Abstract
מנגנון translational, כלומר, polysome או polyribosome, הוא אחת הכונה ציטופלסמית הגדולות והמורכבות ביותר בתאים. Polysomes, שהוקם על ידי הריבוזומים, mRNAs, כמה חלבוני RNAs ללא קידוד, מייצג פלטפורמות משולבות שבו שולט translational להתקיים. עם זאת, בעוד הריבוזום נחקר באופן נרחב, ארגון polysomes עדיין חסר הבנה מקיפה. כך מאמץ רב נדרש כדי להבהיר ארגון polysome וכל מנגנון חדשני מלא translational שעשוי להיות מוטבע. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא סוג של מיקרוסקופיה בדיקת סריקה המאפשר רכישת תמונות 3D ברזולוציה של ננו. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) טכניקות, אחד היתרונות העיקריים של AFM הוא שזה יכול לרכוש אלף תמונות הם אוויר בתמיסה, מה שמאפשר את המדגם כדי להישמר בתנאים פיסיולוגיים ליד ללא כל צורך מכתים ותיקון פרופרוצדורות. כאן, פרוטוקול מפורט לטיהור המדויקת של polysomes ממוח עכבר בתצהיר שלהם על מצעים יציצו מתואר. פרוטוקול זה מאפשר הדמית polysome באוויר ואת הנוזלים עם AFM והשחזור שלהם כמו אובייקטים תלת-ממדיים. משלימים במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- (cryo-EM), השיטה המוצעת ניתן להשתמש בנוחות לניתוח polysomes ולומדים הארגון שלהם באופן שיטתי.
Introduction
הסינתזה של חלבון היא תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאים 1,2. לפיכך, אין זה מפתיע כי שכיחותם חלבון נשלטת בעיקר על translational ולא 3,4,5 רמת התעתיק. Polysome הוא המרכיב macromolecular היסוד הממיר את המידע mRNA לתוך readouts חלבוניים פונקציונלי. Polysomes ובכך מוכרים ככל מתחמי macromolecular שבו מספר פקדים translational להתכנס 6-13. למרות מאה מחקרים על מבנה הריבוזום 14- 16, תובנה המולקולריות המפורטות לתוך הדינמיקה של תרגום ואת הטופולוגיה של polysomes נתקלו עניין מוגבל. כתוצאה מכך, הארגון של מתחם polysomal ribonucleoprotein יליד ההשפעה הפוטנציאלית שלה על תרגום עדיין די בעיות מעורפלות. Polysomes עשוי להסתיר עדיין ארגונים ידועים הורה ופונקציונלי, פוטנציאל שיקוף נוקלאוזום מה לניהול עבודות אפיגנטייםls ייצג לתחום שעתוק. ואכן, החקירה של שערת מסקרן זה דורשת מחקרים נוספים וגישות טכניות חדשות. בקו הזה, טכניקות מבניות במיקרוסקופ כוח אטומי יכולים לשתף פעולה פורה לפענח מנגנונים חדשים לבקרת ביטוי גנים, בדומה למה הושג עבור הנוקלאוזום 17,18.
מאז גילויו של הריבוזום 14-16, מבנו התאפיין בהרחבת פרוקריוטים 19,20, שמרים 21 ולאחרונה ב -22 אנושיים, מתן התיאור המולקולרי של המנגנונים בבסיס סינתזת חלבון. Polysomes בתחילה הוכרו על הממברנה של reticulum endoplasmic, ויצר ארגונים גיאומטריים 2D טיפוסיים 14. כפי שהוזכר קודם לכן, הרכבת polysome לא מושא ריבית קבועה כמו המבנה הריבוזום. בעבר, polysomes נחקר בעיקרו על ידי transmission EM מבוסס טכניקות. רק לאחרונה, טכניקות קריו-EM איפשר שחזור 3D של polysomes מטוהרים ממערכות תרגום במבחנה 23-26, lysates הסלולר אדם 27 או בתאים 28. טכניקות אלו המוצעים מידע מעודן יותר על הארגון הריבוזום-הריבוזום ב polysomes 23, 26-28 ותיאור מולקולרי ראשוני של משטחי מגע של ריבוזומים סמוכים polysomes נבט חיטה 24. לפיכך, טומוגרפיה קריו-EM מאפשרת הגילוי של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום עם מולקולרי, אבל הוא נטל על ידי ושחזור שלאחר עיבוד נרחב מנתח הדורשים משאבי חישוביים כבדים לצורך הטיפול במידע. יתר על כן, כדי לקבל את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום, מפה נפתרה ביותר של הריבוזום נדרשה, וגם זה סוג של הריבוזום עזר זמין רק לכמה מינים. חשוב לציין, טומוגרפיה קריו-EM היא לא מסוגלת לזהות RNA בחינם. Therefבצר, טכניקות חדשות נדרשים להבין את הארגון באופן מלא של מכונות תרגום.
לצד קריו-EM, AFM הועסק גם ככלי שימושי עבור הדמיה ישירה של polysomes אאוקריוטים התחתון 29-33 ובני אדם 27. לעומת EM, AFM לא דורש קיבוע מדגם או תיוג. בנוסף, מדידות יכולות להתבצע בתנאים פיסיולוגיים ליד ועם האפשרות הייחודית של זיהוי הוא ריבוזומים בבהירות גדילי RNA עירום 27. הדמיה של polysomes היחיד יכולה להתבצע במהירות יחסית, קבלת אלף תמונות בבת ברזולוצית ננו עם מאמץ שלאחר עיבוד מעט לעומת העיבוד שלאחר נרחב וכבד ושחזור ניתוחי נדרש על ידי מיקרוסקופ קריו-EM. כתוצאה מכך, AFM טיפול נתונים וניתוח לא צריך תחנות עבודה יקרות וכוח מחשוב גבוה. ככזה, טכניקה זו אוספת מידע על צורות polysomal, מאפיינים מורפולוגיים (כגוןגובה, אורך ורוחב), צפיפויות הריבוזום, בנוכחות RNA חינם ומספר ריבוזומים לכל polysome 27 עם תפוקה גבוהה יותר מאשר-EM קריו. באופן כזה, AFM מייצג גישה חזק משלים טכניקות EM להציג polysomes 27.
כאן אנו מציגים צינור מלא מפני טיהור כדי ניתוח נתונים שבו AFM מוחל תמונה ולנתח polysomes במוח עכבר. הפרוטוקול המוצע מתמקד בנושאי טיהור ועל בתצהיר המדויק של polysomes על מצעים יציצו המשמשים הדמית AFM. בנוסף ניתוח חלקיקים קונבנציונלי שניתן לבצע בקלות עם תוכנה נפוצה בשימוש על ידי קהילת AFM, תוסף 34 ImageJ, שנקרא RiboPick, מוצג עבור לספור את מספר ריבוזומים לכל polysome 27, 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרקטיקות על מנת לקבל את רקמות העכבר אושרו על ידי גוף להגנת בעלי חיים (OPBA) של אוניברסיטת טרנטו (איטליה), פרוטוקול לא. 04-2015, לפי art.31 צו המחוקק לא. 26/2014. כל העכברים היו מתוחזקים במתקן אורגניזם מודל של המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית (CIBIO), אוניברסיטת טרנטו, איטליה.
זהירות: כדי למנוע את השפלה RNA של דגימות, להכין את כל מאגרי שימוש במים שטופלו DEPC למזעור זיהום RNase.
1. הכנת Polysomes ממוחו כל הפריטים
- איסוף רקמות מוח (15 דקות)
- להרדים C57BL זן עכבר wild-type / 6 עם מחנק 2 CO 5 דקות 36. בזהירות לנתח את המוח החוצה מהגולגולת 36, למקם את הרקמה לתוך צינור 1.5 מ"ל ו למקם אותו בחנקן נוזלי. חנות ב -80 ° C עד השימוש.
- הכנת lysate (30 דקות)
- לכתוש את רקמת המוח כולו באמצעותובמכתש תחת חנקן נוזלי.
- העבר כ -25 מ"ג אבקה לצינור microcentrifuge קר ומייד (כדי למנוע את הפשרת הרקמה המרסקת) להוסיף 0.8 מיליליטר של הצפת תמוגה (ראה טבלה 1) ולשבש את התא על ידי pipetting למעלה ולמטה 25 פעמים מהר.
- צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 1 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר.
- מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש ולשמור את הצינור על קרח במשך 15 דקות.
- צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת גרעינים ואת המיטוכונדריה.
- מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.
- אחסן את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 6 חודשים או להשתמש בו באופן מיידי.
- הכנת שיפוע סוכרוז צנטריפוגה (2 שעה ו -30 דקות)
- ultracentrifuge לשטוף צינורות בהרחבה עם מי RNase ללא (מי מטופלי diethylpyrocarbonate (מי DEPC) או מסחריים)ד 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O פתרון.
- מכניסים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 5.5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קר 50% בחלק התחתון של צינור אחד (ראה לוח 1 עבור פתרונות סוכרוז). בזהירות להוסיף את ירידת תמיסת סוכרוז 15% אחר טיפה, נשאר קרוב שלבי ביניים כדי לשמור על שלבי חדה, עד הצינור הוא מלא לחלוטין. כאשר הצינור הוא מלא לחלוטין, לסגור אותו עם פקק גומי, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
- בחדר קר בעדינות להניח את הצינורות אופקיים ולשמור אותו בתנוחה זו למשך 2 שעות. לאחר פרק זמן זה, לאט ליישר את הצינורות בחזרה למצב אנכי ולשים אותם על הקרח. ההדרגתיים מוכנים כעת לשמש. לחלופין, להכין את שיפוע סוכרוז 15-50% באמצעות שיפוע קונבנציונאלי לשעבר.
- בחדר קר להסיר בזהירות 1.0 מ"ל מהחלק העליון של השיפוע ואת כיסוי הירידה סוכרוז אחר טיפה עם lysate cytosolic (כלומר, supernatant שהושגו STEp 1.2).
- הורד בזהירות את הצינורות לתוך הדליים של הרוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה ההדרגתי עבור 100 דקות ב 180,000 XG ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge.
- לאחר צנטריפוגה, לעזוב את הצינורות בדליים שלהם במשך 20 דקות ב 4 ° C לתת לייצב ההדרגתי.
- חלוקת שיפוע סוכרוז (2 שעות)
- מוציאים בזהירות צינור ultracentrifuge אחד מן הרוטור ultracentrifuge ולעגן אותה במכשיר אספן של צפיפות מערכת חלוקה Gradient. אסוף 1 מיליליטר שברים ניטור את הספיגה ב 260 ננומטר עם גלאי UV / VIS (ראה איור 1 פנל עליון). שמור על השברים שנאספו על קרח.
- הכן aliquots של 30-40 μl של שברים של עניין, ולשמור אותם על הקרח לפני אחסונם ב -80 ° C עד השימוש. אין להשתמש aliquots או שברי סוכרוז כי עבר יותר משני מחזורי הקפאה-פשרה (ראה איור 1 פנל תחתון).
2. הכנת המדגם עבור מיקרוסקופית כוח אטומי (3 שעות)
- באמצעות קלטת, לקלף את הגיליונות יציצו.
- שטוף את הגיליונות יציצו 3-4 פעמים עם מי DEPC ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי קטנה. לאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר.
- מכסים את מיקה עם 200 μl של 1 מ"מ Niso 4 דגירה במשך 3 דקות ב RT.
- הסר את הפתרון ניקל ולאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר. לבצע את המהלכים הבאים ב 4 ° C על ידי נחת צלחת פטרי עם תציץ על קרח.
- להפשיר aliquot שהושגו 1.4.2 על קרח בעדינות להוסיף את כל טיפה מדגם אחר טיפה על מיקה. בעזרת קצה 100-200 μl, להפיץ את המדגם על פני השטח של מיקה. דגירה המדגם על קרח למשך 3 דקות.
- מכסה את הירידה יציץ גיליון אחר טיפה עם 200 μl קר הצפה-AFM (ראה טבלה 1) ו דגירה במשך שעה 1 על קרח.
- הדמיה בנוזל
- הסירו בזהירות את ההצפה-AFM ו לכבס את הסדינים יציצו 3-4 זמןים עם 200 μl קר הצפה-AFM להסיר סוכרוז עודף. לאחר מכן לשטוף את הסדינים נציץ 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה מס '1), בהשאירו את פני השטח נציץ סוקר בכמה מיקרוליטר של פתרון.
- לך להצביע 3 (תמונת רכישה).
- הדמיה באוויר
- מוציאים בזהירות את מאגר-AFM ולשטוף את מיקה 3-4 פעמים עם 200 μl קר הצפת-AFM להסיר את סוכרוז עודף. לאחר מכן, לשטוף את מיקה 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה 1) ומסננים את המים העודפים באמצעות נייר.
- השאירו המדגם להתייבש מתחת למכסה המנוע כימי עם החלק העליון של צלחת פטרי פתוחה חלקית. לאחר 2 שעות, לסגור את צלחת פטרי ולאחסן ב RT. מדוד את המדגם לאחר 2-3 שעות כפי שהם יציבים במשך שנים.
3. Image Acquisition (15 דקות לכל תמונה לאחר ייצוב תרמי)
הערה: Polysomes משותקת על תציץ ניתן הדמיה באוויר או בנוזל, באמצעות מצב AC.
- צרף את מיקה לבעל המדגם באמצעות קלטת דו צדדית.
- הכנס את בעל מדגם בשלב AFM הבא להוראות היצרן. כאשר הדמיה בנוזל, במידת האפשר, מנסה לשמור על מדגם בטמפרטורה נמוכה מ -25 מעלות צלזיוס כדי להגביר את היציבות polysome בזמן.
- בחר שלוחה מתאימה הדמית AC ולעגן אותה על בעל הקצה הבא להוראות היצרן. הנה, cantilevers לשימוש עם כוח קבוע בין 2-20 N / m הדמיה אוויר סביב 0.1 N / m הדמיה נוזלי.
- התאם את מקום הליזר על השלוחה ואת אפס אותות הגלאים ברבע.
- בחר תדירות נהיגה מתאימה ולנסוע השלוחה עם משרעת של 10-20 ננומטר.
- מתקרב המדגם עד הקצה עוסקת פני השטח.
- בחר אזור הסריקה של מיקרומטר 2x2, לרכוש לפחות תמונות פיקסל 512x512 (רוחב פיקסל <4 ננומטר), בחר מצב חיסור רקע חיה בסולם Z של 20-25 ננומטר.
- בדוק tהוא דמות מחפש בנוכחות חפצה עגולים מאופיינים גובה בין 10 ו -15 ננומטר בעת הרכישה באוויר ו -25 ו -30 ננומטר כאשר בנוזל ואת הרוחב ננו בטווח 25-30. כוונו את הפרמטרים setpoint ומשוב עד חפצים חדים הם דמיינו. הרקע אמור להופיע שטוח יחסית בדגימות טובות, עם כמה חפצים בגובה 2-4 ננומטר (ראה איור 2 א 'וב').
- אם התמונה נראית טובה (כמצוין בשלב 3.8), לרכוש כמה סריקות מיקרון 2x2 (לפחות עשר) בשעת אזורי מדגם שונים.
- (אופציונאלי). במידת הצורך, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של polysomes שנבחר (ראה איור 2 ג).
- החל תיקוני תוכנה (חיסור מטוס ואלגוריתמי תיקון שורה אחר שורה) כדי לתקן את תמונות AFM הסרת הטיה שרירותית ונסחפו אפקטים.
4. ניתוח נתונים (30 דקות לכל תמונה)
- ייצוא תמונות ב ImageJ (אופציונלי: להחיל גורם קנה מידה) preferentially באמצעות פורמט דחיסה ללא אובדן נתונים, למשל, בפורמט TIFF (ראה איור 3 א).
- השתמש RiboPick.ijm הכלים מאקרו ImageJ (להעתקה בתיקיית הכלים מאקרו / ImageJ) לספור הריבוזומים polysomes (ראה איור 3B) ולחשב הסטטיסטיים של המדגם (ראה איור 3 ג).
- התחל טעינת תמונה באמצעות <תמונה קרא> כלי מאתחל את התוכנית.
- פיק המרכזים הריבוזום עם ImageJ <פוינט בחירה> כלי סטנדרטי (shift + שמאל לחץ מאפשר הריבוזומים רב מבחר). סמן את הריבוזומים הנבחרים עם הכלי <מארק ריבוזומים>. קואורדינטות ריבוזום תופענה חלון טקסט מותאם אישית.
- הוסף עוד ריבוזומים לאותו polysome לחזור על ההליך שצוין בנקודת 4.2.2.
- סור בטעות ריבוזומים מסומנים באמצעות <בטל האיסוף האחרון> הכלי (מתחיל הסרה מן הריבוזום הוסיף האחרון לראשון212; ב polysome הנוכחי בלבד).
- כאשר polysome הושלמה, השתמש <חדש polysome> כלי. ככל שמספר polysome מתווסף כשכבה אל התמונה בחלון הטקסט מתעדכן.
- השתמש <שמירת תוצאות וקרובות> לכתוב את הריבוזום לקובץ קואורדינטות (יחידות ברירת המחדל של התמונה משמשות) ואת תמונת PNG המסכם הריבוזומים שקוטף polysomes. התמונה המקורית סגורה ללא להינצל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרופיל polysomal שיפוע סוכרוז של מוח עכבר השלם
אפשר לטהר polysomes מתוך lysate הסלולר על ידי יצירת פרופיל polysomal, המפריד מקרומולקולות בהתאם למשקל וגודלם. עם פרופיל polysomal, lysates ציטופלסמית המתקבל תאים או רקמות בתרבית, כגון בדוגמא זו, הם הועמסו על שיפוע סוכרוז ליניארי ועובד על ultracentrifugation להפריד RNA ללא יחידות משנת 40S ו 60S, 80S ריבוזומים ו polysomes פי מקדם השקיעה שלהם ( איור 1 פנל עליון). ספיגת מדגם ב 254 ננומטר וגביית שבריר לאפשר את בידודה של שבריר סוכרוז המועשר ריבוזומים או polysomes עם מספר שונה של ריבוזומים לכל תמליל. שברים ניתן לאסוף, aliquoted הדמיה AFM ומאוחסנים ב -80 ° C (איור 1פנל תחתון).
Polysomes Native ממוח העכבר נצפה על ידי AFM באוויר לחשוף אינטראקציות הריבוזום חזקות
תמונת רכישה מבוצעת באמצעות במצב AC (הידוע גם בשם מצב קשה). טיפול זה מתאים במיוחד הדמית דגימות רכות (כגון polysomes) בגלל האינטראקציה טיפ-מדגם ואת כוחות הגזירה המקבילות מופחתות מאוד. בדרך זו היא קץ ואת המדגם נשמרים. הדמית AFM מאפשרת רכישת נתונים ברזולוציה גבוהה, עם ערכים מדויקים כי תלויים בגורמים שונים, כגון תנאים המדידים, הסוג של הקצה, ואת המאפיינים של המדגם. בתנאים שתוארו במאמר זה החלטה לרוחב של כ 4-6 ננומטר ברזולוציה אנכית של 0.1-0.2 ננומטר הם ברי השגה. לאחר בתצהיר של aliquots סוכרוז על מיקה, AFM מספק תיאורים של polysomes יחידלהופיע כאשכולות של ריבוזומים צפופים (איור 2 א, C ו- C). על ידי ניתוח חתך (איור 2 ד), הגובה של פסגות ריבוזומלי הוא בסביבות 14 ננומטר בהתאם למה נצפה בעבר עבור ריבוזומים אדם polysomes לאחר ייבוש אוויר 27. המרכז למרחק במרכז ריבוזומים שזוהו על ידי פרופיל הקו הוא 23 ננומטר, אשר עולה בקנה אחד עם מימד של ריבוזומים בתמיסה 37, 38.
מספר ריבוזומים לכל polysome מן חלק אחד מציג חלוקה מונו מסיסות
איור 3 א מדווח על תמונת מיקרוסקופ טיפוסית שהושגה באמצעות רכישת מדגם נספג על תציץ מן החלק של שיפוע סוכרוז. מראה הבלעת זום דיגיטלי של polysome יחיד, עם מקדם גדלה מתאים לזיהוי טווח הגילomes ב polysome. לוח ב 'מציג את אותה תמונה לאחר זיהוי הריבוזום עם המאקרו RiboPick. עיגולים אדומים (ראה הבלעה) לסמן את הריבוזומים, ומספר פרוגרסיבי (ציאן) משמש כדי לסייע העמותה של הריבוזום קואורדינטות עם polysome ספציפי. חלוקת התדר של מספר ריבוזומים לכל polysome נותחה עבור חלק # 10 (ראה figure1, פנל תחתון, מתאים polysomes המולקולרית המשקל הבינוני (MMW)), אשר מראה בבירור לשיא יחיד (לוח ג, פסים אפורים). חלוקת הניסוי היה מצויד עקומת גאוס (הקו השחור) כי היה מרוכז ב 5.8 ריבוזומים / polysome, עם סטיית תקן של 1.3 ריבוזומים / polysome.
באיור 1. פרופיל ספיג נציג שקיעת שיפוע סוכרוז של מוח עכבר כולו. (עמ העליוןאנל) polysomal lysate ציטופלסמית הושג ממוח עכבר P27 ו הועמס על סוכרוז שיפוע סוכרוז ליניארי (15-50% [w / v]). אפשר להתבונן פסגות ברורות מתאימות ספיג ב 254 ננומטר של RiboNucleoParticles (RNP), תת-יחידות ריבוזומלי (40S ו 60S), ריבוזומים (80S) ו polysomes. כדי למנוע הקפאה חוזר להפשיר מחזורים של דגימות לפני בתצהיר AFM על מיקה, זה נוח להתפצל aliquots הוא חלק הריבוזום ושברי polysomal (פנל תחתון) עם מספר שונה של ריבוזומים לכל תמליל (כלומר, נמוך, בינוני, גבוה polysomes -molecular-משקל (LMW, MMW, ו HMW, בהתאמה)). את aliquots ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל שנים.
איור 2. תמונות של polysomes המוח על ידי הקשה-Mode כוח אטומי מיקרוסקופית. (א) דוגמה של תמונה AFM של פולי המוח MMWSomes לאחר ספיגה על תציץ באמצעות סולם צבע אפור ליניארי. (ב) אותה התמונה שמוצגת (א) מתואר באמצעות טווחים-Z שונים עבור סולם הצבעים: 0-0.5 אפור ננומטר עבור ברקע, 0.5-2 ננומטר, וצהוב 2-10 ננומטר עבור ריבוזומים. במקרה זה ניגוד ויזואלי טוב יותר מתקבל הן חפצים לטווח Z נמוך וגבוה. (ג) הגדלה של polysome MMW טיפוסי עם פרופיל חתך (קו לבן מנוקד). (ד) גובה פרופיל של שני ריבוזומים מוגדרים לפי פרופיל החתך ב (ג) מראה בגובה הריבוזום של 14 ננומטר. ערך זה הוא בקנה אחד עם מה שנצפה קודם לכן ב AFM עבור ריבוזומים האדם polysomes 27.
דוגמה באיור 3. של ספירת מספר ריבוזומים לכל polysome ב polysomes המוח MMW. (א) תמונת מיקרוסקופ כי represents הקלט של מאקרו ImageJ, RiboPick. (ב) לאחר בחירת כל הריבוזומים ידני לכל polysome, סימני RiboPick בתמונה המיקום של כל הריבוזום (עיגולים אדומים). (ג) מספר המתקבלים ריבוזומים לכל polysomes ניתן להתוות כמו חלוקה אשר יכול להיות מצויד עם עקומת גאוס. מספר polysomes נחשב בדוגמא זו הוא 164, המתקבל 9 תמונות עצמאיות. הולם עם עקומת גאוס מחזירה את הערך הממוצע של אוכלוסיית polysomes בשבריר MMW (# ריבוזומים / polysome 5.8 ± 1.3, R 2 = 0.99).
| בַּלָם | הרכב | בַּקָשָׁה |
| מאגר תמוגה | 10 mM Tris-HCl, 7.5 pH | הכנת lysate (1.1) |
| 10 מ"מ NaCl | ||
| 10 מ"מ MgCl 2 | ||
| 1% Triton-X100 | ||
| 1% Na-deoxycholate | ||
| 0.4 U / ml RNase אינהיביטור | ||
| 1 מ"מ DTT | ||
| 0.2 מ"ג / מ"ל cycloheximide | ||
| 5 U / ml DNAse אני | ||
| 50% תמיסת סוכרוז | 50% (w / v) סוכרוז | הכנת שיפוע סוכרוז (1.2) |
| 100 מ"מ NaCl | ||
| 10 מ"מ MgCl 2 | ||
| 10 מ"מ טריס / HCl pH 7.5 | ||
| 15% תמיסת סוכרוז | 15% (w / v) סוכרוז | הכנת שיפוע סוכרוז (1.2) |
| 100 מ"מ NaCl | ||
| 10 מ"מ MgCl 2 | ||
| 10 מ"מ טריס / HCl pH 7.5 | ||
| פתרון ניקל | 1 מ"מ Niso 4 | לדוגמא כהכנה AFM (2) |
| ההצפה-AFM | 100 מ"מ NaCl | לדוגמא כהכנה AFM (2) |
| 10 מ"מ MgCl 2 | ||
| 100 מיקרוגרם / מ"ל cycloheximide | ||
| 10 מ"מ Hepes | ||
| 3% (w / v) סוכרוז, pH = 7.4 | ||
| פתרון כביסה | DEPC-מים | לדוגמא כהכנה AFM (2) |
| 100 מיקרוגרם / מ"ל cycloheximide | ||
טבלה 1. חוצצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמו מבנה ה- DNA הוכח להיות בעל חשיבות עליונה כדי לתאר את התהליך של שעתוק כארגון של הכרומטין קידם את ההבנה שלנו של שליטה תעתיק של ביטוי גנים, חשוב לנתח את הארגון והמבנה של polysomes לשפר הבנה אמת תרגום והרגולציה שלה.
עם הפרוטוקול המתואר, צפיפות אופטימלית של polysomes משותקת בעדינות על משטח שטוח, מתאים הדמית AFM מתקבלת. שימוש במצבים אלו דגימות מוכנות בנוחות, כמעט 50 polysomes לשעה יכולים להירכש, מוכן ניתוחי אפיון נוספים. יתר על כן, דגימות מיובשות מאוחסן ב RT הוכיחו להיות מתאים הדמיה לאחר יותר משנה אחת.
כדי להשיג תמונות polysome בהצלחה עם הפרוטוקול שלנו, יש כמה צעדים מכריעים: להשתמש ברקמות כי כבר כראוי פלאש-קפואה מייד לאחר dissection ומאוחסנים ב -80 ° C כדי למזער השפלה RNA; כדי להשתמש חיץ תמוגה המכיל מעכבי cycloheximide ו RNase כדי למנוע ניתוק הריבוזום מ- mRNA; כדי לבצע את כל incubations על קרח במהלך בתצהיר מדגם על תציץ; וכאשר מכינים את המדגם עבור הדמיה AFM על אוויר, לשטוף את המדגם בהרחבה על נציץ עם מאגרים ומים חינם RNase בנוכחות cycloheximide. הנקודה האחרונה חשובה במיוחד. אם התמונה מכילה משטחים חלקים בכ בגובה הנכון אבל 100-1,000 רחב ננומטר, זוהי אינדיקציה ברורה של מדגם שטף גרוע (לעתים קרובות ריבוזומים / polysomes ניתן להבחין עדיין כאובייקטים קלושים, מוטבעים). שיטה כדי לפתור בעיה זו היא לחזור על תהליך הכביסה, אבל זה בדרך כלל לא למתן את הנושא על מדגם יבש כבר. במקרה זה כדאי מתחיל שוב עם aliquot חדשה.
בהתחשב ברזולוציה של AFM, שיטה זו עבור polysomes לומד לא יכול לפתור את strucפרטים טוראל ממשקי ריבוזומלי ב polysomes. למעשה, AFM היא גישה משלימה ופשוט קריו EM, מייצג טכניקה יעילה וחזקה, כדי לרכוש ולנתח אלף polysomes, ולהבין טוב יותר את הארגון הריבוזום הכולל polysomes. חשוב לציין, פרוטוקול זה יש את היתרון הייחודי של זיהוי חוטים תואמים RNA 27. הליך אותו מאוד זה יכול לשמש לכל מדגם polysomal המתקבל מכל רקמה ביולוגית או שורת תאים. יתרה מכך זה גם יכול להיות מועסק בהצלחה להשיג מידע תמליל ספציפי באמצעות במערכות תרגום במבחנה, כפי שהודגם לאחרונה על ידי לוריה ועמיתים לעבודה 35. מתודולוגיה זו תסלול את הדרך במשך כמה ניסויים, כדי להשיג הבנה של קינטיקה של polysome היווצרות או שינויים בארגון polysome בתנאים הסלולר או רקמות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
