Abstract
Visualizzazione di eventi di segnalazione dinamici in cellule vive è stata una sfida. Abbiamo ampliato un sistema di espressione transiente stabilito, il biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) test in cellule epidermiche tabacco, dall'interazione test proteina-proteina per monitorare la distribuzione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test BiFC per dimostrare che l'interazione e la segnalazione tra la Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 si verificano a livello della membrana plasmatica. Quando il BASL proteina scaffold è stato co-espresso, l'interazione YODA-MAPK ridistribuita e spazialmente co-polarizzato con CFP-BASL. Questo sistema di espressione del tabacco modificato consente per l'esame rapido di segnalazione di localizzazione e dinamici cambiamenti (meno di 4 giorni) e in grado di ospitare più di colori proteina fluorescente (almeno tre). Abbiamo anche presentato metodi dettagliati per quantificare la distribuzione delle proteine (localizzazione spaziale asimmetrica, o "polarizzazione";) In cellule di tabacco. Questo avanzato sistema di espressione del tabacco ha un potenziale per essere utilizzato ampiamente per il test rapido di eventi di segnalazione dinamici in cellule vegetali dal vivo.
Introduction
Le proteine interagiscono all'interno di un intricato gerarchici complessi di rete e di forma che giocano un ruolo fondamentale in quasi tutti i processi biologici che avvengono in un ambiente cellulare imprevedibile. Tuttavia, dallo sviluppo pianta risposte di crescita, c'è stata una mancanza di strumenti utili che possono non solo rapidamente, ma anche identificare e sorvegliare efficacemente questi eventi di segnalazione dinamici a livello subcellulare.
Il sistema di espressione della proteina transitoria tabacco epidermide foglia è attraente vantaggi per la visualizzazione di proteine fluorescenti nelle cellule viventi. Questo sistema fornisce semi in vivo condizioni che permettono la modifica della proteina post-traslazionale e rapido esame di localizzazione delle proteine. Esaminando il segnale YFP completato, il test biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) informa la possibilità di interazione proteina-proteina nelle cellule vegetali. Rispetto ad altri metodi, ad esempio, il lievito-due ibridi (Y2H) e co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fornisce anche un potente mezzo di visualizzazione comparti in cui possono verificarsi interazioni proteina-proteina a livello subcellulare.
Poiché la divisione cellulare asimmetrica (ACD) mantiene staminali popolazione cellulare durante la generazione di nuovi tipi di cellule per la formazione del tessuto / organo, è un meccanismo indispensabile per promuovere multicellularità eucarioti. Arabidopsis sviluppo degli stomi è stato utilizzato come sistema modello per lo studio ACD nelle piante. La cellula precursore, cellula madre meristemoid, divide in modo asimmetrico per produrre due differenti cellule figlie, una meristemoid (subisce staminali divisioni cellulari come prima di terminare in un paio di cellule di guardia) e una cella stomatica lignaggio terra (SLGC) (può dividersi e differenziarsi in una cella marciapiede), rispettivamente (Figura 1). In stomatal ACD, la rottura nuova proteina di asimmetria nel lignaggio stomatica (BASL) è polarizzato premitotically guidare asimmetrie divisione, che incLude asimmetria fisica e il destino delle cellule asimmetria 1. Una cascata MAPK composto dal MAPKKK Yoda e le MAPKs, MPK3 e 6 è centrale per la divisione degli stomi patterning e l'adozione destino 2,3, 4,5.
Recentemente, Zhang et al. collegato la proteina BASL polarità della via di segnalazione YDA-MAPK in Arabidopsis stomi ACD 6. Il percorso canonico YODA-MAPK, attraverso MPK3 / 6, fosforila BASL e attiva la sua polarizzazione. Funzioni BASL fosforilata da impalcatura e recluta YODA (YDA) e MPK3 / 6 per formare un complesso proteico e concentrano la segnalazione alla corteccia cellulare 6. Polarizzazione dei componenti MAPK e l'anello di retroazione positiva tra BASL e il percorso YDA-MAPK rappresenta un nuovo meccanismo per la polarizzazione delle proteine nelle cellule vegetali. Segnalazione MAPK Localmente arricchita si ipotizza essere strettamente legata alla differenziazione destino della cellula in stomatica ACD 6 (Figura 1). Uno dei key dati sperimentali che ha sostenuto questo modello è venuto dai saggi di tabacco che hanno dimostrato la ridistribuzione spaziale di MAPK indotte mediante l'espressione di BASL 6.
In generale, non è facile controllare dove si verifica segnalazione MAPK perché molecole MAPK erano spesso trovano ovunque all'interno di una cellula. In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema split-YFP per visualizzare l'interazione tra la chinasi monte e quelli a valle di suggerire dove avviene il relè di segnalazione. Abbiamo esteso ulteriormente l'utilizzo del sistema BiFC dal co-esprimendo una terza proteina (PCP-tagged), con la scissione YFP due (suggestiva di interazione proteina-proteina) di visualizzare se e come il YFP integrata potrebbe essere spazialmente modulata dal co espresso proteina CFP. In questo modo, abbiamo dimostrato che la co-espressione di CFP-BASL indotta riorganizzazione spaziale delle interazioni tra YDA e MPK6, da una distribuzione uniforme di patterning polarizzato in corteccia cella del epidermide tabaccocellule al. Questo sistema ha quindi il potenziale per essere sviluppato per il monitoraggio di eventi di segnalazione dinamici in cellule vegetali, in condizioni in cui le cellule sono sfidati dagli stimoli interni o esterni (ad esempio, co-espressione di altre proteine, applicazione di prodotti chimici, di attacco patogeno o cambiamenti ambientali, ecc. ).
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Protocol
1. Costruzione plasmide
- Generare i costrutti di clonazione tecnologia come descritto in precedenza 1,6.
- In primo luogo utilizzare un DNA polimerasi ad alta fedeltà con primer adeguati per amplificare le sequenze codificanti di BASL, YDA e MPK6 e sub-clonare in vettori di ingresso. Trova il protocollo dettagliato in 7.
- Per generare le versioni negative dominanti (rispettivamente 8 e DNmpk6 DNyda 4,) MPK6 e YDA, utilizzare i plasmidi di entrata di MPK6 e YDA come modello e introdurre le mutazioni puntiformi con un metodo mutagenesi sito-9.
- Per costruire i costrutti per saggi transienti tabacco, condurre una serie LR (Attl x attr ricombinazione) reazioni (procedura dettagliata 7) per integrare BASL in pH35CG 10, DNyda e DNmpk6 in pXNGW e pXCGW vettori 11, rispettivamente.
- Confermare i plasmidi risultanti di digestione enzimatica e sequenziamento. Una volta che sUccessful, trasformare i costrutti binari nel Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 12 e farle crescere su piastre di selezione a 28 ° C per 2 - 3 giorni.
2. Preparazione della soluzione Agrobacterium Infiltration
- Seminare alcune colonie di Agrobacterium appena trasformati in 10 ml di Luria-Bertani (LB) media con antibiotici appropriati (Gentamicina 25 mg / ml, Rifamicina 25 mcg / ml, Spectinomicina 100 ug / ml per pH35CG, pXNGW e pXCGW costruisce, le stesse concentrazioni di gentamicina e kanamicina Rifamicina con 50 mg / ml per P19 (che esprimono le proteine contro silenziamento transgenico) 13.
- Grow culture Agrobacterium in C shaker 28 ° alla velocità di 200 rpm per circa 16 ore e quindi misurare la OD 600 (stimato crescere dell'1,5 - 1.8) (Figura 2A-B). Centrifugare le culture a 2.500 xg per 10 min. Risospendere e wash i pellet cellulari con 10 mM di MgCl 2 (la soluzione di infiltrazione).
- Spin giù le culture di nuovo e ri-sospendere i pellet con la quantità appropriata della soluzione di infiltrazione per raggiungere la finale OD 600 = 0,5 (Figura 2C-D). Prima di infiltrazione piante, lasciare le miscele di cella a temperatura ambiente per 1-3 ore. Questo passaggio consente di mantenere l'omeostasi cellulare.
3. Impianto di tabacco e Foglia Iniezione
- Utilizzare le piante di tabacco (Nicotiana benthamiana), cresciuti 4-5 settimane di età in una camera di crescita delle piante standard (23 ° C con cicli di 16 ore-luce / 8 ore buio) 14 per l'iniezione foglia.
Nota: In questa fase, le piante di tabacco in genere hanno 6 foglie (2 grandi, 2 medie e 2 piccole). Le due foglie medie sono il più ottimale per l'iniezione del foglio (i due grandi sono troppo vecchi, mentre i due piccoli sono spesso troppo giovane). - Prima del giorno di infiltrazione, innaffiare il Tobacpiante co per saturare il terreno.
- Il giorno infiltrazione, pre-incubare le piante al buio per 1 - 3 ore. Questa fase consente stomi nell'epidermide per aprire ampiamente, che facilita notevolmente l'Agrobacterium quando penetra nelle cellule epidermiche foglia.
- Usando nastri di colore etichettate con date, bandiera le foglie di essere infiltrati. Selezionare le aree da infiltrati con un pennarello nero spesso (facoltativo; le zone infiltrate sono visibili dopo l'infezione.).
- Prendere volumi uguali di Agrobacterium risospensione e mescolarli in un 100 x 15 mm Petri delicatamente vorticoso (Figura 2E). Nota: Nel nostro caso, abbiamo mescolato 1 ml di p19 con 1 ml di CFP-BASL, 1 ml di DNyda-nYFP e 1 ml di DNmpk-cYFP.
- Nel processo di infiltrazione, riempire una siringa da 3 ml di ago con la miscela infiltrazione (1 - 2 ml) e spingere sul lato inferiore (abaxial) della foglia di tabacco (Figura 2F). Mentre infiltrazione, è utilead usare una mano per spingere e l'altra mano per sostenere delicatamente il lato superiore (adaxial, contro la forza di spinta).
Nota: Una volta che la miscela di infiltrazione viene iniettato con successo, le zone infette saranno facilmente riconoscibili nell'epidermide. Tuttavia, l'infiltrazione potrebbe non riuscire a causa di iniezione dura (danni ai tessuti) o spinta insufficiente (nessuna penetrazione liquido). Per ogni test, si consiglia almeno due iniezioni in due foglie indipendenti (da piante diverse). - Posizionare le piante infette di nuovo nella camera di crescita. In generale, le espressioni di proteine sono rilevabili dopo 48 ore dopo l'infiltrazione.
4. confocale Imaging
- A 48 ore dopo l'infiltrazione, usare una perforatrice per asportare un disco foglia dalla zona di iniezione (normalmente 3 - 4 dischi / zona possono essere prodotte) (Figura 2G). Utilizzare le pinzette per trasferire delicatamente i dischi di foglie di una diapositiva (il lato abaxial verso l'alto) e montare loro con gocce d'acqua. Evitare di premere troppo harD sul vetrino perché spremuti / cellule danneggiate non mostrerà ben al microscopio confocale (Figura 2H).
- Prima confocale, la scansione dei campioni montati su un microscopio composto epi-fluorescenza per controllare i livelli di espressione. Nota: In base alla nostra esperienza, le cellule che mostrano livelli di espressione intermedi sono meglio rappresentati al microscopio confocale.
- Inizia con la (1.3 NA) obiettivo 40X su un microscopio confocale. Regolare la slitta nella posizione desiderata in modo che le cellule che esprimono livelli medi di proteina fluorescente rimangono al centro. Gli spettri di eccitazione / emissione per PCP e YFP sono 458 nm / 480-500 nm e 514 nm / 520-540 nm, rispettivamente.
- Attivare il pulsante "Live" per visualizzare in anteprima le immagini quindi regolare l'intensità del laser e intelligente guadagno per il rapporto di fluorescenza intensità / rumore più equilibrata. Per migliorare la qualità delle immagini, aumentare pixel scansione e / o medio cornice / linea. Infine, regolare la manopola di messa a fuoco a reach il piano focale mediana e fare clic su "Capture" per acquisire l'immagine.
Nota: La PCP e le immagini YFP possono essere catturate in sequenza o simultaneamente controllando o disattivare l'opzione di modalità di scansione "sequenziale", rispettivamente. - Quando Z-proiezione è desiderato per la visualizzazione in profondità delle celle, selezionare la modalità di imaging "xyz", definire la profondità della portata di scansione (10 - 15 micron) e raccogliere le immagini dalla cima al fondo della cellula bersaglio . Compilare le immagini ottenute con il software Leica facendo clic destro sul file di immagine per selezionare "rinomina" e esportare le immagini come file TIFF.
- Immagine 30 - 40 cellule per l'analisi di quantificazione.
Processing 5. Immagine e analisi Quantificazione
- Utilizzare il software Fiji (http://fiji.sc/Fiji) per elaborare le immagini e condurre la quantificazione.
- Tracciare i grafici di intensità di fluorescenza.
- Per visualizzare meglio se l'espressione CFP / YFP èuniformemente distribuito, usare Fiji per dimostrare la forza della PCP e YFP segnale lungo la periferia delle cellule. Per raggiungere questo obiettivo, primo lancio Fiji quindi selezionare "File" e "Open" per avviare l'immagine. Fai clic su "linea" nel menu degli strumenti e selezionare "linea segmentata" facendo clic destro. Decidere la regione di interesse e tracciare una linea lungo la periferia cellulare per rintracciare il PCP o il segnale YFP (figura 3A-C).
Nota: Fiji misura il valore assoluto intensità di fluorescenza lungo le linee segmentate. - Selezionare il menu a discesa "Analizza" e "profilo di stampa" per generare un grafico con valori di posizione e l'intensità che rappresentano i livelli di CFP / YFP lungo la linea segmentata. Se lo si desidera, duplicare i valori di intensità (selezionando il menu "Copia") in Excel o altri software di grafica per generare grafici di intensità paragonabile.
- Per visualizzare meglio se l'espressione CFP / YFP èuniformemente distribuito, usare Fiji per dimostrare la forza della PCP e YFP segnale lungo la periferia delle cellule. Per raggiungere questo obiettivo, primo lancio Fiji quindi selezionare "File" e "Open" per avviare l'immagine. Fai clic su "linea" nel menu degli strumenti e selezionare "linea segmentata" facendo clic destro. Decidere la regione di interesse e tracciare una linea lungo la periferia cellulare per rintracciare il PCP o il segnale YFP (figura 3A-C).
- Quantificare grado di polarità.
- Raccogliere circa 20 rapprecellule tativi da 3 esperimenti replicati per valutare il grado di polarità della PCP e YFP in cellule di tabacco. Calcolare il grado di polarità sulla base del rapporto tra l'intensità di fluorescenza (definita come H) sull'intensità di fluorescenza bassa (definita come L). Nota: Il metodo di quantificazione è spiegato nella figura 3.
- Per misurare i valori di H e L, tracciare una linea segmentata lungo la regione interessata alla periferia delle cellule (sopra descritto), fare clic su "Analizza" dal menu a discesa, quindi selezionare "Measure". Quando una finestra "Risultati" si apre, usare "Mean" valori per eseguire quantificazione.
- Dalle cellule che mostrano espressione relativamente uniforme della PCP e YFP, ad esempio, CFP-BASL (figura 3A) o YFP completati dal co-espressione di DNyda-nYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3B), ottenere i valori di H e L, misurando due segmenti selezionati in modo casuale periferiche con uguale lunghezza. <li> Dalle cellule espositrici evidente accumulo polare di proteine fluorescenti, in questo caso, la co-espressione di CFP-BASL, DNyda-nYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3C), raccoglie i valori di H delle regioni periferiche con i segnali di fluorescenza arricchiti e le LS da regioni con nessun accumulo bassa / fluorescenza.
- Pool i rapporti risultanti di H / L da 20 celle insieme e di prova per la distribuzione normale. Calcolare i valori di p per il test t di Student (per la distribuzione normale) o il test di Kolmogorov-Smirnov (KS) (per la distribuzione non normale).
- Raccogliere circa 20 rapprecellule tativi da 3 esperimenti replicati per valutare il grado di polarità della PCP e YFP in cellule di tabacco. Calcolare il grado di polarità sulla base del rapporto tra l'intensità di fluorescenza (definita come H) sull'intensità di fluorescenza bassa (definita come L). Nota: Il metodo di quantificazione è spiegato nella figura 3.
- Tracciare i grafici di intensità di fluorescenza.
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Representative Results
Per prevenire la morte cellulare indotta dalla segnalazione MAPK iperattivo, le chinasi versioni inattive di YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) sono stati utilizzati nel saggio di co-espressione in cellule di tabacco. Né l'interazione tra DNyda e DNmpk6 rivelato da BiFC né CFP-BASL stesso generato modello di distribuzione non uniforme (Figura 3A-B). Tuttavia, quando CFP-BASL stato introdotto nella coppia interazione DNyda-DNmpk6, sia CFP e YFP segnali sono stati ridistribuiti a modo altamente polarizzata (Figura 3C). Questo suggerisce che la redistribuzione BASL interagisce con YDA e MPK6 a spazialmente riorganizzare il percorso di segnalazione MAPK nelle cellule vegetali. Lo stato di fosforilazione di BASL ha impatti differenziali sul grado polarità della segnalazione MAPK: una versione di fosfo-mimando di BASL generato molto forte polarità, mentre una versione di fosfo-carente ha mostrato l'attività più debole 6. Questi dati supportate nostro modello di lavoro di un regolazione a feedback positivo tra BASL e il percorso YDA-MAPK nel generare polarità delle cellule 6.
Figura 1. Schema della polarità Complesso BASL-YDA-MPK6 Durante stomatica asimmetrica Divisione cellulare (ACD) in Arabidopsis. Negli epidermide foglia, il linage stomi inizia dalle cellule protodermal, che si espandono a diventare cellule precursori ACD, le cellule Meristemoid Madre (MMC). Una MMC subisce un ACD per creare uno Meristemoid e uno SLGC (stomi delle cellule lignaggio terra), che possono dividersi e infine differenziarsi in cellule di guardia stomi e cellule pavimentazione, rispettivamente. Al corteccia cellulare delle cellule precursori ACD (MMC), BASL recluta due componenti di una via MAPK, la MAPKKK YDA e la MAPK MPK6, per formare un complesso di polarità e regolano stomi ACD.om / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema della procedura di iniezione di tabacco in foglia dell'epidermide. (A) Trasformare i plasmidi che ospitano CFP-BASL, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP e P19 in Agrobacterium tumefaciens GV3101 e li crescono su rispettive piastre di selezione (dall'alto verso il basso in UN). (B) Pick up colonie da (A) per inoculare coltura liquida per la crescita durante la notte. Cellule (C) Harvest di filatura e decantare il surnatante. Dopo pipettaggio brevemente e lavare il pellet, centrifugare le cellule di nuovo. (D) Risospendere e diluire i pellet cellulari con la soluzione di infiltrazione (si veda il protocollo) per ottenere il diametro esterno finale 600 = 0,5. (E) Mescolare delicatamente °cellule e risospese in una capsula di Petri. (F) Utilizzare una siringa senza ago per spingere la miscela infiltrazione nel lato abassiale delle foglie di tabacco. (G) Circa 48 ore dopo l'infiltrazione, le foglie sono pronti per l'imaging confocale. dischetti di foglie Excise contenenti infettato le cellule con una perforatrice intorno alla regione di infiltrazione. cerchi tratteggiate indicano asportati dischi congedo. (H) Usare acqua per montare i dischi di foglie su un vetrino standard per l'imaging confocale. I diagrammi casella nella zona ombreggiata descrivono le proteine iniettate in foglie di tabacco per i test di polarizzazione. Dimensioni proteine non sono in scala. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Visualizzazione e quantificazione della Formazione polarità. (AC) confocale per mostrare PCP e YFP fluorescenza in cellule epidermiche tabacco. Ciano indica l'espressione della PCP. Il giallo indica l'espressione di YFP. (A) sovraespressione di sola CFP-BASL. (B) La co-espressione di DNyda-nYFP e DNmpk6-cYFP. L'espressione YFP è completata quando due proteine interagiscono. (C) Co-espressione di CFP-BASL, DNyda-nYFP e DNmpk6-cYFP. Distribuzione non uniforme (polarità) è evidente sia per la PCP e YFP. Barra di scala = 50 micron di (AC). (DF) Graficamente riportando l'intensità di fluorescenza CFP / YFP lungo le linee tratteggiate (magenta) a (AC). triangoli Magenta segnano il punto di inizio e fine delle regioni utilizzate per la stampa intensità. Quantificazioni del grado di polarità in cellule di tabacco sono presentati sotto. I valori di intensità di fluorescenza (H per alta e L per bassa) sono misurati e raccolti da Fiji dalle regioni tracciate con da rossocapannone linee in (AC). Per ogni campione, i valori da 20 celle viene calcolata la media per il test significato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Uso generale e possibili modifiche del sistema di espressione transitoria Tabacco per trasduzione del segnale: sovraespressione di proteina fluorescente (FP) -tagged proteine dell'epidermide tabacco è stato utilizzato con successo per l'esame veloce di proteine localizzazione subcellulare in cellule vegetali. Tuttavia, studiando la distribuzione di segnalazione dinamica del complesso proteico in Planta è un argomento difficile a causa di contesti subcellulari complicate, interazione proteina-proteina transitoria ed eventi di trasduzione del segnale. Per affrontare questa sfida, abbiamo approfittato del sistema BiFC per esaminare MAPK eventi di segnalazione. In co-esprimono YDA-nYFP e MPK6-cYFP, il segnale YFP recuperato indicato che l'attivazione del relè di segnalazione MAPK potrebbe verificarsi a livello della membrana plasmatica.
L'ideale sarebbe di co-express fluorescente contrassegnati YDA e MPK6 in Arabidopsis e per esaminare la segnalazione MAPK dinamica in vivo. Tuttavia, generating piante transgeniche richiede tempo, soprattutto quando più costrutti è desiderato. Protein espressione transiente in cellule di tabacco può essere una prova preliminare rapida per l'espressione in vivo in Arabidopsis o di altre piante. L'altro vantaggio che il sistema di espressione transiente tabacco offre, ma non può essere facilmente raggiunto generando piante transgeniche, è che le proteine fino a 4 o 5 di fusione possono essere co-espressi simultaneamente ed esaminate al microscopio confocale quando la combinazione è realizzabile.
Utilizzando cellule epidermiche tabacco per indagare segnalazione MAPK nelle cellule vegetali può essere ulteriormente implementato per altre vie di segnalazione e in diverse condizioni ambientali. Ad esempio, sarebbe l'interazione di YDA-MAPK cambiare la sua intensità o posizione quando la cellula che esprime è trattato con H 2 O locale 2 applicazione (una segnalazione stimolo MAPK)? Tali test possono essere rapidamente progettati e effettuati per affrontare specifichedomande IFIC. i membri multipli esistono in ogni livello delle cassette MAPK (3 - 4 file in generale), ma come segnalazione specificità è raggiunto in piante o altri sistemi rimangono in gran parte sconosciuti. Facendo diverse combinazioni di MAPKKKs con MAPKKs o MAPKKs con MAPK, il sistema di espressione transiente tabacco permette un'analisi relativamente grande scala di interazione non solo proteina-proteina, ma anche l'organizzazione spaziale del flusso di segnalazione nelle cellule vegetali.
Personalizzato Co-espressione e BiFC test per lo studio di proteine Polarizzazione: Una lunga questione fondamentale nella biologia delle cellule è come vie di segnalazione universali, ad esempio, MAPKs, raggiungono la loro specificità ad una certa fase di sviluppo o in particolari condizioni ambientali. Co-espressione della proteina BASL polarità con i componenti BiFC di YDA e MPK6 in cellule di tabacco ci ha permesso di dimostrare che l'interazione YDA-MAPK e segnalazione è spazialmente re-distributed dalla presenza di BASL, una specifica proteine polarità durante stomatal ACD. Pertanto, la specificità segnalazione YDA-MAPK può essere ottenuto mediante l'interazione con BASL promuovere polarità cellulare e divisione asimmetrica.
Anche se non è un fenomeno universale, un bel paio di proteine sono stati trovati ad essere distribuiti in modo non uniforme nelle cellule vegetali, ad esempio, piccole GTPasi POR 15, proteine auxina effluxer pin 16 e le autorità di regolamentazione 17, trasportatori boro 18 e alcune proteine sconosciute (Octopus 19 , POLAR 20, e BRX 21). Questo protocollo non era destinato a cercare i partner genetiche o fisici in un percorso di polarizzazione particolare proteina, ma sarà probabilmente utile per testare se le proteine che interagiscono con POR, PIN o altre persone possono formare un complesso di polarità nelle cellule vegetali. Tuttavia, quando si cerca di simulare un evento di polarizzazione utilizzando cellule di tabacco, si dovrebbe tenere a mente che le complicanzepossono verificarsi nei saggi. Ad esempio, l'evento Arabidopsis polarizzazione non può essere riassunta in cellule di tabacco, in particolare quando altre componenti sono necessari quello che può essere alloggiata nel saggio. Alcune molecole sconosciute derivate dallo sfondo tabacco, non necessariamente le proteine in esame, possono essere coinvolti nell'indurre un evento di polarizzazione. Pertanto, è essenziale impostare rigorosi esperimenti di controllo in tabacco e per convalidare i dati in Arabidopsis o di altre piante.
Elementi chiave per avere successo negli esperimenti: in primo luogo, le piante di tabacco verdi e sani dovrebbe essere usato. Dal momento che la quantificazione analizza bisogno di mettere in comune i dati da varie cellule, è fondamentale utilizzare fiorente piante di tabacco con le cellule sane in modo coerente. In secondo luogo, le cellule che esprimono livelli proteici terreno deve essere utilizzato per l'imaging confocale. Bassi livelli di espressione non possono fornire le proteine sufficienti per il dosaggio e saturo espressione lEvels avrebbero mascherare l'effetto di polarizzazione / traslocazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
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