While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.
Den translasjonsforskning maskiner, dvs. polysome eller polyribosome, er en av de største og mest komplekse cytoplasmatiske machineries i cellene. Polysomes, dannet av ribosomer, mRNA-er, flere proteiner og ikke-kodende RNA, representerer integrert plattformer der translasjonelle kontroller finner sted. Men mens ribosomet har blitt mye studert, organisering av polysomes fortsatt mangler fullstendig forståelse. Således mye anstrengelse er nødvendig for å belyse polysome organisasjon og en hvilken som helst ny mekanisme for translasjons-kontroll som kan være innebygd. Atomic force mikroskopi (AFM) er en type scanning probe mikroskopi som gjør at kjøpet av 3D-bilder på nanonivå oppløsning. Sammenlignet med elektronmikroskopi (EM) teknikker, en av de viktigste fordelene med AFM er at det kan skaffe seg tusenvis av bilder både i luft og i løsning, slik at prøven som skal holdes under nær fysiologiske betingelser uten behov for farging og fiksering prodyrer. Her er et detaljert protokoll for nøyaktig rensing av polysomes fra musehjerne og deres avsetning på glimmer substrater er beskrevet. Denne protokollen gjør polysome bildebehandling i luft og væske med AFM og deres rekonstruksjon som tredimensjonale objekter. Komplementær til Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), kan den foreslåtte metoden enkelt brukes til systematisk å analysere polysomes og studere deres organisasjon.
Syntesen av protein er den mest energikrevende prosess i celler 1,2. Derfor er det ikke overraskende at protein Forekomsten er i hovedsak kontrollert ved det translasjonelle i stedet for transkripsjonsnivået 3,4,5. Den polysome er den grunnleggende makromolekylære komponent som konverterer mRNA informasjonen inn i funksjonelle proteinavlesninger. Polysomes er så langt anerkjent som makromolekylære komplekser der flere translasjonsforskning kontroller møtes 6-13. Til tross for hundrevis av studier på ribosom struktur 14- 16, har de detaljerte molekylære innsikt i dynamikken i oversettelse og topologien av polysomes oppstått et begrenset interesse. Som en konsekvens, organisering av de innfødte polysomal ribonucleoprotein komplekse og dens virkning på muligheten oversettelse er fortsatt ganske obskure saker. Polysomes kan skjule fortsatt ukjent bestilt og funksjonelle organisasjoner, potensielt speiling hvilke nucleosomes og epigenetisk controls har representert for transkripsjon feltet. Faktisk etterforskningen av denne spennende hypotese krever ytterligere studier og nye tekniske tilnærminger. I denne linjen, kan strukturelle teknikker og atomic force mikroskopi motivert samarbeide for å løse nye mekanismer for å styre genekspresjon, på samme måte som det som ble oppnådd for nucleosome 17,18.
Siden oppdagelsen av ribosomet 14-16, har dens struktur blitt grundig karakterisert ved prokaryoter 19,20, gjær 21 og mer nylig i human 22, som gir den molekylære beskrivelse av mekanismene på basis av proteinsyntesen. Polysomes ble først anerkjent på membranen av det endoplasmatiske retikulum, danner typiske 2D geometriske organisasjoner 14. Som nevnt tidligere, har polysome sammenstillingen ikke vært gjenstand for konstant interesse som ribosomet struktur. I det siste har polysomes blitt studert i hovedsak av transmission EM-baserte teknikker. Bare nylig, cryo-EM teknikker aktivert 3D-rekonstruksjon av renset polysomes fra in vitro oversettelsessystemer 23-26, menneskelige cellelysatene 27 eller i celler 28. Disse teknikkene tilbudt mer raffinert informasjon om ribosom-ribosom organisasjon i polysomes 23, 26-28 og en foreløpig molekylær beskrivelse av kontaktflatene på tilstøtende ribosomer i hvetekim polysomes 24. Dermed kan cryo-EM tomografi offentliggjøring av ribosom-ribosom interaksjoner med molekylær detalj, men det er tynget av omfattende etterbehandling og gjenoppbygging analyser som krever tunge beregningsressurser for datahåndtering. Videre, for å få den molekylære detalj av ribosom-ribosom interaksjoner, kreves et svært løst kart over ribosom, og denne typen referansen ribosom er kun tilgjengelig for noen få arter. Viktigere er cryo-EM tomografi ikke i stand til å oppdage gratis RNA. Therefmalm, nye teknikker som kreves for å fullt ut forstå organiseringen av oversettelses maskiner.
Foruten cryo-EM, har AFM er også ansatt som et nyttig verktøy for direkte avbildning av polysomes i lavere eukaryoter 29-33 og mennesker 27. Sammenlignet med EM, krever AFM ikke prøve fiksering eller merking. I tillegg kan målinger utføres i nærheten av fysiologiske betingelser og med en unik mulighet til klart å identifisere både ribosomer og nakne RNA tråder 27. Imaging av enkelt polysomes kan utføres relativt raskt, skaffe tusenvis av bilder på nano-oppløsning med lite etterbehandling innsats i forhold til den omfattende og tung etterbehandling og gjenoppbygging analyser som kreves av Cryo-EM mikroskopi. Derfor gjør AFM databehandling og analyse ikke trenger dyre arbeidsstasjoner og høy datakraft. Som sådan, samler denne teknikken informasjon om polysomal former, morfologiske egenskaper (så somhøyde, lengde og bredde), ribosom densiteter, tilstedeværelse av fri RNA og antallet ribosomer pr polysome 27 med en høyere gjennomstrømning enn cryo-EM. I en slik måte, representerer AFM en kraftig og komplementær tilnærming til EM teknikker for å portrettere polysomes 27.
Her presenterer vi en komplett rørledning fra rensing til dataanalyse hvor AFM brukes til bilde og analysere mus hjernen polysomes. Den foreslåtte protokoll fokuserer på renseproblemer og på den nøyaktige avsetning av polysomes på glimmer substrater som brukes for AFM avbildning. I tillegg til konvensjonell partikkelanalyse som lett kan utføres med vanlig programvare som brukes av AFM samfunnet, en ImageJ 34 plugin, kalt RiboPick, blir presentert for å telle antall ribosomer pr polysome 27, 35.
Etter hvert som DNA-strukturen ble vist seg å være av største viktighet for å beskrive prosessen av transkripsjon og som organisering av kromatin utvidet vår forståelse av transkripsjonen kontroll av genekspresjon, er det viktig å analysere organiseringen og strukturen av polysomes å forbedre sant forståelse av oversettelse og regulering.
Med den beskrevne protokoll, en optimal tetthet av polysomes forsiktig immobilisert på en flat overflate, egnet for avbildning AFM oppnås. Ved h…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.
Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |