Abstract
장용성 신경계 (ENS)가 위장관 운동성 조절에 중요한 역할을 독립적 중추 신경계 기능 할 수있다. ENS 기능의 변화는 GI 증상과 질병의 주요 원인이며, 자폐증을 포함한 신경 장애에보고 GI 증상에 기여할 수있다. 잘 격리 대장 세그먼트 대장 이주 모터 단지 (CMMCs)로 알려진 자연, 리듬 수축을 생성하는 것으로 설정됩니다. 절차는 마우스 콜론의 생체 준비가 설명되어 전에서 CMMCs의 장 신경 규제를 분석합니다. 콜론은 동물로부터 해부 이전 기관 화장실에서 유관되기 배설물 콘텐츠를 삭제 플러시됩니다. 데이터는 장기 조 위에 배치 비디오 카메라를 통해 취득한 실내 소프트웨어 패키지를 통해 고해상도 시공간지도로 변환된다. 이 기술 기준 수축 패턴과 대장의에서 ENS 기능에 약리학 적 효과 사용egments은 3 ~ 4 시간에 걸쳐 비교 될 수있다. 또한 CMMCs 전파 길이 및 속도 장 직경 수축 주파수의 변화뿐만 아니라, 기록 될 수있다. 이 기술은 형질 전환 마우스 모델 (쥐와 기니피그를 포함하여 다른 종에서) 위장관 운동 패턴을 특성화하는 데 유용합니다. 이러한 방식으로, CMMCs의 약리학 유발 변화는 야생형 마우스와 자폐증 Neuroligin -3- R451C 마우스 모델에 기록된다. 또한,이 기술은 십이지장, 공장과 회장과 쥐를 포함하여 다른 발달 연령대 위장관의 다른 영역에 적용될 수있다.
Introduction
장용성 신경계 (ENS)가 위장관 극한 신경 네트워크 인 장과 같은 내용의 소화, 영양소의 흡수 및 분비 유체의 재 흡수와 같은 다양한 기능을 변조한다. ENS의 뉴런은 myenteric 및 점막하 plexuses에 있습니다. myenteric 신경 얼기는 점막하 신경총 반면 위장관 운동 1 조절에 중요한 역할을 분비 2,3의 제어에 주로 참여하고있다. myenteric 신경 얼기는 위장 벽의 길이 원형 근육 층 사이에 위치해 있습니다. 장 벽의 평활근 층의 수축 활성 혼합 부위 (3)의 길이 방향을 따라 장 콘텐츠를 추진하여 위장관의 주요 기능을 용이하게한다. CNS에서 위장관에 외부 신경 공급 장치는 생체 내에서 위장 기능에 기여하지만상기 ENS 독립적 위장 기능을 조절할 수있다. 이 독특한 특징은 기능성 장 신경 회로의 조사 및 생체 위장관 운동에 기여를 할 수 있습니다.
대장 마이그레이션 모터 단지 (CMMCs)는 배설물 펠렛 4-9의 부재에 고립 된 마우스 콜론에서 관찰 된 주된 모터 패턴입니다 자연, 신경 인성 이벤트입니다. CMMCs는 10 (직장에 맹장에서, 예) 적어도 콜론의 절반 전체 길이의 수평 거리를 따라 전파 리듬 수축으로 정의됩니다. CMMCs 분변 펠릿 추진 수축 패턴 사이의 관계가 아직 명확하게 확립 될 그러나 일부 약리학 차이 (11)이보고되었다. 그럼에도 불구하고, CNS 독립적으로 기능 할 ENS의 능력 IS에 신경 매개 모터 패턴의 존재olated 대장은 기본 ENS 장애로 인한 운동에 장애를 검사 할 수있는 이상적인 분석 시스템을 제공한다. 위장 운동 패턴의 자발성은 약리학 적 자극에 응답 기능 변화가 평가 될 수 있습니다.
비디오 이미징 시공간 맵핑의 사용 제 정량적 기니피그 12 소장의 연동 운동을 조사하기 위해 개발되었다. 여기서, 생체 외 기술은 고해상도를 구성하는 비디오 이미징이 녹화 분석을 사용하여 마우스 대장 운동 패턴 조사를 가능하게한다는 설명 (~ 100 μm의 33 밀리 초) 결장을 따라 위치의 함수로서 대장 직경 맵 시간 (시공간지도)의. 사내 에지 검출 소프트웨어 사용 (Analyse2, 요청시 제공)을 실시간으로 계약 전체 길이 대장 세그먼트의 데이터는 각 실험에 대한 시공간 맵을 생성하는 처리됩니다. 이 단계에서, 비디오 (AVI) 파일이다 최우수통해서 인증 및 Analyse2를 사용하여 시공간지도로 변환. 시공간지도 (그림 2) 시간이 지남에 따라 수축력을 묘사하고 전파 속도, 크기, 길이, 시간을 포함하여 여러 매개 변수를 측정 할 수 있습니다. 굿 직경은 조직 세그먼트의 전체 수축의 척도로서 실험 기간에 걸쳐 기록된다. 이 방법은 변형 된 장용성 신경 연결을 나타낼 수 수축성 착체의 개시 시점의 차이를 식별하는 데 적용될 수있다.
기니 피그에서 펠렛 추진력을 평가하기위한 유사한 비디오 이미징 프로토콜 그러나 여기에서는 (펠릿의 부재, IE) 자발 결장 운동성 정량 비디오 촬영 방법의 응용 윤곽 (13)에보고되었다. 또한 비디오 촬영 방법에 대한 해부 위장 조직의 준비를 돕기 위해 상세 내용을 제공한다. 이프로토콜은 유전 마우스 모델을 포함 질환의 동물 모델에서 위장 기능의 장 신경 제어를 분석하는 접근하고 쉽게 복제 도구와 연구자를 제공합니다.
비디오 이미징 기술은 다양한 약리학 적 제제에 응답 대장 운동의 분석을 가능하게한다. 약물 제제 결장 외부 장 루멘 또는 기관 욕을 통해 투여 될 수있다. 마우스 위장관의 다른 지역은 대장에서 소장 분할 및 CMMCs으로 특정 운동 패턴을 나타낸다.
이 기술은 소장 함수 균주의 차이를 식별하는 데 사용되었다; 5-HT 3 및 5-HT 4 길항제 차동 감도 때문에 6 개의 균주에서 발현 TPH2 유전자의 다형 특성을 Balb / C 및 C57 / BL6 마우스의 소장에서 관찰되었다. 운동성에 대한 5-HT의 억제 효과는 콘 유지troversial, 충돌 데이터가 대장 연동 운동과 CMMCs 14, 15에 내인성 5-HT의 중요성에보고 된 바와 같이. 운동성 전 및 출생 7 개발 중에 변경, 질병 (10)의 동물 모델에서 위장관 운동에 유전자 돌연변이의 효과는 비디오 영상을 이용하여 조사 할 수있다. 여기에서 우리는 시냅스 접착 단백질 Neuroligin-3 (16)을 코딩하는 Nlgn3 유전자의 과오 돌연변이를 표현 자폐증의 NL3 R451C 마우스 모델에서 대장 운동의 연구 방법의 사용을 보여줍니다. 이 돌연변이는 첫 번째 강하게 GI 부전 18-22와 관련된 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) (17), 진단 환자에서 확인되었다. 우리 NL3 R451C 시냅스 돌연변이 비디오 이미징 기술을 사용하여 신경 ENS에 출력에 영향을 미치는지 알아 보았다. 우리는 기준선 및 세로토닌 5H에 응답 CMMCs 특성화 데이터를 제시T 3/4 수용체 길항제 tropisetron 자폐증의 NL3 R451C 마우스 모델에서.
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Protocol
동물 처리 및 동물의 자궁 전위 모든 실험 이전했다 엄격 멜버른 대학의 동물 실험위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행 (윤리 ID : 1212494.7)
1. 조직 수집 및 해부
- 자궁 전위에 의해 성인 쥐를 안락사. 가능하면 관심의 신경 세포 인구에있는 수용체를 통해 장 기능에 영향을 방지하기 위해 마취를 피할 수 있습니다.
- 몸을 고정, 동물의 총 체중을 기록 피하 주사 바늘을 (크기 : 20 G)를 사용하여 견고하게 해부 보드 (네 발을 통해 복부 측면은 실험에 노출).
- 해부 집게와 가위를 사용하여; 하복부 근육 층을 중첩 표피를 통해 절개를합니다. 흉골에 복부의 정중선을 따라 복강을 열고 집게와 가위를 계속 사용합니다.
- 조직의 탈수를 방지하기 위해, 그 풍모를 부어학적 식염수 (크렙스 용액 118의 NaCl, CaCl2를 1.2 황산, 하나의 NaH 2 PO 4, 25의 NaHCO3 4.6의 KCl, 2.5, (11) D- 글루코스 밀리미터로 - carbogen 가스 RT으로 발포, 95 % O 2, 5 해부 과정에서 일정한 간격 (즉, 모든 30 ~ 60 초)에서 복부 내용 상에 20 분의 최소)에 대한 %의 CO 2.
- 맹장과 직장에 연결된 상태에서 콜론을 분리, 미세 해부 가위를 사용하여 장간막을 트리밍하면서 부드럽게 약 4-5cm 동물의 몸 위에 해부 집게를 사용 (콜론의 기단부에 인접) 맹장를 개최합니다.
- 취급 않도록주의 늘리거나 인접 장간막을 제거하는 동안 위장 조직을 잘라.
- 초과 조직 (즉, 방광 및 고환)를 제거합니다. 거친 해부 가위를 사용하여, 두 개의 수직 절개 (즉, 중간 선에서 약 0.5 cm)이 개에 골반 뼈를 절단 할 수 있도록콜론의 채널 측면.
- 골반 조직에 인접한에서 직장을 분리 결장에서 근육을 둘러싼 트림 미세 가위를 사용합니다.
- (이전에 carbogen와 산소) 생리 식염수가 들어있는 비커에 (직장에 맹장에서) 전체 길이 콜론을 놓고 실온에서 산소를 계속한다. 미세 해부 가위를 사용하여 맹장과 직장을 제거하고 비커에 교체합니다.
- 빈 배설물 펠렛 / 생리 식염수로 채워진 200 μL 피펫 팁에 연결된 5 ㎖ 주사기를 사용하여 경구 끝에 부드러운 양압을 적용하여 결장의 장내 콘텐츠 제제. 향후 조직을 배향하기 위하여, 점막 줄무늬가 보이 대장의 가장 기단부를 표시하는 곤충 핀을 사용한다.
- 면도날을 사용하여 넓은 / 기단부의 약 1cm을 제거하여 5 ㎖ 주사기 맞게 플라스틱 피펫 팁을 수정한다. 중앙에서 절단하여 원위 / 작은 단부를 넓혀, 유량을 증가시키기면도날을 사용하여 제작 (대략 45 ° C).
- 그립을 부드럽게 해부 포셉과의 기단부의 대장 조직, 루멘을 통해 대장 및 세척 생리 식염수의 루멘에 피펫 팁을 삽입합니다.
비디오 영상에 대한 대장의 조직과 실험 세트 최대 2. 준비
- 200 μL 피펫 팁에 부착 된 주사기를 사용하여 설정이 챔버 장기 목욕 (그림 1과 그림 3)에 연결된 모든 튜브를 통해 세척 생리 식염수. 이 단계는 액의 흐름을 차단할 수 배관 내의 이물질을 제거한다. 튜브에 대한 사양은 재료 표를 참조하십시오.
- (5 ㎖ 분 -1의 유량, 95 % O 2 5 % CO 2) 장기 목욕의 챔버가 지속적으로 carbogen 버블 생리 식염수에 superfused되어 있는지 확인합니다. 일정한 간격으로 온도 센서를 이용하여 확인 temperat목욕 URE 33 ° C -37 ° C 사이에서 유지된다.
- 약 20 내지 30 ㎖의 생리 식염수 50 ㎖ 주사기를 이용하여 주입 관에 3 방향 코크를 통하여 접속 유입 저장조를 채운다.
- 실험이 진행되는 동안, 그 중심에 삽입 유리관 (내경 5mm)와 스토퍼 arubber 사용 유입 저장조 내의 압력을 유지한다. 유입 저수지의 상부 개구 안전하게 (내부 유리관이 개봉 나머지으로) 밀봉되어 있는지 확인합니다.
- 완전히 생리 식염수에 빠져들되어 있는지 확인하고, 장기 목욕 챔버로 콜론 (길이 5-7cm)을 놓습니다.
- 두 수중 입구 / 출구 관에 결장 세그먼트의 각 단부 Cannulate (입구 / 다른 직경의 배출 튜브 조직 루멘 등의 크기에 따라 변경 될 수있다. 산후 조직 성인 마우스 및 기니피그) 조 사용 표준을 면 재봉사. 취입 관에 결장의 기단부를 부착배출관로 결장의 말단부 (수직 유출 관에 3 방향 코크를 통하여 접속, 높이 6cm). 조직 삽관 미래의 측정 및 분석의 간섭을 피하기 위해 후하지 심하게 잡아거나 너무 편안 있는지 확인합니다.
- 근위 및 15cm 눈금자를 사용 삽관 선단부 사이의 거리를 측정하여 대장의 길이를 기록한다. 이 수축 길이 전파 속도와 수축 개시 포인트의 변화를 해석하는 것이 중요하다.
- 실험을 시작하기 전에 설립 안정된 기준 내강의 압력 (cm의 H 2 O)를 확인합니다. (경구)의 유입 탱크 수직 유출 관 (항문)의 유리관 내에서의 생리 식염수를 메 니스 커스에 조직으로부터의 수직 거리를 측정함으로써 내강의 압력을 계산한다.
- 일정한 관내 압력에서 조직 준비를 유지한다 (예를 들어, 1-2cm H 2 O) 보장에 의한 유입 스토퍼 실 pressu다시 일정하게 유지 않고 막힘이 셋업에 존재하지 않는 것이다.
- 장 운동을 녹음하기 전에 30 분 동안 생리 식염수에 평형을 콜론을 둡니다. IN- 또는 유출 튜브에서 발생하는 방해를 확인하고 유입 저수지를 통해 압력을 적용하거나 대장의 구강 및 항문 끝을 다시 cannulating에 의해 제거합니다.
3. 이미지 캡처 및 실험 프로토콜
- 비디오 카메라를 이용하여 영상 파일로서 기록 장 운동 (30 프레임 / 초, 640 × 840 픽셀) 표준 실험실에서 레토르트 기관 욕을 10 내지 15 센티미터 (도 1) 스탠드의 위치.
- 바탕 화면의 아이콘에서 가상 더빙 (비디오 캡처 소프트웨어)를 엽니 다. '파일'탭에서 카메라 영상을 볼 수 있습니다 '캡처 AVI'를 선택합니다. '오디오'탭을 선택 해제에 사운드를 해제하는 '오디오 캡처 수 있도록'.
- 비디오 탭에서 '압축'과 'DivX6.9.2을 선택합니다. 코덱 & #39; 저장 공간의 사용을 최소화하는 비디오 파일을 압축한다. 이 기능은 압축 소프트웨어 'DivX를'설치에 사용할 수있게됩니다.
- 전체 결장 삽관 세그먼트는 비디오 캡처 소프트웨어 창을 통해 (상기 비디오 프레임의 수직 에지에 바로 인접 영역으로 삽관)을 볼 수 있도록 수동으로 카메라의 위치를 조정 (도 1 참조). 이미지 품질을 개선하고, 반사를 최소화하기 위해, 기관 욕에 외광을 차단하는 카메라 지지체 종이 / 판지 실드를 부착. 카메라 소프트웨어 인터페이스를 이용하여 휘도, 콘트라스트 및 노출 설정 값을 조정하여 비디오 품질을 최적화한다.
- 녹음하기 전에 특정 파일 이름을 설정; '파일'탭에서 '설정 캡처 파일'을 선택하고 비디오의 고유 한 이름을 지정합니다.
- '캡쳐'도구 모음에서 '캡처 파일'을 눌러 비디오 캡처를 시작합니다. recordin를 중지하려면g을 '캡처 중지'버튼 또는 키보드의 'Esc'키를 선택합니다.
- 신선한 생리 식염수 매 30 분으로 유입 저수지에 포함 된 생리 식염수를 교체합니다.
- 기록 내강의 압력 (2.9 참조) 온도 프로브를 사용은 장기 목욕 온도의 주를 가지고. 이러한 변수가 일정한 것을 확인하기 위해 실험 (즉, 매 30 분)에 걸쳐 이러한 단계를 반복합니다.
- (약물 응용 프로그램과 세척 시간 포함) 3 시간 동안 총 기록 대장 활동. 데이터 저장을 위해, 15 분의 비디오 세그먼트의 기록 데이터 용. 전체 실험은 전형적으로 12 X 15 분간 비디오 레코딩 구성 될 것이다.
- 제어 조건 하에서 1 시간 (생리 식염수) 녹음 활동.
- 1 시간 30 분 동안 약물 (어느 유입 저장조 통해 욕에 superfused 또는 내강 내로 투여)를 적용한다.
참고 : 관리의 다른 경로를 수 y로다른 효과 (23)의 ield. - 1 시간 세척 기간 동안 목욕이나 루멘에 신선한 생리 식염수를 적용합니다.
시공간지도 4. 데이터 처리 및 생성
- 과정은 MATLAB로 작성된 사내 소프트웨어를 사용하여 각각의 비디오 녹화 오프라인, 위해 (R2012a 버전 7.4의 요청에 따라 가능) 대장 운동을 설명 시공간 맵을 생성합니다.
- 바탕 화면의 아이콘에서 열기를 분석 소프트웨어.
- 명령 창에서 분석 제어판을 열기 위해 "Analyse2"를 입력합니다.
- 제어 패널 윈도우에서 "아비 파일 에지 검출"을 클릭하여 시공간 맵을 생성하는 에지 검출 기능을 이용한다. 이 함수는, 오디오 비디오 인터리브 (AVI) 형식의 비디오 레코딩을 읽고 분석 소프트웨어를 사용한다.
- ADA를 이용하여 시공간 맵을 생성하기 위해 순차적으로 다음 단계를 수행ptive 에지 검출 알고리즘입니다.
- "파일 추가"탭을 선택하여 열기 녹화 된 비디오 파일은 '동영상 열기'를 선택하고 비디오 파일의 위치를 선택합니다.
- 분석 소프트웨어 내에 나와있는 비디오 파일에서 관심있는 파일을 선택합니다.
- 콜론 항문 삽관 경구 삽관 된 지점에서, 비디오, 예를 들면 대장의 전체 길이의 프레임 내의 관심 영역의 사각형을 선택. 근위 및 원위 삽관 포인트는 관심 영역의 수직 경계에 인접한 있는지 확인합니다. 에지 검출 선 (적색 및 녹색)이 자동으로 실시간 영상에 나타날 것이다.
- 에지 검출 임계치 라인 결장 조직의 상부 및 하부 경계 모두에서 대장 (이 조작부 검출 임계 값을 변경하여 각각의 비디오에 대해 최적화 될 수있다)에 바로 인접하여 있음을 보장한다. 확인 에지 검출 L 그네스 명암 및 밝기를 조절 조작부를 사용하여 결장 영상의 길이를 따라 연속적이다.
- 폭 대화 상자에 콜론 (mm)의 전체 길이 (단계 2.7에 기록 된대로)를 입력합니다. 그런 다음 "열 맵을 생성"을 선택합니다.
- 파일이 저장 될 때까지 팝업 창에서 위치를 선택하고 시공간지도의 파일 이름을 지정합니다.
- '.su2'형식을 선택하고 '대기열에 추가'.
참고 .su2 포맷은 파일 크기 및 다수의 비디오 파일이 큐에 추가 될 수있는 데이터를 압축한다. - 시공간 맵을 생성하기 위해 '검색을 시작하기'를 선택합니다.
시공간지도 5. 분석
- 이러한 주파수, 전파 속도, 길이, CMMCs 기간, 장 직경 시작과 수축 방향의 지점으로 매개 변수를 추정하기 위해 시공간지도를 활용합니다.
- 시공간 분석을 시작하려면지도는 명령 창에 입력 한 'analyse2'이전 섹션에 설명 된대로. 대신 "에지 검출"의, "히트 맵 분석"버튼을 선택합니다.
- '파일 추가'탭을 선택하고 이전에 .su2 얻은 파일의 위치를 지정하여 열기 시공간 맵 파일 (.su2 파일).
- 시공간 맵이 화면에 표시되면, 최소 1로 설정되는 것을 보장 조작부 색상 범위를 지정.
최대 조직의 수축에 따라 5-10 배열 할 수 있습니다. - 동일한 조건에서 분석 한 실험에서 모든 맵을 보장하기 위해 '잠금 색상 범위'를 선택합니다.
- 시간 프레임 설정이 주어진 실험에서 모든 시공간지도에 대해 일정 있는지 확인합니다.
- CMMC 주파수를 결정하기 위해 수동으로 결장의 길이의 50 % 이상을 통과 수축을 계산. 이러한 수축은 visua 될 수 있습니다시공간지도에 레드 / 오렌지 줄무늬 (표준 HSV 색상 색인)로하게 안정적 (예를 들어 그림 2 참조). 짧은 또는 전파되지 않는 기타 수축도 확인하고 정량화 할 수있다.
- 원한다면,이 맵으로부터 높은 해상도로 더 해석을 수행. 예를 들어, 각 속도와 수축의 지속 기간을 포함하여 상세한 특성을 조사 할 수있다.
- 속도 및 지속 기간을 측정하기 위하여, 열지도 분석 조작부 "수축 파 주석 '버튼을 선택한다.
- 다음으로, "줌"버튼을 클릭하고 관심 영역을 선택하여 각 CMMC을 확대. 그런 다음 각 수축의 끝 부분에 가장 초기 위치에서 선을 그립니다 마우스를 사용하여 각 수축에 주석을 "수동으로 주석"버튼을 선택합니다. 이 방법은 전파 나타나는 딜레이 션의 외관상의 전파 속도 및 시간을 측정하는데 사용될 수있다 (예를 들면, 볼그림 2A, 2B)의지도 알 끝.
참고 : 속도와 지속 시간에 대한 데이터가 결과 창에 표시됩니다. 이 값은 "데이터 내보내기"탭을 선택하여 관심의 스프레드 시트로 전송할 수 있습니다. 원하지 않는 주석은 "선택한 주석을 제거"버튼을 클릭하여 제거 할 수 있습니다.
- 원한다면, 작은 수축 또는 CMMCs의 개시 위치를 결정하는 X 및 시공간 맵 Y 좌표 (결장 따라 시간과 위치를 각각)을 이용한다.
- 마찬가지로 수축 사이의 간격을 결정하기 위해, 수축의 지속 기간을 측정하는 "주석"기능을 사용한다. 이전에, 이러한 결과는 "데이터 내보내기"탭을 선택하여 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다.
- 휴식 장내 폭을 측정하기 위하여, 열지도 분석 패널 "단면을 가지고 '버튼을 선택한다.
- 선택 '추가9; 시간적 단면 패널. 맵 내의 임의의 위치에서 더블 클릭하면 열지도에 중첩 수평 라인을 생성합니다. 굿 직경 데이터는 이제 새로운 창에 표시됩니다.
- 장 직경을 측정하기 위해 특정 실험 조건에 대한 평균 장 폭을 얻기 위해 피크 인접한 통에 커서를 배치. 장 직경의 변화는 실험 조건 사이에 비교 될 수있다.
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Representative Results
ASD 환자의 90 %까지 설사, 변비 18,24,25 포함한 위장 장애의 배열을 경험한다. 그러나 이러한 위장관 문제의 근본 원인은 알려져 있지 않다. ASD 환자에서 확인 된 많은 돌연변이 시냅스 단백질이 시냅스 전달 또는 기능에 변경 및 장애에 기여과 연결되어 있습니다. 그러한 돌연변이는 세포 부착 분자 neuroligin -3- (NL3의 R451C)를 코딩하는 유전자에 ASD 17 개의 형제로 확인되었다. Neuroligin 단백질의 위치 451의 아르기닌 잔기 이러한 돌연변이 결과 시스테인으로 대체된다. 이 돌연변이 쇼를 표현 NL3 R451C 마우스는 해마 25, 27 내에서 증가 AMPA와 NMDA 수용체 매개 활동과 함께 체 감각 피질 16,26에서 GABA 중재 전송을 증가했다.
28-30에 존재한다. 장용성 신경계 위장 기능을 조절하는데 중요한 역할을한다, 우리는 R451C 돌연변이 운동에 영향을 미치는 것으로 가정했다. 따라서, 이상에 의한 시냅스 위장 기능의 변화 가능성을 조사하기 위해, 우리는 이러한 마우스 CMMC 빈도 R451C 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 노력했다.
세로토닌 (5-HT)은 쥐 6 위장 기능을 조절하는 ENS에 작용하기 때문에 우리는 WT와 NL3 R451C 마우스의 결장 준비의 5-HT 3/4 수용체 길항제 tropisetron에 대한 응답으로 운동 패턴을 분석 하였다.
장 신경계는 약리학, 5HT 3/4 수용체 길항제 교란 될 때 시냅스 돌연변이 CMMCs을 변경 여부를 평가하려면 Tropisetron (TMP를;블록 5HT3 및 5HT 4 수용체 모두) 결장 제제 (도 2)를 함유하는 욕에 첨가하고 10 μM. 열 아홉 나이 일치 남성 마우스 (11 WT 8 NL3의 R451C)에서 대장 조직을 사용 하였다. tropisetron의 존재 NL3 R451C 마우스는 WT 한배 새끼에 비해 CMMC 주파수의 감소를 보였다. WT 및 NL3 R451C 대장 제제에 CMMCs 및 수축 활성을 나타내는 시공간지도의 대표적인 예는 각각 2E에도 2a에 도시된다. 차이는 제어 조건 동안 WT 및 NL3 R451C 사이 관찰되지 않았지만, tropisetron 크게 모두 WT 및 NL3 R451C 마우스 (도 2C, 2F)에 CMMC 주파수를 감소시켰다. WT 생쥐에서 CMMCs의 평균 수는 tropisetron 15 (P = 0.023)에 비해 제어 조건 (23)이었다. NL3 마우스에서, 제어 조건에서 CMMCs의 평균 수는 19.5이었다tropisetron의 존재 (P = 0.022)에 비해 2. 또한 tropisetron는 WT (p = 0.047)에 비해 NL3 R451C 생쥐 CMMCs 빈도에 큰 영향을 미쳤다.
그림 1. 장기 목욕 설정 및 시공간지도의 생성. (A) 갓 해부 위장 세그먼트가 장기 목욕 (단면도)의 생리 식염수를 포함에 넣고 구강 및 항문 끝에서 유관된다. 구강 캐 뉼러 생리 식염수 및 유출 관에 연결 항문 뉼러 가득 유입 저장조에 연결된다. 비디오 카메라가 결장의 수축 활성을 기록하기 위해 장기 조 위에 배치된다. (B) 운동은 파란색과 수축 지역 커지기 대장의 높은 해상도 시공간지도 표시 영역으로 변환됩니다 전n 개의 빨간색. (C) 성인 WT 마우스에서 대장 운동 (CMMCs)를 보여주는 시공간지도. 개인 CMMCs는지도에서 붉은 수직 영역으로 표시됩니다. X 축은 시간을 증가 (0-15 분)을 나타낸다. Y 축 (기본, 상단의 구강에서 항문) 공간 콜론 세그먼트를 따라 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 시공간지도 NL3 R451C 마우스 콜론의 Tropisetron에 대한 민감도를 증가 보여 시공간지도 WT 컨트롤 (A)에서 콜론 세그먼트와 Tropisetron의 존재 CMMC 주파수를 게재합니다. (TMP를, B). TMP를 WT는 콜론 (C)에 CMMC 주파수를 감소시켰다. Spatiote NL3 결장에서 mporal지도 제어 조건 (D) 아래 및 TMP를 (E)의 존재. 군더더기는 NL3 콜론 (F)의 CMMC 주파수에 강한 감소를 일으키는 원인이되었다. TMP를의 질문에 답변 CMMC 주파수가 크게 WT 결장에 비해 NL3 감소했다 (P = 0.047, 도시하지 않음). 굿 폭 (픽셀 색상)을 Y 축 (임의 단위 범위 1-6)에 표시된다. E의 스케일 바는 모든 맵에 적용됩니다. 군더더기; Tropisetron입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
장기 목욕의 그림 3. 도식. (A) 상위 뷰, (B) 밑면 설정, 두 개의 챔버 장기 목욕 (C) 전면 뷰, (D) 측면보기. mm의 크기.심판 = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53828/53828fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 비디오 이미징 기술을 사용하여, CMMC 주파수 야생형 결장 운동성 표시 및 NL3 R451C 마우스 자폐증 스펙트럼 장애 (17)의 마우스 모델로 측정 하였다. 우리의 결과는 NL3 R451C 쥐는 Tropisetron에 감도 증가를 나타낼 것으로 제안 5HT 3/4 Tropisetron 수용체 길항제의 존재 하에서 야생형 마우스에 비해 돌연변이 NL3 R451C 생쥐 CMMCs 수의 감소를 나타낸다. 이에 따라 neuroligin -3- R451C 돌연변이 잠재적 장용성 뉴런 점막 또는 모두 5HT 3 5HT 4 수용체 기능 중 하나를 조절함으로써, 세로토닌 경로를 바꾸는 것을 제안한다. 이 유전자형 사이 및 후속 연구를위한 특정 목표의 식별을위한 표현형 차이를 식별하기위한 방법의 가치를 강조한다.
이 방법을 통해 비디오를 인수하여 공간 해상도를 향상시키기 위해 수정 될 수있다카메라가 장착 된 스테레오 현미경 마운트합니다. 이 접근법은 기록 이르면 E12.5 31 배아 시점에서 위장관 작은 제제로 제조 될 수있다. 신경 조절은 루멘을 통해 제제 또는 결장 외부 기관 욕에 적용될 수있다. 또한,이 방법은 마우스, 래트 및 기니피그를 포함 종의 범위에서 크고 작은 위장관 운동을 평가하는데 유용하다.
이 방법에 대한 일반적인 문제 해결 단계는 튜브를 통해 솔루션의 흐름, 조직 준비의 생존 일정 내강 압력의 유지를 확인하고 세그먼트가 떨어져 장기 목욕의 벽에서있는 그 대장을 보장하는 것을 포함한다. 튜브 내에서 방해가 내강의 압력을 변경하고 발생 수축을 방지 할 수 있습니다; 따라서 모든 튜브 삽관 전에 소금 결정 또는 파편 / 찌꺼기를 제거하기 위해 철저하게 청소해야합니다. 에어 튜브 라인에서 제거해야합니다 직접 실험 (예, 식염수 튜브 프라이밍에 의해) 이전에 캐 뉼러와 연관된. 또한, 조직 제제 결장 부동 결과 손상을 막기 위해 조심스럽게 취급되어야한다. 조직 손상을 피하기 위해, 결장 확고하다 (그러나 밀접되지 않은) 기록 과정 캐뉼라에 부착되도록하고 항온 욕조에 CO + O 2 (2)의 연속 공급을 유지한다. 또한 내강 압력이 일정하게 유지되는 것을 확인하고, 수축 수동 기록 기간 유입 저장소를 조정함으로써 개시 없는지. 이 관련 시공간지도의 에지 검출 분석을 차단하므로 대장 조직이 수축하는 동안 장기 목욕의 벽에 접촉하지 않도록하십시오. 이것은 평형 기간 동안 수축을 모니터링하고 실험 기간 동안 발생하는 것을 방지하는 결장의 위치를 조정함으로써 회피 할 수있다.
_content "> 분석이 방법의 낮은 처리량 특성을 포함한 데이터를 해석 할 때,이 기술과 연관된 몇 가지 제한이 방법은 모터 패턴 마이그레이션의 변화를 식별하는 데 효과적이지만,이 딜레이 션 중에 발생 여부를 결정할 수있다. 고려에주의해야 CMMC의 진행은 neurally. 결장 벽에 걸쳐 확산 농도 구배 luminally인가 약물의 효과 내의 활동에 기인 할 수 있도록 (즉, 유체의 이동으로 인한) 수축 활동 수동적 반응을 매개하거나 단순히 점막 있지만 장기간 실험 점막 변성함으로써, 기록 기간에 걸쳐 이러한 약제의 작용 부위를 변화가 발생할 수있다. 또한, 약물이 방법을 사용하여 결정될 수 myenteric 점막하 plexuses에 뚜렷한 효과가 있는지 여부. 대조적으로,이 방법은있게 장 북동에 효과 집단 평가운동 패턴의 전반적인 변화를 측정하여 rvous 시스템. 또한 고려 고려 데이터의 특성을 수행 할 필요성을 포함하는 실험에 적절한 데이터 분석 전략을 설계 할 때, 그리고 CMMCs의 저주파수 (즉, 비 - 파라 메트릭 분석을 필요 CMMC 주파수의 데이터를 카운트).최근 바네스와 동료들은 그러나 우리가 실험실에서 연구 결과 자연 CMMCs 단순히 장간막 (7)를 통해 장기 욕조에 조직을 고정하여 관찰 할 수 있음을 입증를 발표, 대장 조직이 CMMCs 32 관찰하기 위해 자극이 필요하다는 제안했다. 이러한 조건 CMMCs의 존재뿐만 아니라 CMMCs의 자발성을 설명하지만,이 방법의 유용성에 상술한다은 대장 운동의 변화를 설정. 이 방법은 위장관 여분 결장 영역에 적용될 수 있지만, 작은 장 운동의 복잡성보다 DET을 필요CMMCs 33 정량화 사용되는 것보다 분석 전략 ailed.
이러한 실험 방법은 매우 높은 시공간 해상도를 갖는 외부 및 장용성 신경계에 농도 기울기를 변화의 효과를 조사하는 내부 루멘 두 약물 전달 옵션을 포함한다. 또한,이 방법은 공급 상태 6,23 동안 소장 분할을 분석하기에 적합하다. 이 방법의 생체 외 특성은 (도 참조 질환의 유전 적 모델을 포함하여 다양한 모델에서 위장관 운동을 조사하는 적합한 방법은 중추 신경계의 입력 부재 평가되어야 장용성 신경계의 역할을 할 수 있으며 그러므로 2) 6,34.
이 방법은 또한 모터 작동 23,33,35의 컴퓨터 시뮬레이션에 생리 데이터를 비교하기 위해 사용될 수있다. 이러한 시뮬레이션은 모터 패턴을 예측할 수있다생리 학적 실험 33, 35와 직접 비교를위한 시공간지도의 형태. 웨이 브릿 변환 및 분석 36 고속 푸리에 변환을 이용하여 운동하는 (Cajal의 간질 세포에 의해 생성 된) 평활근 페이스 메이커의 기여는 추출 될 수있다. 또한, 동영상 촬영 방법은 신경 및 근육 조직 패턴 발생기 기여 구별 할 수 있도록 근육 (3)에 전기적 활동의 세포 외 기록과 결합 될 수있다. 세포 외 기록 방법 평활근 수축 또는 이완이 없을 억제 접합 전위 해결 참고.
이 기술은 잘 준비 및 종의 광범위한 위장관 운동의 분석을 확립하지만, 또한 이전에 단순한 직경 추적 시스템을 통해 분석 장간막에서의 수축에 대한 연구 (같은 다른 시스템에 사용될 수있는 잠재력을 가지고 37) 및골격 근육에서.
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Acknowledgments
JCB 및 ELH-Y는 국방 CDMRP 자폐증 연구 프로그램의 미국학과 (AR11034)에 의해 지원되었다. 멜버른 신뢰의 ELH-Y.The 월 스튜어트 또한 Bursary - 대학 NHMRC (1047674)는 MS에 장학금을 후원. 우리는 기술적 공헌 알리 타 헤르, 파티마 Ramalhosa 및 그라시아 시거 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
| 732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
| STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
| SYRINGES with Luer Lock Tips 50 ml, 20 ml, 10 ml | Terumo Medical Corporation | N/A | |
| 1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
| 1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) - Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (ID) - Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
| Graduated Laboratory Glass Bottles - 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65 mm | |||
| CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 mm x 32 mm | |||
| Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
| Logitech Webcam | Logitech | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Virtual Dub - 1.9 11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| Logitech Webcam Software | Logitech |
References
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