Dirigida Método Evolución en<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

La evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas atractivas en el diseño de enzimas para aplicaciones biotecnológicas, un proceso que consiste en la construcción, la clonación y la expresión de bibliotecas de mutantes, junto a la alta frecuencia de recombinación homóloga de ADN in vivo. A continuación, se presenta un protocolo para crear y bibliotecas mutantes de levadura en pantalla basado en el ejemplo de un fungicida aril-alcohol oxidasa (AAO) para mejorar su actividad total. Dos segmentos de proteínas se sometieron a la evolución dirigida-centrado por mutagénesis aleatoria y recombinación de ADN in vivo. Voladizos de ~ 50 pb que flanquean cada segmento permite el correcto montaje del gen AAO-fusión en un vector linealizado que da lugar a un plásmido de replicación autónoma completa. Bibliotecas mutantes enriquecidos con variantes funcionales AAO se rastrearon en S. sobrenadantes cerevisiae con un ensayo de alto rendimiento sensible basado en la reacción de Fenton. El proceso general deconstrucción de la biblioteca en S. cerevisiae se describe aquí se puede aplicar fácilmente a evolucionar muchos otros genes eucarióticos, evitando reacciones adicionales de PCR, en la recombinación de ADN y la ligadura pasos in vitro.

Introduction

Evolución molecular dirigida es un método robusto, rápido y fiable para diseñar enzimas ^{1, 2.} A través de rondas iterativas de mutación al azar, recombinación y análisis, versiones mejoradas de las enzimas se pueden generar que actúan sobre los nuevos sustratos, en las reacciones novedosas, en no natural ambientes, o incluso para ayudar a la célula para alcanzar nuevos objetivos metabólicos ^3-5. Entre los anfitriones utilizados en la evolución dirigida, levadura Saccharomyces cerevisiae de cerveza ofrece un repertorio de soluciones para la expresión funcional de las proteínas eucariotas complejos que no son de otra manera disponible en homólogos procariotas ^6,7.

Se utiliza exhaustivamente en estudios de biología celular, este pequeño modelo eucariota tiene muchas ventajas en términos de las modificaciones post-traduccionales, la facilidad de manipulación y la eficiencia de transformación, todos los cuales son rasgos importantes para diseñar enzimas por evolución dirigida ^8. Por otra parte, la alta frecuenciade la recombinación del ADN homólogo en S. cerevisiae acoplado a su aparato de prueba de lectura eficiente abre una amplia gama de posibilidades para la creación de la biblioteca y el conjunto de genes in vivo, el fomento de la evolución de los diferentes sistemas de enzimas individuales a vías artificiales complejos ^9-12. Nuestro laboratorio ha pasado la última década el diseño de herramientas y estrategias para la evolución molecular de diferentes ligninasas en la levadura (oxidorreductasas implicadas en la degradación de la lignina durante la descomposición de la madera natural) ^13-14. En esta comunicación, presentamos un protocolo detallado para preparar y bibliotecas mutantes pantalla en S. cerevisiae para un modelo flavooxidase, alcohol-oxidasa-arilo (AAO ¹⁵⁾ -, que se puede traducir fácilmente a muchas otras enzimas. El protocolo consiste en un método de evolución dirigida centrado (MORPHING: Proceso mutagénico Organizada recombinación homóloga in vivo por la Agrupación), asistido por el aparato de célula de levadura ^16, unada ensayo de cribado muy sensible basado en la reacción de Fenton con el fin de detectar la actividad de AAO secretada en el caldo de cultivo ^17.

Protocol

1. Mutante de construcción de biblioteca Elegir las regiones para ser sometidos al de transformación con la ayuda de algoritmos de cálculo en base a la estructura cristalina o de homología de 18 modelos disponibles. Aquí, el objetivo de dos regiones de AAO de Pleurotus eryngii para la mutagénesis al azar y la recombinación (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mientras que la amplificación de la resto del gen (844 bp) por PCR de alta fidelidad (Figura 1). <b…

Representative Results

AAO de P. Eryngii es un flavooxidase extracelular que suministra peroxidasas fúngicas con H 2 O 2 a empezar a atacar la lignina. Dos segmentos de AAO se sometieron a la evolución dirigida centrado-morphing con el fin de mejorar su actividad y su expresión en S. 19 cerevisiae. Independientemente de las enzimas extranjeros albergadas por S. cerevisiae, el problema más crítico en la construcción de bibliotecas de mut…

Discussion

En este artículo, hemos resumido la mayor parte de los consejos y trucos empleados en nuestro laboratorio para diseñar enzimas por evolución dirigida en S. cerevisiae (usando AAO como ejemplo) para que puedan ser adaptados para su uso con muchos otros sistemas de enzimas eucariotas simplemente siguiendo el enfoque común se describe aquí.

En cuanto a la creación de la biblioteca, el morphing es un método rápido de un solo recipiente para introducir y recombinar las mutaciones…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)