção na adjacentes bem como um repórter.
    2. eletroforese Run DNA (5 V / cm entre os eletrodos, 4 ᵒC) e separar o gel de agarose correspondente ao mega-bem e armazená-lo em 4 ᵒC em 1x TAE.
    3. Manchar a faixa com a escada de peso molecular e o repórter. Visualizar as bandas sob a luz UV. Nick a posição onde os linearizadas lugares vetor.
      Observação: Como a qualidade do vector linearizado purificado é um critifator de cal para a recombinação de sucesso e montagem em levedura, evitar manchas gel para eletroforese de DNA semi-preparativa. O uso de corantes e exposição aos raios UV para a extração de gel pode afectar a estabilidade do vector de ADN, comprometer a eficiência de recombinação in vivo. Como alternativa aos corantes EtBr tóxicos, Gel corantes SYBR vermelha e são comumente usados ​​para a coloração do gel.
    4. Na ausência de luz UV, identificar o vector linearizado no fragmento mega poço utilizando a orientação dos entalhes na pista repórter coradas de modo que ele pode ser isolado.
    5. Extrair o vector linearizado a partir de agarose e purificá-lo com um gel extraction kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: O uso de altas cópia vectores vaivém epissomal com marcadores de antibióticos e de auxotrofia: Neste exemplo, aplicou-se o uracilo independente e resistência à ampicilina pJRoC30 vector, sob o controlo do promotor de levedura GAL1.
  6. Preparar um mi equimolarxture dos fragmentos de PCR e misturá-lo com o vector linearizado numa proporção de 2: 1, com não menos do que 100 ng do plasmídeo linearizado (teste diferentes rácios de biblioteca equimolar / vector aberto para conseguir bons rendimentos de transformação).
    1. Medir a absorvância dos fragmentos de PCR e o vector linearizado a 260 nm e 280 nm para determinar a concentração e pureza.
  7. Transformar células competentes de levedura com a mistura de ADN utilizando um kit de transformação de levedura comercial (ver Tabela para o abastecimento) de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Aqui, use uma protease deficiente e URA3 - S. dependentes cerevisiae, BJ5465. Transformar as células com o vector parental circularizado como um padrão interno durante o rastreio (ver abaixo). Além disso, o fundo vá transformando o vector linearizado na ausência de fragmentos de PCR.
      Nota: Em caso de detecção de níveis iniciais de secreção baixos, use S.cerevisiae protease estirpes deficientes como BJ5465 para promover o acúmulo de proteína ativa em sobrenadantes de cultura. Se a enzima alvo é submetido a hiperglicosilação, a utilização de estirpes de glicosilação-deficiente (por exemplo, Δ Kre2 que só é capaz de prender pequenas oligómeros de manose) poderia ser uma opção adequada.
  8. Placa as células transformadas em SC placas de abandono e incubar-los a 30 ° C durante três dias. Plate (em SC drop-out placas suplementadas com uracil) URA3 - S. cerevisiae células com falta do plasmídeo como um controlo negativo para o rastreio (ver abaixo).

2. Alto Throughput Screening Assay (Figura 3)

  1. Encher um número apropriado de placas de 96 poços estéreis (23 placas para analisar uma biblioteca de 2.000 clones) com 50 ul de meio mínimo por cavidade com a ajuda de um robot de pipetagem.
  2. Escolha das colónias individuais a partir do SC-gota a placas e transferi-los para as placas de 96 poços.
    1. Em cada prato, inocular número da coluna 6 com o tipo parental como padrão interno e bem H1 com URA3 - S. cerevisiae (células em meio SC suplementado com uracilo) sem plasmídeo como um controlo negativo.
      Nota: Bem H1 é preenchido especificamente com os meios de abandono suplementadas com uracil. Um meio contendo bem em branco sem células também pode ser preparado como um controle adicional esterilidade.
  3. Cubra as placas com suas tampas e envolvê-los em Parafilm. Incubar as placas durante 48 h a 30 ° C, 225 rpm e 80% de humidade relativa num agitador húmido.
  4. Remover o Parafilm, adicionar 160 uL de meio de expressão para cada cavidade com a ajuda do robot de pipetagem, voltar a selar as placas e incubar durante mais 24 h.
    Nota: Minimal médio e médio expressão são preparados como relatado em outros 19. níveis de secreção podem variar em função do gene em estudo e, consequentemente, tele incubação vezes tem de ser optimizada em cada caso, para sincronizar o crescimento celular em todas as cavidades.
  5. Centrifugar as placas (placas mestres) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C.
  6. Transferir 20 uL do sobrenadante dos poços na placa mestra para a placa réplica, utilizando um líquido de manuseamento de múltiplas robótico.
    Nota: Para favorecer a secreção de enzima é aconselhável substituir o péptido de sinal nativa da proteína alvo por péptidos de sinal vulgarmente utilizados para expressão heteróloga em levedura (por exemplo, o factor de prepro-α líder, o líder do K 1 da toxina assassina de S. cerevisiae, ou mesmo versões quiméricas de ambos os péptidos 13). Alternativamente, o péptido sinal nativo pode ser evoluído exclusivamente para a secreção em levedura.
  7. Adicionar 20 ul de p -methoxybenzylalcohol 2 mM em 100 mM de tampão fosfato de sódio pH 6,0, com a ajuda do robot de pipetagem. Agitar as placas brevemente com uma de 96 nósLL misturador de placas e incubar durante 30 min à TA.
  8. Com o robot de pipetagem, adicionar 160 ul do reagente FOX para cada placa de réplica e agita-se brevemente com o misturador (concentração final de mistura FOX no poço: 100 uM de xilenol laranja, 250 ^ M de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 e mm H 25 2 SO 4).
    1. Adicionar vários aditivos para o reagente para aumentar a sensibilidade, tais como co-solventes orgânicos (DMSO, etanol, metanol) ou sorbitol 17. Aqui, amplificar a resposta por adição de sorbitol a uma concentração final de 100 mM (figura 4).
  9. Ler as placas (modo de ponto final, t 0) a 560 nm num leitor de placas.
  10. Incubar as placas à temperatura ambiente até a cor se desenvolve e medir novamente a absorção (T 1).
    1. Calcula-se a actividade relativa da diferença entre o valor Abs após a incubação e a da medição inicial normalizada com base na pareTipo ntal para cada placa (Dt 1 - t 0).
  11. Sujeitar os melhores hits mutantes para dois re-exames consecutivos para excluir falsos positivos.
    Nota: Tipicamente, re-rastreios incluem isolamento de plasmídeos a partir de levedura, amplificação e purificação em Escherichia coli, seguido de transformação de células de levedura fresca com o plasmídeo 19. Cada clone seleccionado é re-exibido em pentaplicate.

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Representative Results

AAO de P. eryngii é um flavooxidase extracelular que abastece as peroxidases fúngicas com H 2 O 2 para começar a atacar a lignina. Dois segmentos de AAO foram submetidos a evolução focada-dirigido por MORPHING, a fim de melhorar a sua actividade e a sua expressão em S. cerevisiae 19. Independentemente das enzimas estrangeiras abrigadas por S. cerevisiae, o problema mais crítico, quando a construção de bibliotecas de mutantes em leveduras refere-se a engenharia das regiões de sobreposição específicos para favorecer o splicing entre os fragmentos e a sua clonagem no vector linearizado. No exemplo actual, para cada reacção de PCR, todos os fragmentos tinha saliências de aproximadamente 50 pb para promover no splicing in vivo em leveduras. O número de eventos de recombinação é dependente do número de segmentos a ser montado e clonado com o vector linearizado (isto é, dois eventos de cruzamento ocorreu entre otrês segmentos de PCR -o dois segmentos mutagénicos que flanqueiam o segment- não mutagenizada e dois cruzamentos suplementares com o vector linearizado; Figura 1). De acordo com nossa experiência, as sequências sobrepostas com mais de 50 pb diminuir a probabilidade de recombinação interna enquanto eles não melhorar a eficiência de transformação.

Cargas de mutação foram ajustados por amostragem de bibliotecas de mutantes com diferentes paisagens, calcular o número de clones com <10% da actividade da enzima parental, e ainda mais verificá-los por sequenciação de uma amostra aleatória de variantes activas e não activas (Figura 5A). Para a determinação do coeficiente de variância S. cerevisiae células foram transformadas com a AAO parental e plaqueadas em SC-gota a placas. As colónias individuais foram repicadas e inoculadas num poço de placa 96 e a actividade dos clones foi avaliada a partir de preparações frescas. amostra mutagênicos2 (Taq / MnCl2 0,05 mM) foi escolhido como o ponto de partida para a construção da biblioteca e de triagem.

Como a actividade biológica da AAO aumenta a concentração de H 2 O 2 no meio de reacção, temos procurado por um ensaio sensível e preciso para quantificar pequenas alterações em H 2 O 2. Fox é um método químico com base na reacção de Fenton 20, em que a oxidação por H 2 O 2 unidades da reacção de Fe3 + com laranja de xilenol, para formar um complexo azul-violeta (O -cresolsulfone phthalein-3 ', 3' '- BIS (metilimino) diacetato ε 560 = 1,5 x 10 4 M -1 cm -1). O passo de oxidação ferroso foi amplificado pela adição de sorbitol para aumentar a sensibilidade do ensaio, aumentando a propagação de radicais com uma ε aparente 560 = 2,25 x 10 5 M -1 cm -1 (Fifigura 4).

O limite de detecção neste ensaio (na gama uM) foi calculado pelo método de determinação em branco em uma placa de 96 poços com padrões, em triplicado (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 e 4 uM de H 2 O 2 ) e usando vários sobrenadantes de S. cerevisiae falta o gene URA3 - plasmídeo (Figura 5B). O ensaio era linear na presença de sorbitol (até 8 uM de H 2 O 2), e, embora linearidade foi mais persistente na ausência deste açúcar (pelo menos até 30 uM de H 2 O 2) a resposta foi mais fraco (por exemplo, a 6 uM de H 2 o 2, uma melhoria de 4 vezes foi obtida na presença de sorbitol -deep púrpura de uma absorvância de 0,24 na sua ausência -Dark laranja- (Figura 5B)). A relação entre a concentração ABS e AAO foi avaliada com quantidades crescentes de Enzyme (a partir de sobrenadantes de levedura) e uma resposta linear foi observado; R2 = 0,997 (Figura 5C).

É de notar que o sinal de FOX foi estável durante várias horas, sem qualquer aparente interferência dos diferentes elementos no caldo de cultura. A sensibilidade estimada de FOX foi ~ 0,4 ^ M de H 2 O 2 produzido pela AAO no sobrenadante na presença de sorbitol, e ~ 2 uM na sua ausência.

Uma biblioteca de mutante de 2.000 clones foi construído e rastreados com este ensaio. Vários mutantes foram identificadas com AAO melhoraram notavelmente a secreção e a actividade contra álcool p-metoxibenzílico (Figura 5D) 19.

figura 1
Figura 1.. MORPHING Protocolo para AAO Evolução Dois diferentes regiões da AAO, foram alvos de mutagénese aleatória e recombinação: M1 (azul, 590 pb), que inclui o péptido sinal (SP); M2 (amarelo, 528 pb). A região de HF (cinzento, 844 pb) foi amplificada com polimerases de alta fidelidade. Regiões mutagénicos foram mapeados na estrutura cristalina da AAO (PDB ID: 3FIM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Preparação de produtos de PCR e o vector linearizado (A) em gel de agarose analítico (1% w: v). Contendo um marcador de peso molecular (escada de 1 kb) nas pistas 1 e 7; o vector linearizado com BamHI e Xhol, pista 2; PCR segmento M1, pista 3; PCR segmento de M2, a pista 4; PCR HF segmento, pista 5; o em vivo reagrupados vector linearizado com Nhel (que continha o gene completo AAO com regiões MI, HF e H-II), pista 6 (B) Vector de linearização, as pistas 1 e 6 padrões moleculares, 1 Kb escada; plasmídeo miniprep, pista 2; plasmídeo linearizado com NheI, pista 3; plasmídeo linearizado com Bam Hl e Xho I, pista 4; plasmídeo linearizado obtido por extracção de gel e clean-up após a digestão, pista 5. (C) Protocolo para a purificação do plasmídeo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Alto rendimento Triagem protocolo. Visão geral do processo. Por favor clique aqui para ver uma vers maioresion desta figura.

Figura 4
Figura 4. O método de raposa. Fungos da podridão branca-atacam a parede celular da madeira através de uma reacção de Fenton que produz radical hidroxilo OH •. O método FOX casais que esta reação xilenol laranja (XO), ea absorção do complexo do XO-Fe 3+ é medido a 560 nm. Oxidação ferroso é amplificada pela adição de sorbitol à mistura reagente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. paisagens mutagênicos para MORPHING Bibliotecas Usando Erro diferentes condições de PCR propensa e validação do ensaio de rastreio. (A ng>) paisagens morphing. A linha horizontal a cheio mostra a actividade do tipo parental no ensaio enquanto que as linhas tracejadas indicam o coeficiente de variação do ensaio. As percentagens indicam o número de clones com menos de 10% da actividade da enzima parental. As atividades são plotados em ordem decrescente. (B) O limite de detecção foi avaliada FOX com concentrações crescentes de H 2 O 2 na presença (círculos pretos) e ausência (quadrados brancos) de sorbitol. Correlação (C) linear entre a concentração AAO (sobrenadantes de transformantes) e Abs 560nm. Cada ponto corresponde à média de 8 experiências e inclui o desvio padrão. (D) Mutant biblioteca paisagem. As variantes seleccionadas (quadrados sombreados) foram novamente pesquisados ​​como relatado noutro local 19. linha sólida mostra a atividade da AAO tipo parental.> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste artigo, nós resumimos a maioria das dicas e truques empregados no nosso laboratório para projetar enzimas por evolução dirigida em S. cerevisiae (AAO utilizando como exemplo) de modo que eles podem ser adaptados para utilização com muitos outros sistemas enzima eucariótica, simplesmente seguindo a abordagem comum descrito aqui.

Em termos de criação de biblioteca, Metamorfose é um método one-pot rápido para introduzir e recombinar mutações aleatórias em trechos de proteínas pequenas, deixando as restantes regiões da proteína inalterado 16. Bibliotecas com várias cargas mutacionais podem ser prontamente preparados e recombinados in vivo, juntamente com o plasmídeo linearizado, para gerar um vector completo de replicação autónoma. É crítico que flanqueiam sequências que se sobrepõem cada estiramento para permitir que os fragmentos do gene completo para ser remontada por meio de recombinação in vivo, evitando reacções adicionais de PCR e em passos de ligação in vitro. Neste protocolo, a frequência de eventos de cruzamento entre os fragmentos de PCR pode ser aumentada reduzindo o tamanho das regiões que se sobrepõem, embora isso possa comprometer a eficácia de transformação. Independentemente de as polimerases de ADN utilizados para a PCR mutagénica, as cargas de mutação pode ser modificada anteriormente construção e análise de bibliotecas pequenas paisagens mutantes (Figura 5A). Se o Kit GeneMorph II é utilizada, é ainda aconselhável a seguir esta abordagem uma vez que a recombinação do ADN in vivo pode nomeadamente modificar as cargas mutacionais estimado pelo fabricante. Em termos gerais, paisagens mutantes em que 35 - 50% do total de clones triados têm menos do que 10% da actividade parental são adequados para campanhas de evolução dirigida, embora este número varia em função da proteína alvo e a sua actividade. Tipicamente, a análise de bibliotecas de mutantes paisagens são ainda verificados por sequenciação de DNA de uma amostra aleatória de mutantes. No exemplo corrente, o Taqpolimerase de ADN foi utilizado devido à sua elevada taxa de erro, que está ligada à falta de 3'-→ 5'proof lendo actividade de exonuclease. As cargas mutacionais em bibliotecas Taq foram modificados pela adição de diferentes concentrações de MnCl2, mas o uso de dNTP desequilibrados e / ou a redução das concentrações de molde de genes, também são adequados opções. limitações inerentes de se transformar vêm de o número de segmentos a serem recombinadas. De acordo com a nossa experiência, até quatro blocos de proteína (cinco eventos de cruzamento contando as áreas de recombinação com o vector linearizado) pode ser unido com bons rendimentos de transformação (10 ~ 5 clones por reacção de transformação). Este método pode ser facilmente modificado para realizada mutagénese de sítio múltiplo-saturação (por exemplo, utilizando iniciadores degenerados END ou a criação de degenerescência durante 22 codões originais) para explorar várias posições ao mesmo tempo, reduzindo significativamente os esforços de rastreio 21,22.

"cegos" para AAO é extremamente sensível e confiável (com base na detecção directa de H 2 O 2, independentemente de o substrato utilizado pela enzima), o que representa um ensaio de complementar outros bem estabelecida indirecta protocolos para detectar peróxidos (principalmente acoplamento peroxidases com substratos colorimétricos). Com efeito, o ensaio FOX foi rotineiramente utilizados para medir a H 2 O 2 em fluidos biológicos, e pode agora ser facilmente traduzidos em protocolos de evoluir AAO e qualquer outro H 2 O 2 a produção de enzimas (por exemplo, oxidase de glicose, desidrogenases celobiose, glioxal oxidases, metanol oxidases), especialmente para a atividade em substratos não-naturais onde as respostas são de outra maneira difícil de detectar.

De S. cerevisiae é o hospedeiro mais adequado para a evolução dirigida de genes eucarióticos, uma vez que oferece eficiências de transformação elevados (até 1 x 106 transformantes / ug do ADN), que efectua o processamento e modificações pós-tradução complexas (incluindo N- e C-terminal de processamento e glicosilação) e exporta proteínas estranhas para o caldo de cultura através de uma via secretora. Além disso, bem estabelecidas ferramentas da biologia molecular estão disponíveis para trabalhar com esta levedura, incluindo episs�ica uni ou bi-direcional (não-integrativa) vectores de transporte sob o controlo de promotores de diferentes forças. Por último, mas não menos importante, a sua elevada frequência de recombinação do ADN homólogo permitiu uma variedade de métodos que serão desenvolvidos para obter diversidade de ADN que estão actualmente a ser usadas para evoluir proteínas individuais, bem como as vias enzimáticas mais complexas 8, 12, 13, 23. a in vivo de reparação abertura e o dispositivo de leitura de prova desta levedura pode também ser empregue para criar quimeras quando recombinar genes diferentes (com aprox. 60% de identidade de sequência de ADN), bem como para baralhar melhores prole / mutações a partir de um directed evolução campanha, ou para reunir in vitro e in métodos de recombinação in vivo em um ciclo de evolução, enriquecendo bibliotecas mutantes em termos de dobragem e função.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

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References

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Biologia Molecular Edição 110 Dirigido evolução, com foco no aleatória mutagênese high-throughput screening
Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem
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Viña-Gonzalez, J.,… More

Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

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