Abstract
Visualisierung von dynamischen Signalereignisse in lebenden Zellen war eine Herausforderung. Wir erweiterten einen etablierten transienten Expressionssystem, wobei das biomolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Test in Tabak Epidermiszellen von Test Protein-Protein-Wechselwirkung, um die Überwachung der räumlichen Verteilung der Signaltransduktion in Pflanzenzellen. In diesem Protokoll verwendeten wir den BiFC Assay zeigen , dass die Wechselwirkung und die Signalisierung zwischen dem Arabidopsis MAPKKK YODA und MAPK6 an der Plasmamembran auftreten. Wenn das Gerüstprotein BASL wurde co-exprimiert, neu verteilt die YODA-MAPK-Interaktion und räumlich kopolarisierte mit GFP-BASL. Dieses modifizierte Tabakexpressionssystem ermöglicht eine schnelle Prüfung von Signal Lokalisierung und dynamischen Veränderungen (weniger als 4 Tage) und kann mehrere von fluoreszierenden Protein Farben (mindestens drei) aufzunehmen. Wir stellten auch detaillierte Methoden Proteinverteilung (asymmetrische räumliche Lokalisierung oder "Polarisierung" zu quantifizieren;) In Tabakzellen. Diese fortschrittliche Tabak-Expressionssystem hat ein Potenzial weit für einen schnellen Test der dynamischen Signalereignisse in lebenden Pflanzenzellen verwendet werden.
Introduction
Proteine interagieren innerhalb eines verwickelten hierarchischen Netzwerk und bilden Komplexe, die eine zentrale Rolle in nahezu allen biologischen Prozessen in einer unvorhersehbaren zellulären Umgebung auftreten. Doch von der Entwicklung von Pflanzen Wachstumsreaktionen, hat es einen Mangel an praktischen Tools gewesen, die nicht nur schnell, sondern auch effizient zu identifizieren und diese dynamischen Signalereignisse auf subzellulärer Ebene überwachen.
Die transiente Protein-Expressionssystem in Tabak Blattepidermis aufweist ansprechende Vorteile zur Visualisierung fluoreszierende Proteine in lebenden Zellen. Dieses System bietet halb- in - vivo - Bedingungen , die post-translationalen Lokalisierung Proteinmodifikation und schnelle Untersuchung von Protein ermöglichen. Durch die Untersuchung informiert den ergänzt YFP-Signal, die bimolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Assay die Möglichkeit von Protein-Protein-Wechselwirkung in Pflanzenzellen. Im Vergleich zu anderen Methoden, beispielsweise Hefe-Zwei - Hybrid (Y2H) und co-immunoprecipitation (Co-IP), BIFC stellt auch ein mächtiges Mittel von Fächern zu visualisieren, wo Protein-Protein-Interaktionen auf subzellulärer Ebene auftreten können.
Weil asymmetrische Zellteilung (ACD) Stammzellenpopulation beibehält , während neue Zelltypen für Gewebe- / Organbildung zu erzeugen, ist es ein unverzichtbarer Mechanismus für eukaryotische Vielzelligkeit fördern. Arabidopsis stomatal Entwicklung als Modellsystem verwendet wurde , für die Untersuchung ACD in Pflanzen. Die Vorläuferzelle, meristemoid Mutterzelle teilt sich asymmetrisch zwei verschiedene Tochterzellen zu erzeugen, eine meristemoid (erfährt zellähnliche Divisionen stammen, bevor sie in ein Paar von Schließzellen beendet) und einer Stomata Linie Grundzelle (SLGC) (dividieren kann und differenzieren sich in eine Fahrbahn Zelle), bzw. (Abbildung 1). In Stomata ACD wird das neue Protein Breaking of Asymmetry in der Stomata Lineage (BASL) polarisiert premitotically Division Asymmetrien zu fahren, die include physische Asymmetrie und Zellschicksal Asymmetrie 1. Eine MAPK Kaskade , bestehend aus dem MAPKKK YODA und den MAPK, MPK3 und 6 ist von zentraler Bedeutung für die Stomata Division Strukturierung und Schicksal Annahme 2,3, 4,5.
Vor kurzem Zhang et al. die Polarität Protein BASL zur YDA-MAPK - Signalweg in Arabidopsis Stomata ACD 6 verbunden. Die kanonische YODA-MAPK-Weg, durch MPK3 / 6, phosphoryliert BASL und aktiviert seine Polarisation. Phosphoryliert BASL Funktionen als Gerüst und rekrutiert YODA (YDA) und MPK3 / 6 einen Proteinkomplex zu bilden , und die Signalisierung an der Zell cortex 6 konzentrieren. Polarisierung der MAPK-Komponenten und die positive Rückkopplungsschleife zwischen BASL und dem YDA-MAPK-Weg stellt einen neuen Mechanismus für die Protein Polarisierung in Pflanzenzellen. Vor Ort angereicherte MAPK - Signalisierung wird vermutet , eng mit Zellschicksal Differenzierung in Stomata ACD 6 (Abbildung 1) zu werden. Einer der key experimentellen Daten , die dieses Modell unterstützt kamen aus den Tabak Assays , die die räumliche Umverteilung von MAPKs durch die Expression von BASL 6 induziert demonstriert.
Im allgemeinen ist es nicht leicht zu überwachen, wo MAPK Signalisierung tritt auf, weil MAPK Moleküle oft überall innerhalb einer Zelle gefunden wurden. In dieser Studie verwendeten wir die Split-YFP System die Wechselwirkung zwischen der stromaufwärts-Kinase und den stromabwärtigen visualisieren vorzuschlagen, wo die Melderelais auftritt. Wir verlängert weiter die Verwendung des BiFC System durch Co-Exprimieren eines dritten Protein (CFP-tagged) mit dem geteilten YFP Paar (suggestiv von Protein-Protein-Wechselwirkung) sichtbar zu machen, ob und wie die ergänzt YFP räumlich durch die co- moduliert werden könnten ausgedrückt GFP-Protein. Auf diese Weise haben wir gezeigt, dass die gleichzeitige Expression von GFP-BASL induzierte räumliche Reorganisation von Wechselwirkungen zwischen YDA und MPK6, aus gleichmäßige Verteilung zu polarisierte Strukturierung an der Zellrinde des Tabak epidermal Zellen. Dieses System hat daher das Potential , zur Überwachung dynamischer Signalereignisse in Pflanzenzellen unter Bedingungen entwickelt werden , wenn die Zellen durch die internen oder externen Stimuli (zB Co-Expression von anderen Proteinen, chemischen Anwendung Pathogenbefall oder Umgebungsänderungen herausgefordert werden, etc. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmidkonstruktion
- Generieren Sie die Konstrukte durch Technologie Klonen wie zuvor 1,6 beschrieben.
- Verwenden Sie zuerst eine High Fidelity DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primer die kodierenden Sequenzen von BASL zu verstärken, YDA und MPK6 und Unter klonen sie in Eintrag Vektoren. Hier finden Sie die ausführliche Protokoll in 7.
- Um die dominant negative Versionen von MPK6 und YDA erzeugen (DNmpk6 8 und DNyda bzw. 4), verwenden Sie den Eintrag Plasmide von MPK6 und YDA als Matrize und einzuführen , um die Punktmutationen durch eine ortsgerichtete Mutagenese - Methode 9.
- Um die Konstrukte für Tabak transienten Assays bauen, führen Standard LR (attL x attR- Rekombination) Reaktionen (detailliertes Verfahren in 7) BASL in pH35CG zu integrieren 10, DNyda und DNmpk6 in pXNGW und pXCGW Vektoren 11.
- Bestätigen Sie die resultierenden Plasmide durch Enzym-Verdauung und Sequenzierung. Sobald successful, verwandeln die binären Konstrukte in die Agrobacterium - Stamm tumefaciens GV3101 12 und wachsen sie auf Selektionsplatten bei 28 ° C für 2 - 3 Tage.
2. Herstellung der Agrobacterium Infiltrationslösung
- Beimpfen einige frisch transformierten Agrobacterium - Kolonien in 10 ml Luria-Bertani (LB) Medium mit geeigneten Antibiotika (Gentamycin 25 ug / ml, Rifamycin 25 ug / ml, Spectinomycin 100 ug / ml für pH35CG, pXNGW und pXCGW Konstrukten, die gleichen Konzentrationen Gentamycin und Rifamycin mit Kanamycin 50 ug / ml für P19 (Proteine gegen transgenen Silencing exprimieren) 13.
- Wachsen Agrobacterium - Kulturen in einem 28ºC - Schüttler mit der Geschwindigkeit von 200 Upm für etwa 16 h und messen dann die OD 600 (geschätzt zu erreichen 1,5-1,8) (2A-B). Spin down die Kulturen bei 2.500 × g für 10 min. Re-suspendieren und wash der Zellpellets mit 10 mM MgCl 2 (die Infiltrationslösung).
- Spin down die Kulturen wieder und wieder aussetzen , die Pellets mit einer geeigneten Menge des Infiltrationslösung , die die endgültige OD 600 = 0,5 (2C-D) zu erreichen. Vor dem Pflanzen zu infiltrieren, lassen Sie die Zellmischungen bei Raumtemperatur mit 1 - 3 Stunden. Dieser Schritt hilft Zellhomöostase zu halten.
3. Tabakpflanze Blatt Injection
- Verwenden Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) gewachsen 4 - 5 Wochen alten in einem Standard - Pflanzenwachstumskammer (23 ° C mit Zyklen von 16 Stunden Licht / 8 h-dunkel) 14 für Blatt Injektion.
Anmerkung: In diesem Stadium Tabakpflanzen weisen in der Regel 6 Blätter (2 groß, 2 mittel und 2 klein). Die beiden mittelgroßen Blätter sind die optimal für die Blatt Injektion (die beiden Großen zu alt sind, während die beiden Kleinen oft zu jung sind). - Vor der Infiltration Tag, Wasser, um die tobacco Pflanzen, den Boden zu sättigen.
- Auf der Infiltration Tag, Inkubation vorge die Pflanzen im Dunkeln mit 1 - 3 Stunden. Dieser Schritt ermöglicht Stomata in der Epidermis weit zu öffnen, die groß die Agrobacterium erleichtert , wenn sie in den Blatt epidermalen Zellen eindringen.
- Mit Farbbändern mit Daten gekennzeichnet, Fahne, um die Blätter infiltriert werden. (; Die infiltrierten Bereiche sichtbar sind nach infiziert optional.) Markieren Sie die Bereiche mit einem schwarzen dicken Sharpie zu infiltriert.
- Nehmen Sie gleiche Volumina der Agrobacterium Resuspension und mischen sie in einem 100 x 15 mm Petrischale unter leichtem Schwenken (Abbildung 2E). Hinweis: In unserem Fall vermischt man 1 ml p19 mit 1 ml GFP-BASL, 1 ml DNyda-NYFP und 1 ml DNmpk-cYFP.
- Im Prozess der Infiltration, eine 3 ml Spritze ohne Nadel mit dem Infiltrationsmischung füllen (1 - 2 ml) und schieben Sie in die Unterseite (abaxial) des Tabakblattes (2F). Während infiltrieren, ist es hilfreich,einer Hand zu bedienen zu schieben und die andere Hand sanft die Oberseite (adaxial, gegen die Schubkraft) zu unterstützen.
Hinweis: Sobald die Infiltration Mischung erfolgreich injiziert wird, werden die infizierten Gebieten in der Epidermis leicht erkennbar werden. Jedoch kann die Infiltration nicht aufgrund der rauen Injektion (Gewebeschaden) oder unzureichende push (kein Eindringen von Flüssigkeiten). Für jeden Test schlagen wir mindestens zwei Einspritzungen in zwei unabhängige Blätter (von verschiedenen Pflanzen). - Legen Sie die infizierten Pflanzen wieder in die Wachstumskammer. Im Allgemeinen Proteinexpression nachweisbar sind nach 48 h folgende Infiltration.
4. Die konfokale Imaging
- Bei 48 Stunden nach der Infiltration, verwenden Sie ein Loch Puncher eine Blattscheibe aus dem injizierten Bereich auszuschneiden ( in der Regel 3 bis 4 Scheiben / Bereich erzeugt werden kann) (2G). Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Blattscheiben auf einen Objektträger übertragen (die abaxial Seite nach oben) und montieren sie mit Wassertropfen. Vermeiden Sie drücken zu hard auf dem Deckglas , weil gequetscht / geschädigten Zellen nicht gut zeigen unter dem konfokalen Mikroskop (Abbildung 2H).
- Bevor die konfokale Abbildung, scannen die montierten Proben auf einer Epi-Fluoreszenz-Mikroskop Verbindung die Expressionsniveaus zu überprüfen. Hinweis: Basierend auf unserer Erfahrung, die Zellen, die Zwischenexpressionsniveaus zeigen, werden am besten unter dem konfokalen Mikroskop dargestellt.
- Beginnen Sie mit dem 40X (NA 1.3) Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop. Stellen Sie die Folie in die gewünschte Position, so dass die Zellen mittlerer Ebenen fluoreszierendem Protein verbleiben im Zentrum ausdrückt. Die Anregungs- / Emissionsspektren für CFP und YFP sind 458 nm / 480-500 nm und 514 nm / 520-540 nm.
- Aktivieren Sie die "Live", um die Bilder dann in der Vorschau Laserintensität und intelligente Verstärkung für die ausgewogenste Fluoreszenzintensität / Rausch-Verhältnis einzustellen. Bildqualität, erhöhen Scan Pixel und / oder Rahmen / Linie Durchschnitt zu verbessern. Schließlich stellen Sie den Fokussierknopf zu reach die mittlere Fokusebene und klicken Sie auf "Aufnahme", um das Bild zu nehmen.
Hinweis: Die GFP und YFP Bilder können nacheinander oder gleichzeitig auf oder von der Option durch die Überprüfung von "sequential" Scan-Modus erfasst werden, respectively. - Wenn Z-Projektion für die in tiefen Einblick in die Zellen gewünscht, wählen Sie "xyz" Bildgebungsmodus definieren die Tiefe des Scanbereich (10 bis 15 & mgr; m) und die Bilder von oben nach unten der Zielzelle sammeln . Stellen Sie die erhaltenen Bilder mit der Leica Software mit der rechten Maustaste auf die Bilddatei "Umbenennen" und Export von Bildern als TIFF-Dateien auszuwählen.
- Bild 30 - 40 Zellen für die Quantifizierungsanalyse.
5. Bildverarbeitung und Quantifizierung Analyse
- Verwenden Sie Fidschi-Software (http://fiji.sc/Fiji) Bilder zu verarbeiten und die Quantifizierung durchzuführen.
- Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität Graphen.
- Um noch besser zu visualisieren, ob die CFP / YFP Ausdruckgleichmäßig verteilt, verwenden Fiji die Signalstärke von CFP und YFP entlang der Zellperipherie zu demonstrieren. Um dies zu erreichen, starten Sie zuerst Fidschi wählen Sie dann "Datei" und "Öffnen", um das Bild zu starten. Klicken Sie auf "Linie" auf dem Werkzeugmenü und wählen Sie "Segmented line" mit einem rechten Mausklick. Entscheiden Sie, die Region von Interesse und eine Linie entlang der Zellperipherie ziehen die GFP oder YFP - Signal (3A-C) zu verfolgen.
Hinweis: Fidschi misst die absolute Fluoreszenzintensität Wert entlang der segmentierten Linien. - Wählen Sie das Dropdown-Menü "Analysieren" und "Plot-Profil", um eine Grafik mit Position und Intensitätswerte erzeugen, die die Ebenen von CFP / YFP entlang der segmentierten Linie darstellen. Falls gewünscht, zu vervielfältigen, die Intensitätswerte (über das Menü "Kopieren" auswählen) in EXCEL oder andere Grafik-Software vergleichbarer Intensität Graphen zu erzeugen.
- Um noch besser zu visualisieren, ob die CFP / YFP Ausdruckgleichmäßig verteilt, verwenden Fiji die Signalstärke von CFP und YFP entlang der Zellperipherie zu demonstrieren. Um dies zu erreichen, starten Sie zuerst Fidschi wählen Sie dann "Datei" und "Öffnen", um das Bild zu starten. Klicken Sie auf "Linie" auf dem Werkzeugmenü und wählen Sie "Segmented line" mit einem rechten Mausklick. Entscheiden Sie, die Region von Interesse und eine Linie entlang der Zellperipherie ziehen die GFP oder YFP - Signal (3A-C) zu verfolgen.
- Quantifizieren Polarität Grad.
- Sammeln Sie ca. 20 Vertretive Zellen von 3 Wiederholungsversuchen die Polarität Grad der CFP und YFP in Tabakzellen zu bewerten. Berechnen der Polaritätsgrad basierend auf dem Verhältnis der hohen Fluoreszenzintensität (definiert als H) über die niedrige Fluoreszenzintensität (als L definiert ist). Hinweis: Das Quantifizierungsverfahren ist in 3 erläutert.
- Um die H- und L-Werte zu messen, eine segmentierte Linie entlang der interessierten Region an der Zellperipherie ziehen (wie oben beschrieben), klicken Sie auf "Analyze" aus dem Drop-Down-Menü, und wählen Sie dann "Messen". Wenn ein Fenster "Ergebnisse" erscheint, verwenden "Mean" Werte Quantifizierung durchzuführen.
- Aus den Zellen eine relativ gleichmäßige Expression von GFP und YFP, zB GFP-BASL (3A) oder die YFP ergänzt von Co-Expression von DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP (3B), erhalten die H- und L - Werte Anzeige von Mess zwei zufällig periphere Segmente mit gleicher Länge ausgewählt. <li> Aus den Zellen offensichtlich polare Ansammlung von fluoreszierenden Proteinen aufweisen, in diesem Fall ist die Co-Expression von GFP-BASL, DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP (3C), sammeln Sie die H - Werte aus den peripheren Regionen mit angereichertem Fluoreszenzsignale und die Ls aus den Regionen mit niedriger / kein Fluoreszenz Akkumulation.
- Pool die sich ergebenden Verhältnisse von H / L aus 20 Zellen zusammen und Test auf Normalverteilung. Berechne die p - Werte durch den T - Test nach Student (für Normalverteilung) , oder die Kolmogorov-Smirnov (KS) Test (für Nicht-Normalverteilung).
- Sammeln Sie ca. 20 Vertretive Zellen von 3 Wiederholungsversuchen die Polarität Grad der CFP und YFP in Tabakzellen zu bewerten. Berechnen der Polaritätsgrad basierend auf dem Verhältnis der hohen Fluoreszenzintensität (definiert als H) über die niedrige Fluoreszenzintensität (als L definiert ist). Hinweis: Das Quantifizierungsverfahren ist in 3 erläutert.
- Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität Graphen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um zu verhindern, induzierten Zelltod durch die hyperaktiv MAPK-Signalisierung, die Kinase-inaktiver Versionen YDA (DNyda) und MPK6 (DNmpk6) wurden in der Coexpression Assay in Tabakzellen verwendet. Weder die Interaktion zwischen DNyda und DNmpk6 enthüllt durch BIFC noch GFP-BASL selbst erzeugt ungleichmäßige Verteilung Muster (3A-B). Wenn jedoch GFP-BASL in die DNyda-DNmpk6 Wechselwirkungspaar eingeführt wurde, sowohl CFP und YFP - Signale wurden auf einer stark polarisierten Weise neu verteilt (Abbildung 3C). Diese Umverteilung legt nahe, dass BASL interagiert mit YDA und MPK6, um den MAPK-Signalweg in Pflanzenzellen räumlich neu zu organisieren. Die Phosphorylierung von BASL hat unterschiedliche Auswirkungen auf die Polarität Grad des MAPK - Signal: eine Phospho-nachahmt Version von BASL sehr starke Polarität erzeugt, während ein Phospho-defizienten Version 6 schwächere Aktivität zeigte. Diese Daten unterstützt unsere Arbeitsmodell ein positive Feedback - Regulation zwischen BASL und dem YDA-MAPK - Weg in 6 - Zellen - Polarität zu erzeugen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der BASL-YDA-MPK6 Polarity Complex Während stomatäre Asymmetrische Zellteilung (ACD) in Arabidopsis. In der Blattepidermis initiiert die Stomata linage aus den protodermal Zellen, die erweitern ACD - Vorläuferzellen zu werden, die Meristemoid Mutterzellen (MMCs). Eine MMC durchläuft eine ACD ein Meristemoid und ein SLGC (Stomata Linie Grundzelle) zu schaffen, die teilen können und unterscheiden sich schließlich in der Stomata Schließzellen und Pflaster-Zellen. An der Zell cortex der ACD-Vorläuferzellen (MMCs), BASL rekrutiert zwei Komponenten eines MAPK-Weg, der MAPKKK YDA und die MAPK MPK6, eine Polarität Komplex zu bilden und stomatal ACD regulieren.om / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Injektionsverfahren in Tabak Blattepidermis. (A) Transformation der Plasmide GFP-BASL, DNyda-NYFP, DNmpk6-cYFP und P19 in Agrobacterium tumefaciens GV3101 und wachsen sie auf entsprechenden Selektionsplatten (von oben nach unten in EIN). (B) Pick - up - Kolonien aus (A) Flüssigkultur für Wachstum über Nacht zu impfen. (C) Ernten Sie die Zellen durch Spinnen und dekantieren Sie den Überstand. Nach einer kurzen Pipettieren und die Pellets Waschen, drehen Sie die Zellen wieder. (D) erneut zu suspendieren und die Zellpellets mit der Infiltrationslösung verdünnen (siehe Protokoll) den endgültigen OD 600 = 0,5 zu erreichen. (E) vorsichtig mischen the Zellen in einer Petrischale re-suspendiert. (F) Verwenden Sie eine nadellose Spritze , die Infiltration Mischung in die abaxial Seite der Tabakblätter zu drücken. (G) Über 48 Stunden nach der Infiltration, die Blätter sind für die konfokale Abbildung bereit. Excise Blattscheiben-Zellen mit einem Loch Puncher um die Infiltration Region enthält infiziert. Eine gestrichelte Kreise zeigen lassen Platten ausgeschnitten. (H) Wasser Verwenden Sie die Blattscheiben auf eine Standard - Rutsche für die konfokale Abbildung zu montieren. Die Box-Diagramme im schraffierten Bereich beschreiben die Proteine in Tabak für Polarisationstest injiziert verlässt. Protein Größen sind nicht im Maßstab. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Anzeige und Quantifizierung der Polarität Formation. (AC) Konfokalbilder CFP und YFP florescence in Tabak epidermalen Zellen zu zeigen. Cyan zeigt die Expression von GFP. Gelb zeigt die Expression von YFP. (A) Überexpression von GFP-BASL allein. (B) Co-Expression von DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP. Die YFP-Expression wird ergänzt, wenn zwei Proteine interagieren. (C) Die Co-Expression von GFP-BASL, DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP. Eine ungleichmäßige Verteilung (Polarität) ist offensichtlich für beide CFP und YFP. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m (AC). (DF) Grafisch die CFP / YFP Fluoreszenzintensität entlang der gestrichelten Linien (Magenta) in (AC) aufgetragen ist . Magenta Dreiecke markieren den Anfangs- und Endpunkt der Regionen für die Intensitäts Plotten verwendet. Quantifizierungen der Polarität Grad in Tabakzellen unterhalb dargestellt. Die Werte von florescence Intensität (H für hohe und L für Low) werden von Fidschi aus den Regionen mit rotem da verfolgt gemessen und gesammeltSchuppen Linien in (AC). Für jede Probe werden die Werte aus 20 Zellen für die Signifikanztest gemittelt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allgemeine Verwendung und mögliche Modifikationen des Transient Expression System Tabak für die Signalübertragung: Eine Überexpression von Fluoreszenzprotein (FP) -markierte Proteine in den Tabak Epidermis wurde für die schnelle Untersuchung von Protein subzelluläre Lokalisierung in Pflanzenzellen erfolgreich eingesetzt. Jedoch ist das Studium dynamischer Signalverteilung der Proteinkomplex in planta ein herausforderndes Thema aufgrund der komplizierten subzellulären Kontexten transienten Protein-Protein - Wechselwirkung und Signaltransduktion. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir den Vorteil des BIFC System MAPK-Signalereignisse zu untersuchen. Durch Coexpression YDA-NYFP und MPK6-cYFP, das zurückgewonnene YFP-Signal angezeigt, daß die Aktivierung des MAPK Melderelais an der Plasmamembran auftreten können.
Ideal wäre es , fluoreszierend zu coexprimierender getaggt YDA und MPK6 in Arabidopsis und die dynamische MAPK Aktivität in vivo zu untersuchen. Allerdings getransgene Pflanzen nerating ist zeitraubend, insbesondere wenn mehr als ein Konstrukte erwünscht ist. Protein transiente Expression in Tabakzellen kann eine schnelle vorläufige Test für die in vivo - Expression in Arabidopsis und anderen Pflanzen sein. Der andere Vorteil, daß der Tabak transienten Expressionssystem bietet, jedoch nicht leicht durch die Erzeugung transgener Pflanzen erreicht werden kann, ist, dass bis zu 4 oder 5 Fusionsproteine können gleichzeitig und durch konfokale Mikroskopie untersucht coexprimiert werden, wenn die Verbindung erreichbar ist.
Mit Tabak Epidermiszellen MAPK Signalweg in Pflanzenzellen zu untersuchen, kann weiter in andere Signalwege und unter verschiedenen Umgebungsbedingungen durchgeführt werden. Zum Beispiel würde sich ändern , die Interaktion von YDA-MAPK seiner Intensität oder Standort , wenn die exprimierenden Zelle mit lokalen H 2 O 2 Anwendung (ein MAPK - Signal Stimulus) behandelt wird? Solche Tests schnell entwickelt werden können und spec Adresse ausgeführtific Fragen. Mehrere Mitglieder sind in jeder Stufe der MAPK Kassetten (3 bis 4 Stufen im allgemeinen), aber wie Signalisierungs Spezifität in Pflanzen oder anderen Systemen bleiben weitgehend unbekannt erreicht wird. Indem verschiedene Kombinationen von MAPKKKs mit MAPKKs oder MAPKKs mit MAPKs ermöglicht das Tabak transienten Expressionssystem eine relativ große Analyse nicht nur Protein-Protein-Wechselwirkung, sondern auch die räumliche Organisation des Signalflusses in Pflanzenzellen.
Customized Co-Expression und BIFC Assay zur Untersuchung von Protein - Polarisation: Eine langjährige grundlegende Frage in der Zellbiologie ist wie Universal-Signalwege, zB MAPK, erreichen ihre Spezifität zu bestimmten Entwicklungsstadium oder unter bestimmten Umweltbedingungen. Co-Expression der Polarität Protein BASL mit den BIFC Komponenten von YDA und MPK6 in Tabakzellen hat uns, dass die YDA-MAPK-Interaktion und Signalisierung räumlich d wieder zu demonstrieren erlaubtistributed durch die Anwesenheit von BASL eine spezifische Polarität Proteine während stomatal ACD. Daher kann die YDA-MAPK-Signalspezifität durch Wechselwirkung mit BASL erreicht werden Zellpolarität und asymmetrische Teilung zu fördern.
Obwohl es nicht ein universelles Phänomen ist, ganz wenige Proteine gefunden wurden ungleichmäßig in Pflanzenzellen verteilt werden, zB 15 ROPs kleine GTPase, Auxin effluxer PIN - Proteine 16 und ihre Regler 17, Bor Transporter 18 und einige unbekannte Proteine (KRAKE 19 POLAR 20 und BRX 21). Dieses Protokoll wurde nicht beabsichtigt, die genetischen oder physikalische Partner in einem bestimmten Protein Polarisation Weg zu suchen, sondern zu prüfen, ob die interagierenden Proteine mit ROPs, PINs oder andere wahrscheinlich nützlich sein kann, eine Polarität Komplex in Pflanzenzellen bilden. Wenn jedoch eine Polarisations Ereignis mit Tabakzellen zu simulieren versucht, sollte man bedenken, dass Komplikationenkönnen in den Assays auftreten. Beispielsweise insbesondere die Arabidopsis Polarisations Ereignis nicht in Tabakzellen rekapituliert werden können, wenn mehr Komponenten erforderlich sind , als das, was in dem Assay untergebracht werden. Einige unbekannte Moleküle aus dem Tabak Hintergrund abgeleitet, die nicht unbedingt die Proteine unter Prüfung kann bei der Induzierung einer Polarisations Ereignis beteiligt sein. Daher ist es wichtig , eine strenge Kontrolle Experimente in Tabak einzurichten und die Daten in Arabidopsis oder anderen Pflanzen zu validieren.
Schlüsselelemente in den Experimenten Succeed: Erstens, grünlich und gesunde Tabakpflanzen verwendet werden soll. Da die Quantifizierung von Daten aus verschiedenen Zellen zu bündeln Analysen benötigen, ist es entscheidend, mit durchweg gesunde Zellen blühende Tabakpflanzen zu verwenden. Zweitens sollten die Zellen, die Medium-Proteinspiegel für konfokale Bildgebung verwendet werden. Niedrige Expressionsniveaus bieten möglicherweise nicht ausreichend Proteine, die für den Test und gesättigten Ausdruck levels würde die Polarisierung / Translokation Wirkung maskieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T.
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z.
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
