Summary

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Published: March 20, 2016
doi:

Summary

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Abstract

Visualizzazione di eventi di segnalazione dinamici in cellule vive è stata una sfida. Abbiamo ampliato un sistema di espressione transiente stabilito, il biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) test in cellule epidermiche tabacco, dall'interazione test proteina-proteina per monitorare la distribuzione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test BiFC per dimostrare che l'interazione e la segnalazione tra la Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 si verificano a livello della membrana plasmatica. Quando il BASL proteina scaffold è stato co-espresso, l'interazione YODA-MAPK ridistribuita e spazialmente co-polarizzato con CFP-BASL. Questo sistema di espressione del tabacco modificato consente per l'esame rapido di segnalazione di localizzazione e dinamici cambiamenti (meno di 4 giorni) e in grado di ospitare più di colori proteina fluorescente (almeno tre). Abbiamo anche presentato metodi dettagliati per quantificare la distribuzione delle proteine ​​(localizzazione spaziale asimmetrica, o "polarizzazione";) In cellule di tabacco. Questo avanzato sistema di espressione del tabacco ha un potenziale per essere utilizzato ampiamente per il test rapido di eventi di segnalazione dinamici in cellule vegetali dal vivo.

Introduction

Le proteine ​​interagiscono all'interno di un intricato gerarchici complessi di rete e di forma che giocano un ruolo fondamentale in quasi tutti i processi biologici che avvengono in un ambiente cellulare imprevedibile. Tuttavia, dallo sviluppo pianta risposte di crescita, c'è stata una mancanza di strumenti utili che possono non solo rapidamente, ma anche identificare e sorvegliare efficacemente questi eventi di segnalazione dinamici a livello subcellulare.

Il sistema di espressione della proteina transitoria tabacco epidermide foglia è attraente vantaggi per la visualizzazione di proteine ​​fluorescenti nelle cellule viventi. Questo sistema fornisce semi in vivo condizioni che permettono la modifica della proteina post-traslazionale e rapido esame di localizzazione delle proteine. Esaminando il segnale YFP completato, il test biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) informa la possibilità di interazione proteina-proteina nelle cellule vegetali. Rispetto ad altri metodi, ad esempio, il lievito-due ibridi (Y2H) e co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fornisce anche un potente mezzo di visualizzazione comparti in cui possono verificarsi interazioni proteina-proteina a livello subcellulare.

Poiché la divisione cellulare asimmetrica (ACD) mantiene staminali popolazione cellulare durante la generazione di nuovi tipi di cellule per la formazione del tessuto / organo, è un meccanismo indispensabile per promuovere multicellularità eucarioti. Arabidopsis sviluppo degli stomi è stato utilizzato come sistema modello per lo studio ACD nelle piante. La cellula precursore, cellula madre meristemoid, divide in modo asimmetrico per produrre due differenti cellule figlie, una meristemoid (subisce staminali divisioni cellulari come prima di terminare in un paio di cellule di guardia) e una cella stomatica lignaggio terra (SLGC) (può dividersi e differenziarsi in una cella marciapiede), rispettivamente (Figura 1). In stomatal ACD, la rottura nuova proteina di asimmetria nel lignaggio stomatica (BASL) è polarizzato premitotically guidare asimmetrie divisione, che incLude asimmetria fisica e il destino delle cellule asimmetria 1. Una cascata MAPK composto dal MAPKKK Yoda e le MAPKs, MPK3 e 6 è centrale per la divisione degli stomi patterning e l'adozione destino 2,3, 4,5.

Recentemente, Zhang et al. collegato la proteina BASL polarità della via di segnalazione YDA-MAPK in Arabidopsis stomi ACD 6. Il percorso canonico YODA-MAPK, attraverso MPK3 / 6, fosforila BASL e attiva la sua polarizzazione. Funzioni BASL fosforilata da impalcatura e recluta YODA (YDA) e MPK3 / 6 per formare un complesso proteico e concentrano la segnalazione alla corteccia cellulare 6. Polarizzazione dei componenti MAPK e l'anello di retroazione positiva tra BASL e il percorso YDA-MAPK rappresenta un nuovo meccanismo per la polarizzazione delle proteine ​​nelle cellule vegetali. Segnalazione MAPK Localmente arricchita si ipotizza essere strettamente legata alla differenziazione destino della cellula in stomatica ACD 6 (Figura 1). Uno dei key dati sperimentali che ha sostenuto questo modello è venuto dai saggi di tabacco che hanno dimostrato la ridistribuzione spaziale di MAPK indotte mediante l'espressione di BASL 6.

In generale, non è facile controllare dove si verifica segnalazione MAPK perché molecole MAPK erano spesso trovano ovunque all'interno di una cellula. In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema split-YFP per visualizzare l'interazione tra la chinasi monte e quelli a valle di suggerire dove avviene il relè di segnalazione. Abbiamo esteso ulteriormente l'utilizzo del sistema BiFC dal co-esprimendo una terza proteina (PCP-tagged), con la scissione YFP due (suggestiva di interazione proteina-proteina) di visualizzare se e come il YFP integrata potrebbe essere spazialmente modulata dal co espresso proteina CFP. In questo modo, abbiamo dimostrato che la co-espressione di CFP-BASL indotta riorganizzazione spaziale delle interazioni tra YDA e MPK6, da una distribuzione uniforme di patterning polarizzato in corteccia cella del epidermide tabaccocellule al. Questo sistema ha quindi il potenziale per essere sviluppato per il monitoraggio di eventi di segnalazione dinamici in cellule vegetali, in condizioni in cui le cellule sono sfidati dagli stimoli interni o esterni (ad esempio, co-espressione di altre proteine, applicazione di prodotti chimici, di attacco patogeno o cambiamenti ambientali, ecc. ).

Protocol

1. Costruzione plasmide Generare i costrutti di clonazione tecnologia come descritto in precedenza 1,6. In primo luogo utilizzare un DNA polimerasi ad alta fedeltà con primer adeguati per amplificare le sequenze codificanti di BASL, YDA e MPK6 e sub-clonare in vettori di ingresso. Trova il protocollo dettagliato in 7. Per generare le versioni negative dominanti (rispettivamente 8 e DNmpk6 DNyda 4,) MPK6 e YDA, utilizzare i plasmidi di entrata di …

Representative Results

Per prevenire la morte cellulare indotta dalla segnalazione MAPK iperattivo, le chinasi versioni inattive di YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) sono stati utilizzati nel saggio di co-espressione in cellule di tabacco. Né l'interazione tra DNyda e DNmpk6 rivelato da BiFC né CFP-BASL stesso generato modello di distribuzione non uniforme (Figura 3A-B). Tuttavia, quando CFP-BASL stato introdotto nella coppia interazione DNyda-DNmpk6, sia CFP e YFP segnali sono stati ridistrib…

Discussion

Uso generale e possibili modifiche del sistema di espressione transitoria Tabacco per trasduzione del segnale: sovraespressione di proteina fluorescente (FP) -tagged proteine ​​dell'epidermide tabacco è stato utilizzato con successo per l'esame veloce di proteine ​​localizzazione subcellulare in cellule vegetali. Tuttavia, studiando la distribuzione di segnalazione dinamica del complesso proteico in Planta è un argomento difficile a causa di contesti subcellulari complicate, i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

Materials

Phusion DNA polymerase New England Biolabs M0530S
pENTR/D/TOPO Life Technologies K2400-20
QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit Agilent Technology 200521
LB broth AMRESCO J106-2KG
Bacto Agar AMRESCO J673-1KG
Gentamycin Sigma-Aldrich G3632-1G
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501-1G
Kanamycin Sigma-Aldrich K4000-25G
Spectinomycin Sigma-Aldrich S4014-5G
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
25x75mm Slide VWR 16004-382
24×50 mm Cover glass VWR 48393-241
Laser scanning confocal microscope Leica  TCS SP5 II  LAS AF Lite software
40 x objective lens Leica HCX Plan APO  HCX Plan APO , NA 1.30
Centrifuge Thermo Scientific SORVALL 6+
Hole puncher Staples
50 ml falcon tubes Genesee Scientific 21-108
No. 5 Forceps Canemco & Marivac 205EQA-Spec

References

  1. Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
  2. Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
  3. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
  4. Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
  5. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
  6. Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
  7. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
  8. Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
  9. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
  10. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
  11. Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
  12. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
  13. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
  14. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).
  15. Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
  16. Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
  17. Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
  18. Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
  19. Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
  20. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
  21. Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).

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Cite This Article
Zhang, Y., Dong, J. Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System. J. Vis. Exp. (109), e53790, doi:10.3791/53790 (2016).

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