Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.
Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.
Hæmostase kræver den kombinerede og regulerede aktivitet af celler, proteiner, ioner og væv i et begrænset Spatiotemporal kontekst 1. Ukontrolleret aktivitet kan føre til blødning eller blodprop og sygelighed eller dødelighed i et spektrum af lidelser relateret til blod koagulation. Mikrofluidapparat strømningskammer eksperiment er en udfordrende teknik, der efterligner hæmostase in vitro. Denne fremgangsmåde giver mulighed undersøgelse af det komplekse samspil af processer, der deltager i hæmostase med en ledende rolle for blodplader.
Efter vaskulær beskadigelse, blodplader klæber til den eksponerede subendoteliale matrix (glyco) proteiner for at forhindre blodtab. Efter vedhæftning, blodplader aktivere og aggregat som reaktion på auto- og parakrin signalering som endelig fører til dannelsen af en blodplade netværk, stabiliseret med fibrin og resulterer i en virksomhed, sår forsegling blodprop 2. I modsætning til de fleste andre trombocytfunktionen tests, erfamenter med strømningskamre tage hensyn til fysisk parameter af blodgennemstrømning og dermed indflydelse af rheologi for de deltagende celler og biomolekyler 3,4.
Strømningskammeret eksperimenter har genereret skelsættende indsigt i hæmostase og thrombose ved at variere nøgleparametre, der påvirker hæmostatiske (sub) processer inklusive den klæbende matrix, rheologi og strømnings- profiler, cellulære sammensætning, tilstedeværelse af toksiner eller lægemidler, ionstyrke og mange flere. I de seneste to årtier har lav throughput flow kammer eksperimenter kræver store prøvevolumener (10-100 ml) udviklet sig til mikrofluide kamre ofte består af små parallel-plade kamre og med moderne teknologi til perfusion fuldblod på kontrollerede væg forskydningsbetingelser 5. Microscaling steget betydeligt assay gennemløb mest fordi opsætningen hardwaren har forenklet og der kræves mindre (blod) volumen, hvilket gør forsøget mere tilgængelig og versatile. For eksempel kan blod fra små forsøgsdyr nu bruges uden behov for at ofre dyr. Blodprøver af genetisk modificerede mus har således hjulpet til identifikation af centrale molekyler, der fremmer eller hæmmer hæmostase og i nye grundlæggende indsigter 6.
Specialized forskningslaboratorier ofte stadig bruge specialfremstillede flow kamre for eksempel fra polydimethylsiloxan (PDMS) 7, der polymeriserer på litograferede forme, som kan blueprinted af software. Den resulterende kammer er billig, engangsbrug og kan let skilles ad for post-hoc analyse. Desuden dybest set ethvert design af fartøjer, herunder bifurkationer eller skarpe sving kan bygges på kommando. Denne fordel er også sin ulempe, da standardisering var allerede den primære problem med flow kammer eksperimenter, og PDMS specialfremstillede kamre har ikke hjulpet dette. Oven i dette særlige spørgsmål, belægning (betingelser), fluorescerende prober, antikoagulerende, tempratur og tid mellem prøvetagning og analyse er alle dårligt standardiseret 8. Standardisering af disse variabler er udfordrende, men ikke desto mindre forpligtet til at tillade sammenligning af resultater mellem laboratorier. Dette emne er den største genstand for International Society for Trombose og Hæmostase i videnskabelig og Standardisering underudvalg om Biorheology 9,10.
Blodpladekoncentrater (PC) er transfunderet i patienter, der lider af forskellige sygdomme, der forårsager trombocytopeni og / eller blødning. Men blodplader i PC er kendt til desensibilisering, især som funktion af opbevaringstiden 11, en forringelse proces forbundet med ældning og benævnes almindeligvis blodpladeopbevaring læsion. Det hævdes undertiden, at sådanne blodplader gendannes i omløb engang transfunderet 12, men bevis for dette er knappe. Endvidere er funktionaliteten af blodplader, der udgør en PC ikke rutinemæssigt testet fordi forholdet mellem sådanne assays ogterapeutisk eller profylaktisk virkning er uklar 13. Mikrofluide flow kamre tilbyde et middel til at undersøge trombocytfunktionen i PC for at optimere kæden af manipulationer mellem indsamling og udstedelse. Det er et kraftfuldt forskning værktøj til direkte (parret) sammenligninger af PC, som vi tidligere har offentliggjort 14,15 og er beskrevet her.
Mikrofluide strømningskammer eksperimenter er et udmærket redskab til at undersøge blodpladefunktion i strømmende blod og anvendes til at evaluere hæmostase in vitro i varierende eksperimentelle sammenhænge. Trods dårlig interkalibrering standardisering 9, viser vi, at den eksperimentelle variation inden for vores laboratorium er acceptabel. Dette gør det muligt på pålidelig sammenligne (parret) prøver inden for en given undersøgelse. Dette blev valideret ved anvendelse af veldokumentered…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Heparin | Becton, Dickinson and Company | 368480 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Hirudin Blood tube | Roche | 6675751 001 | |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Tube 5mL | Simport | 11691380 | |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Named in figure S1 A as 'Biochip' |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | Named in figure S1 B as 'Disposable tubing' |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | Named in figure S1 B as 'Pin' |
Connectors for single inlet cables of biochips | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Multiflow8 connect | Cellix | MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS | Named in figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter' |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Software microfluidic pump | Cellix | N/A | Venaflux Assay |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Bleach 10% | in house preparation | in house preparation | |
0.1M NaOH | in house preparation | in house preparation | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8. Named in figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold' |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Hematology analyzer | Sysmex | N/A | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Platelet incubater | Helmer | PF-48i | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Pipette | Brand | A03429 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vortex | VWR | 58816-121 |