Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Summary

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Abstract

Visualização de eventos de sinalização dinâmicos em células vivas tem sido um desafio. Nós expandido um sistema de expressão transiente estabelecida, a complementação fluorescente (BiFC) biomolecular ensaio em células epidérmicas de tabaco, a partir de testes de interacção proteína-proteína para controlo da distribuição espacial da transdução de sinal em células de plantas. Neste protocolo, foi utilizado o ensaio BiFC para demonstrar que a interacção e a sinalização entre a Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 ocorrem na membrana plasmática. Quando o basl proteínas scaffold foi co-expressa, a interação YODA-MAPK redistribuído e espacialmente co-polarizado com o CFP-basl. Este sistema de expressão modificado tabaco permite a análise rápida de sinalização de localização e dinâmicas mudanças (menos do que 4 dias) e pode acomodar várias cores de proteína fluorescente (pelo menos três). Também apresentamos métodos detalhados para quantificar a distribuição de proteínas (localização espacial assimétrica, ou "polarização";) Nas células do tabaco. Este sistema de expressão de tabaco avançado tem um potencial a ser amplamente utilizado para o teste rápido de eventos de sinalização dinâmicos em células de plantas vivas.

Introduction

As proteínas interagem dentro de uma intrincada rede e complexos de forma hierárquica, que desempenham um papel fundamental em quase todos os processos biológicos que ocorrem num ambiente celular imprevisível. No entanto, desde o desenvolvimento de respostas de crescimento da planta, tem havido uma falta de ferramentas conveniente que não só pode rapidamente mas também identificam eficientemente e monitorizar esses eventos de sinalização dinâmica ao nível subcelular.

O sistema de expressão de proteína transiente na epiderme da folha de tabaco tem vantagens atraentes para a visualização de proteínas fluorescentes em células vivas. Este sistema proporciona semi condições in vivo que permitem a modificação de proteínas pós-translacional e rápido exame de localização de proteínas. Ao examinar o sinal de YFP complementadas, o ensaio de complementação bimolecular fluorescente (BiFC) informa a possibilidade de interacção proteína-proteína em células de plantas. Em comparação com outros métodos, como por exemplo, a levedura de dois híbridos (y2h) e co-immunoprecipitation (Co-PI), BiFC também fornece um meio poderoso de visualizar compartimentos onde as interações proteína-proteína podem ocorrer ao nível subcelular.

Uma vez que a divisão celular assimétrica (ACD) mantém a população de células estaminais ao gerar novos tipos de células para a formação de tecido / órgão, é um mecanismo indispensável para promover multicelularidade eucariótica. Estomática desenvolvimento de Arabidopsis foi usado como um sistema modelo para o estudo em plantas ACD. A célula precursora, célula mãe meristemoid, divide assimetricamente para produzir duas células-filhas diferentes, um meristemoid (passa-tronco divisões celulares-like antes de terminar em um par de células-guarda) e uma célula estomática linhagem solo (SLGC) (pode dividir e diferenciar em uma célula pavimento), respectivamente (Figura 1). Em ACD estomática, o romance quebra de proteína de assimetria na Lineage estomática (basl) é polarizada premitotically para conduzir assimetrias divisão, que incassimetria física lude e destino celular assimetria ^1. Uma cascata MAPK composto pelo MAPKKK Yoda e as MAPKs, MPK3 e 6, são fundamentais para padronização divisão estomática e adoção destino ^{2,3, 4,5.}

Recentemente, Zhang et al. ligada a basl proteína polaridade para a via de sinalização YDA-MAPK em Arabidopsis stomatal ACD ^6. O canônica via YODA-MAPK, através MPK3 / 6, fosforila basl e ativa a sua polarização. Fosforilados funções basl como um andaime e recruta YODA (YDA) e MPK3 / 6 para formar um complexo de proteína e concentrar a sinalização no córtex de ⁶ células. Polarização dos componentes MAPK e o ciclo de feedback positivo entre basl ea via YDA-MAPK representa um novo mecanismo para a polarização de proteínas em células vegetais. Sinalização MAPK localmente enriquecido é a hipótese de estar intimamente ligado à diferenciação destino celular no stomatal ACD ⁶ (Figura 1). Um dos kEY dados experimentais que este modelo suportado veio a partir dos ensaios de tabaco que demonstraram a redistribuição espacial das MAPKs induzida pela expressão de basl ^6.

Em geral, não é fácil de monitorizar a sinalização MAPK, onde ocorre porque as moléculas de MAPK foram frequentemente encontrados em toda a parte no interior de uma célula. Neste estudo, utilizou-se o sistema split-YFP para visualizar a interacção entre a cinase a montante e a jusante os sugerir onde ocorre o relé de sinalização. Nós estendido ainda mais a utilização do sistema BiFC por co-expressão de uma terceira proteína (PCP-tag), com a divisão par YFP (sugestivo de interacção proteína-proteína) para visualizar se e como a YFP complementada podiam ser espacialmente modulado pela co- expressa a proteína PCP. Ao fazer isso, nós demonstramos que a co-expressão de CFP-basl induzida reorganização espacial das interações entre YDA e MPK6, a partir de uma distribuição uniforme para padronização polarizada no córtex célula da epiderme tabacocélulas al. Por conseguinte, este sistema tem o potencial de ser desenvolvido para monitorar eventos de sinalização dinâmica em células vegetais sob condições em que as células são desafiadas pelos estímulos internos ou externos (por exemplo, a co-expressão de outras proteínas, a aplicação química, ataque de agentes patogénicos ou alterações ambientais, etc. ).

Protocol

1. O plasmídeo Construção Gerar as construções por tecnologia de clonagem como descrito anteriormente 1,6. Em primeiro lugar utilizar uma polimerase DNA de alta fidelidade com iniciadores adequados para amplificar as sequências de codificação de basl, YDA e MPK6 e sub-clonar-los em vectores de entrada. Encontre o protocolo detalhado no 7. Para gerar as versões negativos dominantes de MPK6 e YDA (DNmpk6 8 e DNyda 4, respectivamente), utili…

Representative Results

Para evitar a morte celular induzida pela sinalização MAPK hiperactivo, as versões inactivos cinase de YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) foram usadas no ensaio de co-expressão em células de tabaco. Nem a interação entre DNyda e DNmpk6 revelado por BiFC nem a própria gerado padrão de distribuição desigual (Figura 3A-B) CFP-basl. No entanto, quando PCP-basl foi introduzido no par interacção DNyda-DNmpk6, tanto PCP e sinais YFP foram redistribuídas para uma forma al…

Discussion

Uso geral e possíveis modificações do sistema de expressão transiente de tabaco para transdução do sinal: A sobre-expressão da proteína fluorescente (FP) tagged proteínas na epiderme do tabaco tem sido usado com sucesso para a análise rápida de proteína de localização subcelular em células vegetais. No entanto, o estudo de distribuição de sinalização dinâmica do complexo proteína in planta é um tema difícil, devido aos contextos subcelulares complicado, interacção prote…

Materials

Phusion DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit	Agilent Technology	200521
LB broth	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25x75mm Slide	VWR	16004-382
24×50 mm Cover glass	VWR	48393-241
Laser scanning confocal microscope	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite software
40 x objective lens	Leica	HCX Plan APO	HCX Plan APO , NA 1.30
Centrifuge	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Hole puncher	Staples
50 ml falcon tubes	Genesee Scientific	21-108
No. 5 Forceps	Canemco & Marivac	205EQA-Spec