Abstract
Il sistema nervoso enterico (ENS) gioca un ruolo importante nella regolazione gastrointestinale (GI) motilità e può funzionare indipendentemente dal sistema nervoso centrale. Cambiamenti nella funzione ENS sono una delle principali cause di sintomi gastrointestinali e malattie e possono contribuire a sintomi gastrointestinali riportati in disturbi neuropsichiatrici, tra cui l'autismo. E 'ben noto che isolati segmenti del colon generano spontanei, contrazioni ritmiche note come colon Migrazione motore Complessi (CMMCs). Una procedura per analizzare la regolazione neurale enterica di CMMCs in ex vivo preparazioni di due punti del mouse è descritto. Il colon è sezionato dall'animale e lavato per rimuovere i contenuti fecale prima di essere cannulate in un bagno d'organo. I dati vengono acquisite tramite una telecamera posizionata sopra la vasca organo e convertito in mappe spazio-temporali ad alta risoluzione tramite un pacchetto software in-house. Utilizzando questa tecnica, i modelli contrattili di base e gli effetti farmacologici sulla funzione ENS a colon segments possono essere confrontati più di 3-4 ore. Inoltre, la lunghezza e la velocità di propagazione di CMMCs possono essere registrate così come i cambiamenti di diametro intestino e la frequenza di contrazione. Questa tecnica è utile per la caratterizzazione di modelli della motilità gastrointestinale in modelli di topi transgenici (e in altre specie, tra cui ratti e cavie). In questo modo, i cambiamenti indotti farmacologicamente in CMMCs sono registrati nei topi wild-type e nel modello di topo R451C neuroligin-3 di autismo. Inoltre, questa tecnica può essere applicata ad altre regioni del tratto gastrointestinale compreso il duodeno, digiuno e ileo e a diverse età dello sviluppo nei topi.
Introduction
Il sistema nervoso enterico (ENS) è la rete neuronale intrinseca del tratto gastrointestinale e modula diverse funzioni come la digestione del contenuto intestinale, l'assorbimento delle sostanze nutritive e la secrezione e riassorbimento di fluido. I neuroni del ENS si trovano nelle mienterici e sottomucosa plessi. Il plesso mioenterico svolge un ruolo importante nella regolazione della motilità gastrointestinale 1 mentre il plesso sottomucoso è principalmente coinvolto nel controllo della secrezione 2,3. Il plesso mioenterico si trova tra gli strati muscolari longitudinali e circolari della parete gastrointestinale. L'attività contrattile degli strati muscolari lisce della parete intestinale facilita le funzioni primarie del tratto gastrointestinale mescolando e propulsione contenuto intestinale lungo la lunghezza dell'intestino 3. Sebbene l'innervazione estrinseca al tratto gastrointestinale dal CNS contribuisce alla funzione gastrointestinale in vivo, L'ENS è in grado di regolare la funzione gastrointestinale in modo indipendente. Questa caratteristica unica permette l'indagine funzionale dei circuiti neuronali enterici e il loro contributo alla motilità gastrointestinale ex vivo.
Colon migrazione complessi a motore (CMMCs) sono spontanee, eventi neurogene che sono il modello del motore predominante osservato nel colon isolato mouse in assenza di pellet fecali 4-9. CMMCs sono definiti come contrazioni ritmiche che si propagano lungo una distanza orizzontale che è almeno metà della lunghezza totale del colon (cioè, dal cieco al retto) 10. Il rapporto tra CMMCs e gli schemi contrattili che spingono pellet fecali è ancora da essere chiaramente stabilita, tuttavia alcune differenze farmacologiche sono stati segnalati 11. Tuttavia, la capacità del ENS di funzionare indipendentemente del SNC e l'esistenza di schemi motori neurali mediata nella SIcolon olated fornisce un sistema di test ideale per esaminare i disturbi della motilità che derivi dalla sottostante disfunzione ENS. La spontaneità di schemi motori gastrointestinali permette cambiamenti funzionali in risposta a stimoli farmacologici da valutare.
L'uso di immagini video e mappatura spazio-temporale è stato sviluppato per esaminare quantitativamente piccolo peristalsi intestinale nelle cavie 12. Qui, una tecnica ex vivo è descritto che consente lo studio di topo modelli di motilità del colon utilizzando immagini video e l'analisi di queste registrazioni per costruire ad alta risoluzione (~ 100 micron, 33 msec) mappe del diametro del colon in funzione della posizione lungo il colon e di tempo (mappe spazio-temporali). L'utilizzo in-house software di rilevamento dei bordi (Analyse2; a richiesta), i dati di piena lunghezza segmenti del colon contraente in tempo reale vengono elaborate per generare mappe spazio-temporali per ogni esperimento. In questa fase, i file video (AVI) sono summarizzato e convertito in mappe spazio-temporali che utilizzano Analyse2. Mappe spazio-temporali (Figura 2) descrivono contrattilità nel tempo e consentono di misurare più parametri quali la velocità di propagazione, ampiezza, lunghezza e durata. diametro Gut è registrato anche per tutta la durata dell'esperimento come misura della contrattilità complessiva del segmento tissue. Questo metodo può essere applicato per identificare differenze nel punto di innesco di complessi contrattili che potrebbe indicare connettività neuronale enterica alterata.
Un simile protocollo video di imaging progettato per valutare pellet propulsione in cavie 'stato segnalato 13 tuttavia qui descriviamo l'applicazione dell'approccio immagini video per la quantificazione della motilità del colon spontanea (cioè in assenza di pellet). Forniamo anche informazioni dettagliate per facilitare la dissezione e preparazione del tessuto gastrointestinale per l'approccio di immagini video. Questoprotocollo fornisce ai ricercatori con uno strumento accessibile e facilmente replicato per l'analisi enterico controllo neurale della funzione gastrointestinale in modelli animali di malattie tra cui modelli genetici di topo.
La tecnica di immagini video permette l'analisi della motilità del colon in risposta a vari agenti farmacologici. I farmaci possono essere somministrati tramite lume intestinale o il bagno per organi esterni alla preparazione del colon. Diverse regioni del tratto gastrointestinale topo mostrano modelli di motilità specifici come piccola segmentazione intestinale e CMMCs nel colon.
Questa tecnica è stata utilizzata per identificare le differenze di deformazione in piccola funzione intestinale; sensibilità differenziale 5-HT 3 e 5-HT 4 antagonisti sono stati osservati nel digiuno di Balb / c topi C57 / BL6 causa della natura polimorfica del gene TPH2 espressa nei due ceppi 6. L'effetto di inibizione 5-HT sulla motilità rimane controversa, come dati contrastanti stato segnalato l'importanza di endogena 5-HT su peristalsi del colon e CMMCs 14,15. Alterazioni della motilità pre e dopo la nascita durante lo sviluppo 7, e gli effetti di mutazioni del gene sulla motilità gastrointestinale in modelli animali di malattia 10 possono essere esaminati anche dal utilizzando immagini video. Qui illustriamo uso del metodo per lo studio della motilità del colon nel modello murino NL3 R451C di autismo, che esprime una mutazione missense nel gene che codifica per la NLGN3 sinaptica proteina di adesione neuroligin-3 16. Questa mutazione è stato identificato in pazienti con diagnosi di disturbo dello spettro autistico (ASD) 17, che è fortemente associato con IG disfunzioni 18-22. Abbiamo studiato se la mutazione sinaptica NL3 R451C colpisce uscite neurali nel ENS con la tecnica video di imaging. Presentiamo i dati che caratterizzano CMMCs al basale e in risposta alla 5H serotoninergicaT 3/4 antagonista del recettore tropisetron nel modello murino NL3 R451C di autismo.
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Protocol
movimentazione degli animali e dislocazione cervicale degli animali prima di tutti gli esperimenti sono stati eseguiti rigorosamente secondo protocolli approvati dal Comitato sperimentazione animale per l'Università di Melbourne (Etica ID: 1.212.494,7)
1. Tessuto Raccolta e dissezione
- Euthanize topi adulti per dislocazione cervicale. Se possibile evitare l'anestesia per evitare influenze sulla funzione intestinale attraverso recettori situati sulle popolazioni neuronali di interesse.
- Registrare il peso totale del corpo dell'animale, pin il corpo (attraverso i quattro zampe, lato ventrale esposto a sperimentatore) saldamente ad una tavola di dissezione utilizzando aghi ipodermici (Dimensioni: 20 G).
- Utilizzando dissettore e forbici; fare un'incisione attraverso l'epidermide sovrapponendo strati muscolari addominali inferiori. Continuare a utilizzare le pinze e forbici per aprire la cavità addominale lungo la linea mediana dell'addome allo sterno.
- Per evitare che la disidratazione dei tessuti, versare Physisalina meto- (soluzione Krebs: 118 NaCl, 4.6 KCl, 2,5 CaCl 2, 1.2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-glucosio in mM - bollito a RT con gas CarboGen; 95% O 2 e 5 % CO 2 per almeno 20 min) sul contenuto addominale a intervalli regolari (per esempio, ogni 30-60 sec) durante il processo di dissezione.
- Per isolare i due punti, mentre attaccato al cieco e retto, tenere premuto il cieco (che si trova adiacente alla estremità prossimale del colon) delicatamente con dissettore circa 4-5 cm sopra il corpo dell'animale durante il taglio del mesentere con le forbici dissezione multa.
- Fare attenzione a non gestire, allungare o tagliare il tessuto gastrointestinale durante la rimozione del mesentere adiacente.
- Rimuovere il tessuto in eccesso (cioè, vescica e testicoli). Utilizzando le forbici dissezione grossolana, fanno due incisioni verticali (cioè, circa 0,5 cm dalla linea mediana) per tagliare l'osso pelvico su EAlato ch del colon.
- Usare le forbici sottili per separare il retto dalla adiacente tessuto pelvico e finiture che circonda il muscolo dal colon.
- Posizionare il colon full-length (da cieco al retto) in un bicchiere contenente soluzione fisiologica (in precedenza ossigenata con CarboGen) e continuare a ossigenare a temperatura ambiente. Rimuovere il cieco e del retto con le forbici dissezione pregiati e sostituire in coppa.
- Vuoti pellet fecali / contenuto intestinale da preparati colon mediante l'applicazione di una leggera pressione positiva al termine orale utilizzando una siringa da 5 ml collegata ad un puntale 200 ml riempita con soluzione fisiologica. Al fine di orientare il tessuto in futuro, utilizzare un perno di insetto per marcare la fine più prossimale del colon, dove striature nella mucosa sono visibili.
- Modificare la punta di plastica della pipetta per adattare la siringa da 5 ml, rimuovendo circa 1 cm dalla fine più ampio / prossimale usando una lama di rasoio. Per aumentare la portata, ampliare l'/ estremità più piccola distale tagliando su un angle (circa 45 ° C) usando una lama di rasoio.
- Grip il tessuto del colon delicatamente alla sua estremità prossimale con dissettore, inserire la punta della pipetta nel lume del colon e del filo soluzione fisiologica attraverso il lume.
2. Preparazione del colon tessuti e set up sperimentale per Video Imaging
- Salina fisiologica filo attraverso tutta la tubazione collegata ad un bagno di due Chambered organo impostare (Figura 1 e Figura 3), utilizzando una siringa collegata ad una punta di pipetta 200 microlitri. Questo passaggio rimuove i detriti all'interno del tubo che potrebbero bloccare il flusso di soluzione. Per tubi specifiche fare riferimento alla tabella dei materiali.
- Assicurarsi che le camere del bagno per organi sono continuamente superfused con soluzione fisiologica bollito con CarboGen (95% O 2 e il 5% di CO 2, il tasso di 5 ml min -1 flusso). Utilizzando una sonda di temperatura ad intervalli regolari, affinché la temperature del bagno viene mantenuta tra 33 ° C -37 ° C.
- Riempire il serbatoio afflusso collegato attraverso un rubinetto a 3 vie per il tubo di ingresso con 20-30 ml di soluzione salina fisiologica utilizzando una siringa da 50 ml.
- Durante l'esperimento, mantenere la pressione nel serbatoio afflusso utilizzando arubber tappo con un tubo di vetro (5 mm di diametro interno) inserito attraverso il suo centro. Assicurarsi che l'apertura superiore del serbatoio di afflusso è sigillato in modo sicuro (con il tubo di vetro interno rimanendo sigillata).
- Posizionare il colon (lunghezza 5-7 cm) nella camera di bagno per organi, assicurandosi che sia completamente immerso in soluzione salina fisiologica.
- Cannulate ogni estremità del segmento colico ai due tubi di ingresso / uscita sommerse (ingresso / tubi di uscita di diametro può essere modificata in base alle dimensioni del lume tessuto es. Tessuto postnatale, topi adulti e cavia) in bagno usando standard di di cotone filati per cucire. Attaccare l'estremità prossimale del colon al tubo di ingresso e laestremità distale del colon al tubo di uscita (collegato tramite un rubinetto a 3 vie per un tubo di efflusso verticale, 6 cm di altezza). Assicurarsi che il tessuto non sia ridotto al minimo o troppo rilassati dopo incannulamento per evitare interferenze con le misurazioni e le analisi future.
- Registrare la lunghezza del colon misurando la distanza tra prossimali e distali cannulazioni utilizzando un righello di 15 cm. Questo è importante per interpretare variazioni di lunghezza di contrazione, velocità di propagazione e punti contrazione iniziazione.
- Assicurare una pressione stabile di base del lume (cm H 2 O) è stabilito prima di iniziare l'esperimento. Calcolare pressione luminale misurando la distanza verticale dal tessuto al menisco di soluzione fisiologica all'interno del tubo di vetro di serbatoio di afflusso (orale) e il tubo di efflusso verticale (anale).
- Mantenere preparati tissutali a pressione intraluminale costante (ad esempio, 1-2 cm H 2 O) assicurando che la pressio afflusso tappo ciecore è mantenuta costante e che non blocchi sono presenti nel set up.
- Lasciare il colon ad equilibrarsi in soluzione salina fisiologica per 30 minuti prima di registrare i movimenti intestinali. Verificare la presenza di eventuali blocchi derivanti nei tubi in- o deflusso e rimuoverli applicando pressione attraverso il serbatoio di afflusso o da ri-cannulating le estremità orali e anali del colon.
3. Acquisizione Immagine e il protocollo sperimentale
- Movimenti intestinali record come file video con una videocamera (30 fotogrammi / sec, 640 x 840 pixel) posizionati 10-15 cm al di sopra del bagno per organi in una storta di laboratorio standard supporto (figura 1).
- Aprire Virtual Dub (video software per la cattura) dalla icona sul desktop. Dalla scheda 'File', selezionare 'capture AVI' per visualizzare l'immagine della telecamera. Nella scheda deselezionare 'Audio' 'consentire la cattura audio' disabilitare il suono.
- Nella scheda Video selezionare 'compressione' e 'DivX6.9.2. Codec & #39; per comprimere i file video per ridurre al minimo l'utilizzo di spazio di archiviazione. Questa funzione sarà disponibile sulla installazione del software di compressione 'DivX'.
- Regolare manualmente la posizione della fotocamera in modo che l'intero segmento del colon cannulato è visibile (con le regioni cannulated immediatamente adiacenti ai bordi verticali del fotogramma video) attraverso la finestra del software di acquisizione video (vedi Figura 1). Al fine di migliorare la qualità dell'immagine e ridurre al minimo i riflessi, fissare uno schermo di carta / cartone al supporto della fotocamera per bloccare la luce estranea sul bagno di organo. Ottimizzare la qualità video regolando le impostazioni di luminosità, contrasto e l'esposizione utilizzando l'interfaccia software della fotocamera.
- Prima della registrazione, impostare un nome di file specifico; nella scheda 'File', selezionare 'file di cattura Set' e specificare un nome univoco per il video.
- Iniziare la cattura video premendo 'file di Capture' dalla barra degli strumenti 'Capture'. Per interrompere Recording selezionare il pulsante 'Stop capture' o il tasto 'Esc' sulla tastiera.
- Sostituire la soluzione salina fisiologica contenuta nel serbatoio di afflusso con soluzione fisiologica salina fresca ogni 30 min.
- pressione Record luminale (vedi 2.9) e l'utilizzo di una sonda di temperatura, prendono atto della temperatura del bagno d'organo. Ripetere questi passaggi durante l'esperimento (ad esempio, ogni 30 minuti), al fine di garantire che queste variabili sono costanti.
- l'attività del colon Record in totale per 3 ore (compresa l'applicazione di droga e la durata washout). Per scopi di archiviazione dati, registrare i dati in segmenti video 15 min. Una completa esperimento in genere composto da registrazioni video 12 x 15 min.
- attività Record per 1 ora in condizioni di controllo (soluzione fisiologica).
- Applicare il farmaco (sia superfused nel bagno o somministrata nel lume attraverso il serbatoio di afflusso) per 30 minuti a 1 ora.
Nota: diverse vie di somministrazione possono yield effetti diversi 23. - Applicare fisiologica fresco al bagno o lume nel corso di un periodo di washout 1 ora.
4. Elaborazione dati e la generazione di mappe spazio-temporale
- Processo di ogni linea di registrazione video utilizzando il software in-house scritto in MATLAB (R2012a, la versione 7.4, disponibile a richiesta), al fine di generare mappe spazio-temporali che illustrano la motilità del colon.
- Aperto software di analisi dalla icona sul desktop.
- Nella finestra di comando, digitare "Analyse2" per aprire il pannello di controllo di analisi.
- Utilizzare la funzione di rilevamento dei bordi per generare mappe spazio-temporali cliccando su "rilevamento bordo per i file .avi" nella finestra del pannello di controllo. Questa funzione permetterà al software di analisi per leggere i video ricodificato in formato Audio Video Interleaved (AVI).
- Eseguire le seguenti operazioni in sequenza per generare mappe spazio-temporali utilizzando un adaalgoritmo di rilevamento dei bordi ptive.
- Aprire i file video registrati selezionando la scheda "Aggiungi file", selezionare 'Apri video' e selezionare la posizione dei file video.
- Dalle file video elencati all'interno del software di analisi, selezionare il file di interesse.
- Selezionare una regione rettangolare di interesse all'interno della cornice del video, ad esempio, l'intera lunghezza del colon, dal punto in cui il colon è cannulata oralmente alla cannulazione anale. Assicurarsi che i punti di incannulamento prossimale e distale sono adiacenti ai confini verticali della regione di interesse. Linee rilevamento dei bordi (rosso e verde) saranno automaticamente appaiono sovrapposta l'immagine in tempo reale su.
- Assicurarsi che le linee di soglia di rilevamento dei bordi sono immediatamente adiacente al colon su entrambi i limiti superiore e inferiore del tessuto colon (questo può essere ottimizzato per ogni video alterando valori di soglia di rilevamento sul pannello di controllo). Assicurarsi che il bordo di rilevamento lines sono continui lungo la lunghezza dell'immagine colon regolando il contrasto e luminosità utilizzando il pannello di controllo.
- Inserire l'intera lunghezza del colon (mm) nella finestra di dialogo larghezza (come registrato al punto 2.7). Quindi selezionare "Genera mappa di calore".
- Nella finestra pop-up, selezionare un percorso per il file da salvare e specificare un nome di file per la mappa spazio-temporale.
- Selezionare il formato '.su2' e selezionare 'Aggiungi alla coda'.
Nota: formato .su2 comprime i dati di un file di dimensioni più piccole e più file video possono essere aggiunti alla coda. - Seleziona 'Inizia il rilevamento' per generare mappe spazio-temporali.
5. Analisi di mappe spazio-temporale
- Utilizzare mappe spazio-temporali per stimare i parametri come la frequenza, la velocità di propagazione, la lunghezza e la durata di CMMCs, diametro intestinale e il punto di inizio e la direzione delle contrazioni.
- Per avviare l'analisi spazio-temporalemappe, tipo 'analyse2' nella finestra di comando, come descritto nella sezione precedente. Invece di "rilevazione Edge", selezionare il pulsante "Heat mappa di analisi".
- Aprire file mappa spazio-temporali (file .su2) selezionando la scheda 'Aggiungi file' e specificando la posizione dei file precedentemente ottenuti .su2.
- Una volta che la mappa spazio-temporale è visibile sullo schermo, specificare un intervallo di colori sul pannello di controllo, assicurando che il minimo è impostato su 1.
Si noti che il massimo può variare del 5-10 secondo la contrattilità del tessuto. - Seleziona 'gamma di colori di blocco' al fine di garantire tutte le mappe da un singolo esperimento sono analizzate nelle medesime condizioni.
- Verificare che le impostazioni del telaio di tempo sono costanti per tutte le mappe spazio-temporali di un dato esperimento.
- Al fine di determinare la frequenza CMMC, contare manualmente contrazioni che attraversano più del 50% della lunghezza del colon. Queste contrazioni possono essere visuazato come striature rosso / arancio (indice di colore standard HSV) sulla mappa spazio-temporale (vedi figura 2 per un esempio). Altri contrazioni che sono più o non si propagano possono anche essere identificati e quantificati.
- Se lo si desidera, condurre ulteriori analisi a una risoluzione maggiore di esse. Ad esempio, le proprietà dettagliate inclusa la velocità e la durata di ogni contrazione possono essere esaminati.
- Per misurare la velocità e la durata, selezionare il pulsante "Annota onde contrazione" sulla mappa di calore pannello di controllo analisi.
- Successivamente, lo zoom per ogni CMMC facendo clic sul pulsante "Zoom" e selezionando la zona di interesse. Quindi selezionare il pulsante "annotare manualmente" per annotare ogni contrazione usando il mouse per disegnare una linea dalla posizione più iniziale alla fine di ogni contrazione. Questo metodo può essere usato per misurare la velocità di propagazione apparente e la durata di dilatazioni che sembrano propagare (per esempio, vedere unaal fine di mappe in Figura 2A, 2B).
Nota: appariranno i dati per la velocità e la durata sotto la finestra dei risultati. Questi valori possono essere trasferiti ad un foglio di calcolo di interesse selezionando la scheda "Esporta dati". annotazioni indesiderati possono essere rimossi facendo clic sul pulsante "Rimuovi le annotazioni selezionati".
- Se lo si desidera, utilizzare il coordinate xey delle mappe spazio-temporali (tempo e posizione lungo il colon, rispettivamente) per determinare la posizione di apertura di piccole contrazioni o CMMCs.
- Allo stesso modo, al fine di determinare gli intervalli tra le contrazioni, utilizzare la funzione "Annota" per misurare la durata tra le contrazioni. Come in precedenza, questi risultati possono essere esportati in un foglio di calcolo selezionando la scheda "Esporta dati".
- Al fine di misurare la larghezza intestino riposo, selezionare il pulsante "Take sezione" sul pannello di analisi cartina calore.
- Seleziona 'Aggiungi9; sul pannello sezioni trasversali temporale. Fare doppio clic in qualsiasi posizione all'interno della mappa per generare una linea orizzontale sovrapposta alla mappa di calore. Dati diametro Gut verranno visualizzati in una nuova finestra.
- Per misurare il diametro dell'intestino, posizionare il cursore su un picco e di valle adiacente per ottenere larghezza media intestino per una condizione sperimentale specifica. Cambiamenti di diametro budello possono essere confrontati tra le condizioni sperimentali.
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Representative Results
Fino al 90% dei pazienti con ASD sperimentare una vasta gamma di disturbi gastrointestinali, come diarrea e costipazione 18,24,25. Tuttavia, le cause di questi problemi gastrointestinali sono sconosciuti. Molte mutazioni identificate nei pazienti con ASD sono associati a proteine sinaptiche che contribuiscono ad alterazioni e disturbi nella trasmissione o la funzione sinaptica. Una tale mutazione, nel gene che codifica per la molecola di adesione delle cellule neuroligin-3 (NL3 R451C), è stato identificato in due fratelli con ASD 17. Questa mutazione risultati in un residuo di arginina alla posizione 451 della proteina neuroligin sostituiti con cisteina. Topi NL3 R451C che esprimono questo spettacolo mutazione aumentato trasmissione mediata GABA nella corteccia somatosensoriale 16,26 a fianco di una maggiore attività mediata dai recettori AMPA e NMDA all'interno dell'ippocampo 25,27.
28-30. Poiché il sistema nervoso enterico svolge un ruolo importante nella regolazione della funzione gastrointestinale, abbiamo ipotizzato che la mutazione R451C interesserebbe motilità. Pertanto, al fine di studiare possibili alterazioni funzionali gastrointestinali dovuti ad anomalie sinaptiche abbiamo cercato di esaminare gli effetti della mutazione R451C sulla frequenza CMMC in questi topi.
Poiché la serotonina (5-HT) agisce sul ENS di modulare la funzione gastrointestinale nei topi 6 abbiamo analizzato modelli motilità in risposta alla 5-HT 3/4 antagonista del recettore tropisetron in preparazioni colon di topi WT e NL3 R451C.
Per valutare se la mutazione sinaptica altera CMMCs quando il sistema nervoso enterico è farmacologicamente perturbato, l'antagonista del recettore 5HT 3/4 Tropisetron (Trop;10 micron, che blocca sia 5HT3 e 5HT 4 recettori) è stata aggiunta al bagno contenente i preparativi del colon (figura 2). Il tessuto del colon da diciannove anni topi abbinato maschio (11 WT e 8 NL3 R451C) è stato utilizzato. In presenza di tropisetron, topi NL3 R451C hanno mostrato una diminuzione della frequenza CMMC rispetto al littermates WT. Esempi rappresentativi di mappe spazio-temporali che mostrano CMMCs e attività contrattile in preparati colon WT e NL3 R451C sono mostrate nelle Figure da 2A a 2E, rispettivamente. Anche se nessuna differenza è stata osservata tra il WT e NL3 R451C durante condizioni di controllo, tropisetron significativamente ridotto la frequenza CMMC sia nei topi WT e NL3 R451C (Figura 2C, 2F). Nei topi WT, il numero mediano di CMMCs era 23 in condizioni di controllo rispetto a 15 nel tropisetron (p = 0,023). Nei topi NL3, il numero medio di CMMCs in condizioni di controllo era 19,5rispetto 2 in presenza di tropisetron (p = 0,022). Inoltre, tropisetron avuto un effetto maggiore sulla frequenza di CMMCs nei topi NL3 R451C rispetto al WT (p = 0,047).
Figura vasca 1. Organo allestimento e generazione di mappe spazio-temporali. (A) Un segmento gastrointestinale appena sezionato viene posto in un bagno per organi (vista in sezione trasversale) contenente soluzione salina fisiologica e cannulata alle estremità orali ed anali. La cannula orale è collegato ad un serbatoio di afflusso riempito con soluzione salina fisiologica e la cannula anale collegato ad un tubo di efflusso. Una videocamera è posizionata sopra la vasca organo per registrare l'attività contrattile del colon. (B) la motilità viene convertito ad alta risoluzione spazio-temporali regioni etichettatura mappe del colon che sono dilatate nelle regioni blu e ristretti in rosso. (C) Una mappa spazio-temporale che mostra motilità del colon (CMMCs) da un WT topo adulto. CMMCs individuali sono indicati come le regioni rosse verticali all'interno della mappa. L'asse X mostra il tempo crescente (0-15 min). L'asse Y rappresenta la posizione spaziale lungo il segmento del colon (anale alla base, per via orale in alto). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. mappe spazio-temporali mostrano un aumento della sensibilità al Tropisetron in NL3 R451C colon del mouse mappe spazio-temporale che mostra la frequenza CMMC nei segmenti del colon dai controlli WT (A) e in presenza di Tropisetron. (Trop; B). Trop ridotta frequenza CMMC a WT due punti (C). Spatiote mappe mporal da NL3 colon in condizioni di controllo (D) e in presenza di Trop (E). Trop causato una forte riduzione della frequenza CMMC in NL3 colon (F). frequenza CMMC in risposta a Trop era significativamente ridotto in NL3 rispetto WT colon (p = 0,047, non mostrato). larghezza Gut (colore dei pixel) è indicato sull'asse Y (unità arbitrarie, range 1-6). barra della scala in E si applica a tutte le mappe. trop; Tropisetron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Schema del bagno per organi. (A) Vista dall'alto, (B) Lato inferiore, (C) Vista frontale, (D) Vista laterale, di un bagno per organi due camerata istituito. Dimensioni in mm.ref = target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando questa tecnica di imaging video, frequenza CMMC è stata misurata come un'indicazione di motilità del colon in topi wild-type e NL3 R451C, un modello murino di spettro autistico disturbo 17. I nostri risultati indicano una riduzione del numero di CMMCs nei topi mutanti NL3 R451C rispetto ai topi wild-type in presenza del 5HT 3/4 antagonista del recettore Tropisetron suggerendo che i topi NL3 R451C mostrano una maggiore sensibilità agli Tropisetron. Di conseguenza, proponiamo che il neuroligin-3 R451C mutazione altera la via della serotonina, potenzialmente modulando sia la funzione 5HT 3 o 4 5HT recettore nei neuroni enterici, la mucosa o entrambi. Ciò evidenzia il valore del metodo per l'identificazione delle differenze fenotipiche tra genotipi e per l'identificazione di obiettivi specifici per gli studi successivi.
Questo metodo può essere modificata per migliorare la risoluzione spaziale acquisendo video tramiteuno stereo-microscopio dotato di una fotocamera di montaggio. Questo approccio consente registrazioni da effettuare da piccole preparazioni del tratto gastrointestinale in momenti embrionali già nel E12.5 31. Neuromodulatori possono essere applicati tramite il lume o nel bagno organo esterno alla preparazione del colon. Inoltre, questo metodo è utile per valutare grandi e piccoli motilità gastrointestinale in una gamma di specie, tra cui topi, ratti e cavie.
risoluzione di passaggi comuni per questo metodo includono la verifica del flusso della soluzione attraverso il tubo, la vitalità della preparazione dei tessuti, mantenimento della pressione luminale costante e garantendo che colon segmenti si trovano lontano dalle pareti del bagno per organi. I blocchi all'interno del tubo può alterare la pressione luminale e prevenire il verificarsi contrazioni; pertanto tutti i tubi devono essere puliti accuratamente per rimuovere i cristalli di sale o detriti materia / fecale prima incannulamento. L'aria deve essere rimosso da linee tubi direttamente associata con la cannula prima esperimenti (cioè, di adescamento i tubi con soluzione fisiologica). Inoltre, le preparazioni di tessuto devono essere maneggiati con cura al fine di evitare danni con conseguente immobilità del colon. Per evitare danni ai tessuti, assicurarsi che il colon è saldamente (ma non strettamente) attaccato alla cannula durante il processo di registrazione e mantenere una temperatura costante e un flusso continuo di CO 2 + O 2 al bagno. Assicurarsi inoltre che la pressione del lume viene mantenuta costante e che non le contrazioni sono avviata manualmente regolando bacini di afflusso durante il periodo di registrazione. Assicurarsi che il tessuto del colon non tocchi il muro del bagno per organi durante le contrazioni in modo da evitare il rilevamento dei bordi analisi delle relative mappe spazio-temporali. Ciò può essere evitato monitorando le contrazioni durante il periodo di equilibrazione e regolando la posizione del colon per evitare che questo si verifichi durante l'esperimento.
_content "> Diverse limitazioni associate con questa tecnica dovrebbero essere prese in considerazione per cui analizzare e interpretare i dati, compresi il basso natura portata di questo approccio. Mentre il metodo è efficace per identificare i cambiamenti nella migrazione schemi motori, non è in grado di determinare se dilatazioni che si verificano durante la progressione di una CMMC sono neuromediato o semplicemente risposte passivi alla attività contrattile (cioè, risultante dalla circolazione di fluido). i gradienti di concentrazione per diffusione attraverso la parete del colon consentono gli effetti dei farmaci luminally applicati da ascrivere ad azioni all'interno mucose, ma negli esperimenti prolungati degenerazione della mucosa può verificarsi alterando così i siti di azione di questi farmaci durante il periodo di registrazione. Inoltre, se i farmaci hanno effetti distinti nelle mienterici e sottomucosa plessi non può essere determinato con questo metodo. al contrario, questo approccio consente una valutazione collettiva degli effetti sul ne entericaSistema rvous misurando un cambiamento generale nei modelli di motilità. Altre considerazioni includono la necessità di prendere in considerazione la natura dei dati (ad esempio, dati di conteggio per la frequenza CMMC e richiede un'analisi non parametrica) e la bassa frequenza di CMMCs, nella progettazione di esperimenti e opportune strategie di analisi dei dati.Recentemente, Barnes e colleghi hanno proposto che il tessuto del colon richiede la stimolazione al fine di osservare CMMCs 32, tuttavia i risultati di nostro laboratorio dimostrano che CMMCs spontanee possono essere osservati semplicemente appuntare il tessuto al bagno organo attraverso il mesentere 7 pubblicato. La presenza di CMMCs in queste condizioni dimostra non solo la spontaneità di CMMCs, ma insiste ulteriormente sulla utilità di questa tecnica per determinare le variazioni motilità del colon. Sebbene questo approccio è applicabile alle regioni extra-colon del tratto gastrointestinale, la complessità di piccola motilità intestinale richiede più detaffliggesse strategie di analisi rispetto a quelli utilizzati per la quantificazione CMMCs 33.
Questo approccio sperimentale è molto alta risoluzione spaziale e temporale e include la possibilità di somministrazione di farmaci sia esterna e dentro il lume per studiare gli effetti delle variazioni gradienti di concentrazione sul sistema nervoso enterico. Inoltre, questo metodo è adatto per analizzare piccola segmentazione intestinale durante lo stato alimentato 6,23. La natura ex vivo di questo metodo permette il ruolo del sistema nervoso enterico essere valutata in assenza di ingressi del sistema nervoso centrale ed è quindi un modo ideale per indagare la motilità gastrointestinale in una varietà di modelli, compresi i modelli genetici di malattie (vedere Figura 2) 6,34.
Questo metodo può anche essere utilizzato per confrontare i dati fisiologici a simulazioni al computer di attività motoria 23,33,35. Tali simulazioni in grado di prevedere schemi motori asotto forma di mappe spazio-temporali per i confronti diretti con gli esperimenti fisiologici 33,35. Utilizzando Fast Fourier Transform ed analisi wavelet 36, il contributo di pacemaker muscolari lisce (generato dalle cellule interstiziali di Cajal) alla motilità può essere estratto. Inoltre, questa tecnica di imaging video può essere combinato con registrazione extracellulare di attività elettrica nel muscolo 3 per consentire contributi di neurale e generatori di pattern myogenic essere distinti. Nota, il metodo di registrazione extracellulare risolve potenziali inibitori giunzione in assenza di contrazioni muscolari lisce o rilassamenti.
Mentre questa tecnica è ben consolidata per l'analisi della motilità gastrointestinale in una vasta gamma di preparazioni e specie, ha anche il potenziale per essere utilizzata in altri sistemi quali lo studio di vasocostrizione nel mesentere (precedentemente analizzato mediante un sistema di tracciamento di diametro più semplice 37) enel muscolo scheletrico.
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Acknowledgments
JCB e ELH-Y sono stati sostenuti dal Dipartimento della Difesa statunitense CDMRP Programma Autism Research (AR11034). NHMRC (1047674) per ELH-Y.The maggio Stewart Bursary-Università di Melbourne fiducia finanziato borse di studio a MS. Ringraziamo Ali Taher, Fátima Ramalhosa e Gracia Seger per i contributi tecnici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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