Summary

Dirigida Método Evolución en<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Published: April 01, 2016
doi:

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

La evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas atractivas en el diseño de enzimas para aplicaciones biotecnológicas, un proceso que consiste en la construcción, la clonación y la expresión de bibliotecas de mutantes, junto a la alta frecuencia de recombinación homóloga de ADN in vivo. A continuación, se presenta un protocolo para crear y bibliotecas mutantes de levadura en pantalla basado en el ejemplo de un fungicida aril-alcohol oxidasa (AAO) para mejorar su actividad total. Dos segmentos de proteínas se sometieron a la evolución dirigida-centrado por mutagénesis aleatoria y recombinación de ADN in vivo. Voladizos de ~ 50 pb que flanquean cada segmento permite el correcto montaje del gen AAO-fusión en un vector linealizado que da lugar a un plásmido de replicación autónoma completa. Bibliotecas mutantes enriquecidos con variantes funcionales AAO se rastrearon en S. sobrenadantes cerevisiae con un ensayo de alto rendimiento sensible basado en la reacción de Fenton. El proceso general deconstrucción de la biblioteca en S. cerevisiae se describe aquí se puede aplicar fácilmente a evolucionar muchos otros genes eucarióticos, evitando reacciones adicionales de PCR, en la recombinación de ADN y la ligadura pasos in vitro.

Introduction

Evolución molecular dirigida es un método robusto, rápido y fiable para diseñar enzimas 1, 2. A través de rondas iterativas de mutación al azar, recombinación y análisis, versiones mejoradas de las enzimas se pueden generar que actúan sobre los nuevos sustratos, en las reacciones novedosas, en no natural ambientes, o incluso para ayudar a la célula para alcanzar nuevos objetivos metabólicos 3-5. Entre los anfitriones utilizados en la evolución dirigida, levadura Saccharomyces cerevisiae de cerveza ofrece un repertorio de soluciones para la expresión funcional de las proteínas eucariotas complejos que no son de otra manera disponible en homólogos procariotas 6,7.

Se utiliza exhaustivamente en estudios de biología celular, este pequeño modelo eucariota tiene muchas ventajas en términos de las modificaciones post-traduccionales, la facilidad de manipulación y la eficiencia de transformación, todos los cuales son rasgos importantes para diseñar enzimas por evolución dirigida 8. Por otra parte, la alta frecuenciade la recombinación del ADN homólogo en S. cerevisiae acoplado a su aparato de prueba de lectura eficiente abre una amplia gama de posibilidades para la creación de la biblioteca y el conjunto de genes in vivo, el fomento de la evolución de los diferentes sistemas de enzimas individuales a vías artificiales complejos 9-12. Nuestro laboratorio ha pasado la última década el diseño de herramientas y estrategias para la evolución molecular de diferentes ligninasas en la levadura (oxidorreductasas implicadas en la degradación de la lignina durante la descomposición de la madera natural) 13-14. En esta comunicación, presentamos un protocolo detallado para preparar y bibliotecas mutantes pantalla en S. cerevisiae para un modelo flavooxidase, alcohol-oxidasa-arilo (AAO 15) -, que se puede traducir fácilmente a muchas otras enzimas. El protocolo consiste en un método de evolución dirigida centrado (MORPHING: Proceso mutagénico Organizada recombinación homóloga in vivo por la Agrupación), asistido por el aparato de célula de levadura 16, unada ensayo de cribado muy sensible basado en la reacción de Fenton con el fin de detectar la actividad de AAO secretada en el caldo de cultivo 17.

Protocol

1. Mutante de construcción de biblioteca Elegir las regiones para ser sometidos al de transformación con la ayuda de algoritmos de cálculo en base a la estructura cristalina o de homología de 18 modelos disponibles. Aquí, el objetivo de dos regiones de AAO de Pleurotus eryngii para la mutagénesis al azar y la recombinación (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mientras que la amplificación de la resto del gen (844 bp) por PCR de alta fidelidad (Figura 1). <b…

Representative Results

AAO de P. Eryngii es un flavooxidase extracelular que suministra peroxidasas fúngicas con H 2 O 2 a empezar a atacar la lignina. Dos segmentos de AAO se sometieron a la evolución dirigida centrado-morphing con el fin de mejorar su actividad y su expresión en S. 19 cerevisiae. Independientemente de las enzimas extranjeros albergadas por S. cerevisiae, el problema más crítico en la construcción de bibliotecas de mut…

Discussion

En este artículo, hemos resumido la mayor parte de los consejos y trucos empleados en nuestro laboratorio para diseñar enzimas por evolución dirigida en S. cerevisiae (usando AAO como ejemplo) para que puedan ser adaptados para su uso con muchos otros sistemas de enzimas eucariotas simplemente siguiendo el enfoque común se describe aquí.

En cuanto a la creación de la biblioteca, el morphing es un método rápido de un solo recipiente para introducir y recombinar las mutaciones…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem, Spain ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
6. Plates
96-well plates Greioner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greioner Bio-One 655161 Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greioner Bio-One 656171 Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)

References

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Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

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