Summary
Her beskriver vi en metode for å uttrykke og rense høy kvalitet norovirus utstå (P) domener i E. coli for anvendelse ved røntgenkrystallografi studier. Denne fremgangsmåten kan anvendes for andre calicivirus P domener, så vel som ikke-strukturelle proteiner, f.eks., Viralt genom proteinbundet (VPG), protease, og RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp).
Abstract
Den norovirus kapsid er sammensatt av et enkelt større strukturell protein, betegnet VP1. VP1 er inndelt i et skall (S) domene og et fremstikkende (P) domene. S domene danner en sammenhengende stillas rundt viral RNA, mens P domene former virus pigger på S domene og inneholder determinanter for antigenisitet og vert-celle interaksjoner. P domene binder karbohydratstrukturer, altså., Histo-blodtypeantigener, som antas å være viktig for norovirus-infeksjoner. I denne protokollen beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av høykvalitets norovirus P domener i høye utbytter. Disse proteinene kan deretter brukes for røntgenkrystallografi og ELISA for å studere antigenisitet og vert-celle-interaksjoner.
P-domenet blir først klonet inn i en ekspresjonsvektor og deretter uttrykt i bakterier. Proteinet blir renset ved bruk av tre trinn som involverer immobilisert metall-ion-affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi. Iprinsippet er det mulig å klone, ekspress, rense og krystallisere proteiner i mindre enn fire uker, noe som gjør denne protokollen et hurtig system for å analysere nylig nye norovirus stammer.
Introduction
Menneske noroviruses er den viktigste årsaken til akutt gastroenteritt på verdensbasis en. Disse virusene tilhører caliciviridae familien, som det er minst fem slekter, inkludert Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, og Nebovirus. Til tross for sin høye innvirkning på helsevesenet og bred distribusjon, er studiet av menneskelige noroviruses hemmet av mangel på en robust cellekultur system. Til dags dato er det ingen godkjente vaksiner eller antiviral strategier tilgjengelig.
Den norovirus store kapsidprotein, betegnet VP1, kan deles inn i et skall (S) domene og et fremstikkende (P) domene 2. P-domenet er koblet til S-domenet ved et fleksibelt hengsel (H) region. S-domenet danner et stillas rundt det virale RNA, mens P-domenet danner den ytterste del av det virale kapsid. P domene samler inn biologisk relevante dimer når det uttrykkes i bakterier. P dimer samhandler med karbohydratstrukturer, kalt histo-blodtypeantigener (HBGAs) som er til stede som løselige antigener i spytt og på enkelte vertsceller 3. P domene-HBGA interaksjon antas å være viktig for infeksjon 4. Faktisk en fersk rapport avslørte betydningen av syntetiske HBGAs eller HBGA-uttrykke bakterier for mennesker norovirus-infeksjon in vitro fem.
Gjeldende studier angående vertscellefesting av noroviruses er hovedsakelig utført med viruslignende partikler (VLP) som kan uttrykkes i insektceller eller med rekombinante P domener uttrykt i Escherichia coli (E. coli). For å forstå P domene-HBGA interaksjoner på atom oppløsning, kan P domene HBGA komplekse strukturer løses ved hjelp av røntgenkrystallografi. Her beskriver vi en protokoll for P domene ekspresjon og rensing som tillater produksjon av P-domenet i høy kvantitet og kvalitet til å bli brukt for X-ray crystallography. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for andre calicivirus P domener og ikke-strukturelle proteiner.
P domenet er kodonoptimaliserte for E. coli-ekspresjon og klonet inn i en standard overføringsvektor. P domene blir deretter på nytt klonet inn i en ekspresjonsvektor som koder for et polyhistidin (His) tag og et mannose-bindende protein (MBP) som er etterfulgt av et protease spaltningssete. MBP-His-P domene fusjonsprotein blir uttrykt i E. coli, etterfulgt av tre rensetrinn. MBP-His-P domene fusjonsproteinet ble renset ved hjelp av immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC). Deretter blir fusjonsproteinet spaltes med humant rhinovirus (HRV) 3C protease og P-domenet er skilt fra MBP-His ved et ytterligere IMAC rensetrinn. Til slutt, P domene renset ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Den rensede P domene kan deretter brukes for røntgenkrystallografi. Screening av protein krystallisering forhold er gjengivelseRMED med kommersielt tilgjengelige screening kits med ulike P domeneproteinkonsentrasjoner. Krystallvekst observeres, og de mest lovende betingelsene er optimalisert.
Med de metoder som er beskrevet her, er det mulig å gå fra gen til protein for å strukturere i løpet av mindre enn fire uker. Derfor er vår fremgangsmåte for P domene uttrykk, rensing og krystallisering egnet for å studere norovirus-vert interaksjon på molekylært nivå og gir viktige data for å hjelpe til med opp-to-date vaksine utforming og medikament-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. P Domain Cloning
- Bestem P domene kodende region ved sekvenssammenstillingen av norovirus stammer (f.eks GII.10 belastning, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Dessuten fjerner den fleksible området ved den C-terminale enden av den P-domenet (figur 2A). Kodon-optimalisere DNA for E. coli uttrykk og inkluderer BamHI (N-terminal) og Noti- (C-terminal) restriksjonsseter i orden til sub-klone P domene kodende region inn i pMalc2x ekspresjonsvektor 6,7.
Merk: P domene kodende området er optimalisert og syntetisert av en kommersiell tjeneste. P domene kodende region (innsats) er ca 1 kb i lengde og leveres i en standard overføringsvektor. - Fordøye 2 ug av den overføringsvektor med hver 1 pl BamHI (20 000 U / ml) og Notl (10 000 U / ml) restriksjonsenzymene i 1 time ved 37 ° C med produsenten som følger buffere.
- Separer fordøyd innsatsen på en 1% agarosegeli 20 minutter ved 135 V og rense det innsatte DNA fra gelen ved å bruke et kommersielt kit.
- Klargjør pMalc2x ekspresjonsvektoren ved å spalte 2 pg av denne vektor med hver 1 pl BamHI (20 000 U / ml) og Notl (10 000 U / ml) restriksjonsenzymene i 1 time ved 37 ° C. Rens vektor fra en agarose-gel som beskrevet ovenfor (1,3). Merk: Begge prøver (1,2 og 1,4) kan oppbevares ved -20 ° C.
- Ligere den rensede innsatsen i spaltet pMalc2x vektoren ved BamHI og Notl-restriksjonssetene med 1 pl T4-DNA-ligase (400 000 U / ml) i 15 minutter ved romtemperatur (RT) (figur 2B og 2C). Bruk minst 20 ng av pMalc2x vektor og en vektor: insert-forhold på 1: 3 (molekylvekt). Sammenbindingsblandingen blir vanligvis ~ 20 mL.
- Transform 2 pl av ligeringsblandingen inn i 50 ul kjemisk kompetent E. coli DH5a bakterieceller ved hjelp av en standard transformasjonsprotokoll (10 min på is, varmesjokk 45 sek ved 42 ° C) og vokse i 600pl SOC-medium i 1 time ved 37 ° C. Sentrifuger de transformerte cellene i 3 minutter ved 1000 xg, kaste supernatanten og resuspender pelleten i 30 pl av SOC-medium.
- Plate transformasjonsblandingen på LB-agarskåler inneholdende 100 ug / ml ampicillin for utvelgelse, og vokse over natten ved 37 ° C. Velg minst fem kolonier.
- For hver av de fem kolonier, inokulere 2-3 ml kultur av LB-medium supplementert med 50 pg / ml ampicillin (LB-amp) og vokse ved risting over natten ved 160 rpm ved 37 ° C.
- Utdrag plasmidene fra natten kultur ved hjelp av et kommersielt kit. Bekrefte tilstedeværelsen av P-domenet innsatsen ved sekvensering med en pMalc2x forover primer (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') og revers primer (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').
2. P Domain Expression
- Transform 1 pl (150 ng / mL - 400 ng / mL) av pMalc2x vektor som koder for MBP-His-P domenefusjonsproteinet inn i 50 pl av kompetente E. coli BL21-celler ved anvendelse av en standard transformasjonsprotokoll (10 min på is, varmesjokk 45 sek ved 42 ° C) og vokse i 600 pl SOC-medium i 1 time ved 37 ° C. Subkultur i 120 ml LB-amp over natten ved 160 rpm og 37 ° C.
- Inokuler ni liter (f.eks, 6 x 5 L kolber med 1,5 l medium hver) av LB-amp med subkultur (1: 100). Dyrke cellene rysting ved 160 rpm og 37 ° C inntil OD 600 når 0,4 til 0,6. Deretter senkes temperaturen til 22 ° C i ~ 1 time og deretter indusere proteinekspresjon med 0,66 mM isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) 8. Dyrke cellene over natten ved 22 ° C (~ 18 timer).
Merk: Temperaturen kan varieres, men vi anbefaler å bruke 22 ° C eller lavere. - Høste cellene ved sentrifugering (10 543 xg, 15 min, 4 ° C). Kast supernatanten og fryse cellepelleten ved -20 ° C.
st rensetrinnet og proteasespaltingssete
- Forbered buffere som brukes i løpet av proteinrensetrinn fra forrådsoppløsninger for å sikre reproduserbarhet og stabilitet av forsøkene. Fremstille fire forskjellige buffere for immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC), hver inneholdende en forskjellig konsentrasjon av imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM og 250 mM). For SEC, fremstille en gel-filtreringsbuffer (GFB) med en høyere saltkonsentrasjon, men uten imidazol. Bruke avionisert vann og filtrere alle buffere før anvendelse med en porestørrelse på 0,45 um.
Merk: For en detaljert buffer forberedelse ordningen, se tabell 1. - Tine cellepelleten fra ni liter kultur og oppløses i 150 ml PBS ved 4 ° C. Sonikere cellesuspensjonen tre ganger i 2 min (strøm 130 W, amplitude 20%, pulsfrekvensen 50%) for å forstyrre cellene. Hold cellesuspensjonen på is under lydbehandling.
- Centrifuge den sonicated cellesuspensjonen (43 667 xg, 30 min, 4 ° C) for å separere celleavfall fra supernatanten inneholdende uttrykte protein. Samle supernatanten og kast pellet.
- Vask og i likevekt 10 ml (= 1 kolonnevolum [CV]) oppslemning av nikkel (Ni) -NTA agarose perler med 10 mM imidazolbuffer i en kromatografikolonne. Tilsett ekvilibrert Ni perlene til supernatanten fra trinn 3,3 inneholdende uttrykte MBP-His-P domene fusjonsprotein og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C med langsom rotasjon.
- Etter inkubasjon gjelde hele Ni-kule-proteinblanding til en kromatografikolonne. Vask kolonnen langsomt med hver 5 CV 10 mM, 20 mM og 50 mM imidazol-buffere, som starter med 10 mM, deretter 20 mM og 50 mM siste (figur 3A).
- Eluer MBP-His-P domene fusjonsprotein ved anvendelse av 250 mM imidazolbuffer (figur 3A). Under eluering, sjekk OD 280nm å verifisere eluering av fusjonsproteinet (økningen i OD 280nm). Fortsett eluering til OD 280nm synker til ~ 0,1. Vask kulene med store mengder av 250 mM imidazolbuffer (minst 10 CV-er), etterfulgt av minst 10 CV 10 mM imidazol buffer. Redd perler for andre rensetrinnet (§ 4).
- Bekrefte nærværet av MBP-His-P domene fusjonsprotein med SDS-PAGE ved anvendelse av en 12% SDS-polyakrylamid-gel (10 x 8 cm) 9 (figur 3A). Utføre gel-elektroforese ved 45 A og 200 V i 45 minutter.
- Konsentrer (for eksempel ved bruk av en kommersiell konsentrator) det eluerte MBP-His-P domene fusjonsprotein til en endelig konsentrasjon på ~ 3 mg / ml. Spalter MBP-His-P domene fusjons med HRV-3C protease under dialyse mot 2 liter 10 mM imidazolbuffer (~ 1: 100) over natten ved 4 ° C (figur 3A). Avhengig av det endelige volum av konsentrert protein, utføre dialyse i en dialyse kassett eller dialyserør.
Merk: Mengden av HRV-3C protease for proteinspaltingen er beregnet i henhold til den spesifikke protease-aktivitet (2 U / mL, i en U tilstrekkelig til å spalte 100 ug protein) og mengde av eluert fusjonsprotein som varierer på ekspresjonsnivået og kan anslås fra SDS-PAGE-resultat (3,7 ).
4. 2. Rensing Step
- Stabilisere Ni-perler fra trinn 3,6 i 10 mM imidazol buffer.
- Inkuber dialyserte proteinet fra trinn 3,7 (inneholdende spaltet P-domenet, MBP-proteinet, og HRV-protease) med den ekvilibrerte Ni-kuler (4.1) i 30 minutter ved 4 ° C med langsom rotasjon.
- Påfør Ni-perle-blandingen til en kolonne og samle gjennomstrømnings (spaltet P domene) (figur 3B). Måle konsentrasjonen av proteinet som det kommer ut av kolonnen inntil OD-280 nm har nådd ~ 0,1.
Merk: MBP-His bør forbli bundet til Ni-perler (Figur 3B). - Sjekk at det finnes spaltede P domene ved å bruke SDS-PAGE med en2% gel som beskrevet ovenfor (figur 3B). Konsentrer den eluerte P domenet til ~ 3 mg / ml og dialyser over natten ved 4 ° C mot GFB for påfølgende SEC rensing.
5. 3. Rensing Step
- Vask pumper og rør av HPLC-rensesystemet og pre-likevekt SEC-kolonne (se Materialer List) med GFB.
- Injisere P domenet til kolonnen ved en strømningshastighet på 1 ml / min ved hjelp av et Superloop (opptil 12 ml) eller sløyfe (opp til 3 ml), avhengig av volumet av den konsentrerte prøven. Etter at injeksjonen er ferdig, øke strømningshastigheten til 2,5 ml / min.
- Som OD øker og P-domenet kommer ut av kolonnen, samler fraksjoner på 1,5 ml. Sjekk fraksjoner ved hjelp av SDS-PAGE med en 12% gel (Figur 4A og 4B). Pool bare de reneste fraksjoner og konsentrer til ~ 3 mg / ml og ~ 8 mg / ml.
Merk: Etter ~ 110 ml (tomrommet volum) de fleste urenheter eluert fra en SEC-kolonne med 320 ml seng volum. DeP domene blir vanligvis eluert som en dimer. Elueringstid / volum av P-domenet dimer er avhengig av karakteren prep (s) av SEC-kolonnen.
6. Krystallisering av P Domain
- Med P domene på ~ 3 mg / ml og 8 mg / ml for innledende krystallisering screening. Forbered minst 100 ul P domene per konsentrasjon for første skjermer med 384 kommersielt tilgjengelige screening forhold. Utføre screening ved 18 ° C i en 96-brønners plateformat, der reservoaret inneholder 100 ul av mor-oppløsning og en dråpe er sammensatt av 0,2 ul mor-løsning og 0,2 ul protein.
- Gjenta og optimalisere vellykkede krystallisering forhold. Bruk derfor 15-brønners plater som inneholder 3 rader. Sette opp den første rekke med 100% mor-løsning, den andre raden med 90% mor-løsning og 10% vann, og den tredje rad med 80% mor-løsning og 20% vann. Bruke en dråpestørrelse på 2 pl (1 ul protein + 1 ul mor oppløsning) og 50081; l mor løsning som et reservoar volum.
- Bruk optimalisert krystall vilkår for kokrystallisere P domene med ligander. Forbered plater som beskrevet i 6.2. I stedet for 2 ul dråpe størrelse, satt opp dråper inneholdende 1 pl mor-oppløsning, 1 ul protein, og 1 ul av ligand i en konsentrasjon på 1 mg / ml.
- Samle data sett med enkle krystaller ved hjelp av synkrotronstråling. Utfør molekylær erstatning ved hjelp av publiserte P domenestrukturer med høy sekvenslikhet som første søk modell 6,10-13.
Merk: Tilstedeværelse av en ligand viser seg som un-modellert blob av elektrontetthet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk av den beskrevne protokoll er vist i figur 1. Protokollen omfatter 6 hoveddeler som omfatter kloning av målgenet, ekspresjon, en tre-trinns rensing og krystallisasjon. Figur 2 viser utformingen av ekspresjonskonstruksjonen (EC) og egenskapene til pMalc2x ekspresjonsvektoren. Sekvensen av det multiple kloningssete (MCS) av pMalc2x vektoren viser restriksjons og protease-spaltningsseter. Figur 3 viser representative SDS-PAGE resultatene av MBP-His-P domene fusjonsprotein og spaltet P domene med de tilsvarende skjematisk av de to første trinn på rensing. Den tredje rensetrinn er vist i figur 4 og omfatter et renseskjema elueringen kromatogram av renset P domene og et representativt SDS-PAGE resultat av oppsamlede fraksjoner. De reneste fraksjonene (i henhold til SDS-PAGE) blir slått sammen, Konsentratered, og som brukes for røntgenkrystallografi.
Figur 1. Skjematisk av Norovirus P Domene Ekspresjon og rensing. Protokollen for norovirus P domene ekspresjon og rensing inneholder seks hoveddeler, som dekker kloning og ekspresjon (1 og 2), rensing (3 til 5), og krystallisering (6.). Røde trekanter representerer P-domenet (-gen og protein), mens blå rektanglene representerer MBP-His. Ni-NTA agarosekuler som brukes under IMAC (3 og 4) er vist som store kuler cyan. SEC perler er avbildet som grå kuler.
Figur 2. Design og Kloning av Expression Construct (EF). P domene EC, Ekspresjonsvektor kartet, og det multiple kloningssete (MCS) er vist. A) Justering av norovirus kapsidprotein (VP1) og P-domenet EF som illustrerer utformingen av EF med den C-terminale delesjon (grønn). B ) Skjematisk fremstilling av pMalc2x ekspresjonsvektoren brukt for P domene ekspresjon i E. coli med ampicillin-resistens kassett (AMPR), lac-operonet (lacl), mannose-bindende protein (Mann, MBP) og en MCS. C) Sekvens av MCS av pMalc2x ekspresjonsvektor. Uthevet er restriksjonsenzymkutteseter (røde bokser) og gjenkjenningssekvensen LEVLFQGP for HRV 3C protease (presisjon, blå boks).
Figur 3. Skjematisk og Representative Resultater for 1. og 2. Purreduser fuktighet trinn. Rensing oversikt og representative SDS-PAGE Resultatene er vist. A) Rensing av MBP-His-P domenefusjonsprotein bruker Ni-NTA agarose perler (store cyan kuler). Den 12% SDS-PAGE gel viser B) Separasjons MBP-His-P domenefusjonsprotein. Av MBP-His (blå firkant) fra kløyvde P domene (rød trekant). Eluering av spaltet P domenet er analysert ved SDS-PAGE på en 12% gel.
Figur 4. Skjematisk og Representative Resultater for 3. rensetrinnet. Kromatogram av P domene eluering med SEC og tilsvarende SDS-PAGE resultat. Svarte tall indikerer fraksjonene som er samlet inn. A) Skjematisk av separasjon på SEC-kolonne (SEC perler er avbildet som grå kuler). Den 12% SDS-PAGE viser protein som finnesi fraksjonene som samles inn i løpet av SEC eluering og som senere blir slått sammen og anvendt for røntgen-krystallografi. B) SEC Kromatogrammet viser den målte absorbans (sort linje) over elueringsvolum. Den røde linjen viser når P domenet ble injisert i SEC-kolonnen. C) Zoom inn på andre toppen av B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| buffer navn | 1 M Tris pH 7,6 | 5 M NaCl | 3,5 M Imidazole, pH 8 |
| 250 mM imidazol buffer | 20 ml | 40 ml | 71 ml |
| 50 mM imidazol buffer | 20 ml | 40 ml | 14 ml |
| 20 mM imidazol buffer | 20 ml 40 ml | 5,7 ml | |
| 10 mM imidazol buffer | 20 ml | 40 ml | 2,8 ml |
| GFB (Gel filtrering buffer) | 25 ml | 60 ml | - |
Tabell 1. Pipettering Ordningen for vanlige buffere som brukes under rensingen. Stamløsninger av Tris-HCl, er natriumklorid (NaCl), og imidazol fremstilt som beskrevet i overskriften av tabellen. Mengden av stamoppløsning som trengs for å fremstille 1 liter av den ønskede buffer i vann er representert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for uttrykket og rensing av norovirus P domener i høy kvalitet og kvantitet. Noroviruses er ikke godt studert og strukturelle data er kontinuerlig behov. Så vidt vi vet, har P domene produksjon ved hjelp av andre protokoller (f.eks GST-merket P domener) vært problematisk, så langt, og tilstrekkelige strukturelle data på norovirus-vert samhandling har vært mangler. Med metoden beskrevet her, har vi nylig bidratt vesentlig til forståelsen av de molekylære detaljene for norovirus karbohydrat bindende. Den foreliggende protokollen kan tilpasses til en rekke forskjellige proteiner. Imidlertid vellykket gjennomføring av denne protokollen avhenger av flere faktorer innenfor hver del av rensemetoden.
Utformingen av ekspresjonskonstruksjonen er det første trinnet av betydning. Vi utfører kodon-optimalisering av P-domenet ekspresjonskonstrukt for å forbedre ekspresjonen utbytte i E. coli og fjerne relepara- restriksjonsseter som er til stede i den kodende regionen. Dessuten fjerner vi et fleksibelt område i C-terminus som kan være ugunstig for proteinfolding under ekspresjon og protein pakking i løpet av krystalliseringen. Ekspresjon som MBP-fusjonsproteinet er et middel for å holde proteinet i oppløsning i løpet av ekspresjon.
Angå løselig protein uttrykk det er flere parametere som skal vurderes. E. coli BL21-stamme er optimalisert for høyt utbytte protein ekspresjon og derfor anvendt i denne protokollen. Ekspresjon blir utført over natten ved 22 ° C og en redusert mengde av IPTG blir brukt for induksjon. Dette er gunstig for kinetikken av proteinekspresjon og som et resultat, vil mindre protein aggregere i inklusjonslegemene på grunn av uriktig folding. Derfor er det viktig å kjøle ned kulturen til 22 ° C før induksjon av proteinekspresjon med IPTG. Hvis proteinutbytte er ikke tilfredsstillende, er det mulig å ytterligere redusere Temperature og justere mengden av IPTG.
Visse forsiktighet bør utvises angående rensing kolonner. I prinsippet kan Ni-perler brukes om igjen flere ganger. Imidlertid vil bindingsevne reduseres over tid. Hvis Ni-løsning mister sin standard blå farge, kan perlene bli strippet og lades ved å følge instruksjonene i produsentens håndbok. Videre er det viktig å opprettholde SEC-kolonnen i forsvarlig stand og rengjøres regelmessig for å tillate høy ytelse. Avhengig av proteinet størrelse som skal renses en annen prep karakter (s) av SEC-kolonnen bør velges. P domene dimer er ~ 65 kDa i størrelse og kan være godt adskilt fra forurensninger på ~ 100 kDa ved hjelp av en 75 pg kolonne, mens større proteiner kan være bedre separert ved anvendelse av en 200 pg kolonne.
Som en kombinasjon av optimalisert sekvens konstruksjon, ekspresjon og rensing prosedyre er det mulig å oppnå meget ren og høy kvalitet P domene ved bruk av vår method. På grunn av den høye kvalitet av den rensede P-domenet, ytterligere studier er egnet, inkludert vaksinasjon for antistoffproduksjon, NMR eksperimenter, og ELISA-baserte studier. Dessuten kan renset P-domenet anvendes for kompleksdannelse med Fab-antistoffer og Nanobodies 14,15. Så vidt vi vet, er dette den første protokoll som tillater P domene krystallisering i en høy gjennomstrømning måte og ved hjelp av denne protokollen, har vi bestemt over 20 komplekse strukturer av ulike norovirus og lagovirus P domener i kompleks med HBGAs 6,16.
Ifølge vår erfaring, kan protokollen være begrenset til proteiner opp til 65 kDa. Imidlertid kapsidproteiner av forskjellige caliciviruses 17 og ikke-strukturelle proteiner, slik som virusproteinet genom bundet (VPG), protease, og RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp) ble vellykket uttrykt og renset ved anvendelse av denne metoden (upublisert). Ved bruk av denne metoden for å kapsidproteiner av andre virus, it kan være nødvendig å variere og optimalisere flere parametere (f.eks., den imidazol konsentrasjonen av elueringsbufferen) for å få tilstrekkelig mengde protein. I tillegg kan forskjellige andre enn GFB (for eksempel PBS eller TBS) lager buffere bli testet for optimal proteinstabilitet.
De fleste av de analyserte konstruksjonene gitt i kubikk / platelignende krystaller, som diffraktert til høye oppløsninger. Derfor tilveiebringer den foreliggende protokoll et verktøy for å oppnå rent protein som krystalliserer godt. Så lenge det er nå robust cellekulturmodell tilgjengelig, innebærer denne metoden et vesentlig skritt for å bidra til forståelsen av norovirus-vertscelleinteraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W.
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al.
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
