Imagerie réorganisation spatiale d'une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d'expression transitoire du tabac
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
Visualisation des événements de signalisation dynamiques dans des cellules vivantes a été un défi. Nous avons élargi un système d'expression transitoire établie, la complémentation fluorescente (BiFC) Essai biomolécules dans les cellules épidermiques du tabac, de l'interaction protéine-protéine d'essai pour surveiller la distribution spatiale de la transduction du signal dans des cellules végétales. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test BiFC pour montrer que l'interaction et la signalisation entre l'Arabidopsis MAPKKK YODA et MAPK6 se produisent à la membrane plasmique. Lorsque le BASL de protéine d'échafaudage a été co-exprimé, l'interaction YODA-MAPK redistribué et spatialement co-polarisé avec CFP-BASL. Ce système d'expression de tabac modifiée permet un examen rapide de signalisation localisation et dynamiques des changements (moins de 4 jours) et peut accueillir plusieurs de couleurs de protéines fluorescentes (au moins trois). Nous avons également présenté des méthodes détaillées pour quantifier la distribution des protéines (localisation spatiale asymétrique, ou «polarisation»;) Dans des cellules de tabac. Ce système d'expression de tabac de pointe a un potentiel à être largement utilisé pour le test rapide des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales vivantes.
Introduction
Les protéines interagissent dans un des complexes de réseau et forment hiérarchiques complexes qui jouent un rôle central dans presque tous les processus biologiques qui se produisent dans un environnement cellulaire imprévisible. Cependant, du développement des plantes à des réponses de croissance, il y a eu un manque d'outils pratiques qui peuvent non seulement rapidement, mais aussi efficacement identifier et surveiller ces événements de signalisation dynamiques au niveau subcellulaire.
Le système d'expression de protéine transitoire tabac épiderme des feuilles a appel des avantages pour la visualisation des protéines fluorescentes dans les cellules vivantes. Ce système fournit des semi – conditions in vivo qui permettent la modification des protéines post-traductionnelle et un examen rapide de la localisation des protéines. En examinant le signal complémenté YFP, le dosage de complémentation bimoléculaire fluorescente (BiFC) indique la possibilité d'une interaction protéine-protéine dans les cellules végétales. Par rapport à d' autres méthodes, par exemple, la levure deux hybrides (Y2H) et co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fournit également un puissant moyen de visualiser les compartiments où les interactions protéine-protéine peuvent se produire au niveau subcellulaire.
Parce que la division cellulaire asymétrique (ACD) maintient la tige population de cellules tout en générant de nouveaux types de cellules pour la formation de tissu / organe, il est un mécanisme indispensable pour la promotion de la multicellularité eucaryote. Le développement d' Arabidopsis stomatique a été utilisé comme un système modèle pour l' étude ACD dans les plantes. La cellule précurseur, cellule mère meristemoid, divise asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, un meristemoid (subit souches divisions cellulaires comme avant de se terminer dans une paire de cellules de garde) et une cellule de terre de la lignée stomatique (SLGC) (peut se diviser et se différencier en une cellule de revêtement), respectivement (figure 1). En stomatique ACD, le roman rupture des protéines de Asymétrie dans le Lineage stomatique (de BASL) est polarisé premitotically pour conduire asymétries de la division, qui incasymétrie physique lude et le destin des cellules d'asymétrie 1. Une cascade MAPK composé du MAPKKK YODA et les MAPK, MPK3 et 6 est central pour la division des stomates motifs et sort adoption 2,3, 4,5.
Récemment, Zhang et al. lié à la protéine de polarité BASL à la voie de signalisation MAPK YDA-Arabidopsis stomatique ACD 6. La voie YODA-MAPK canonique, par MPK3 / 6, phosphoryle BASL et active sa polarisation. Fonctions BASL phosphorylés comme un échafaudage et recrute YODA (YDA) et MPK3 / 6 pour former un complexe de protéines et de concentrer la signalisation au niveau du cortex cellulaire 6. Polarisation des composantes de MAPK et de la boucle de rétroaction positive entre BASL et la voie MAPK-YDA représente un nouveau mécanisme pour la protéine de polarisation dans les cellules végétales. Signalisation MAPK localement enrichi est supposé être étroitement liée à la différenciation du destin cellulaire dans stomatique ACD 6 (Figure 1). Un des key données expérimentales qui ont soutenu ce modèle provenaient des essais de tabac qui ont démontré la redistribution spatiale des MAPK induite par l'expression de BASL 6.
D'une manière générale, il est facile de surveiller la signalisation MAPK où se produit parce que les molécules de MAPK ont souvent été trouvés partout à l'intérieur d'une cellule. Dans cette étude, nous avons utilisé le système split-YFP pour visualiser l'interaction entre la kinase en amont et en aval les suggérer où le relais de signalisation se produit. Nous avons également étendu l'utilisation du système BiFC par co-exprimant une troisième protéine (CFP-tagged) avec la paire YFP fendue (suggestive d'interaction protéine-protéine) pour visualiser si et comment le YFP complété pourrait être modulée spatialement par la coopération protéine exprimée PCP. Ce faisant, nous avons démontré que la co-expression de la PCP-BASL induite réorganisation spatiale des interactions entre YDA et MPK6, de même la distribution à la structuration polarisée au niveau du cortex cellulaire de l'épiderme du tabaccellules al. Ce système a donc le potentiel d'être développé pour la surveillance des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales dans des conditions où les cellules sont contestées par les stimuli internes ou externes (par exemple, co-expression d'autres protéines, l' application chimique, pathogène attaque ou changements environnementaux, etc. ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilisation générale et modifications possibles du système d'expression transitoire pour le tabac transduction de signal: surexpression de la protéine fluorescente (FP) -tagged protéines dans l'épiderme du tabac a été utilisé avec succès pour un examen rapide de la protéine localisation subcellulaire dans les cellules végétales. Cependant, l' étude de la distribution de signalisation dynamique du complexe protéique in planta est un su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
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