Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En kombineret 3D manipuleret væv Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

I den foreliggende undersøgelse, vi kombinerede en in vitro 3D lungetumor model med en in silico model til at optimere forudsigelser af lægemiddel respons baseret på en specifik mutationel baggrund. Modellen er genereret på en decellulariseret porcint stillads, der gengiver vævsspecifikke karakteristika med hensyn ekstracellulære matrix sammensætning og arkitektur, herunder basalmembranen. Vi standardiseret en protokol, der tillader kunstig tumorvæv generation inden for 14 dage, herunder tre dages medicinsk behandling. Vores artikel indeholder flere detaljerede beskrivelser af 3D udlæsning screening teknikker som bestemmelse af spredning indeks Ki67 farvning s, apoptose fra supernatanter af M30-ELISA og vurdering af epitelial til mesenkymale overgang (EMT), som er nyttige redskaber til evaluering af effektiviteten af terapeutiske forbindelser. Vi kunne vise i forhold til 2D kultur en reduktion af spredning i vores 3D-tumor model, der er vedrøed til den kliniske situation. Trods af denne lavere proliferation, modellen forudsagte EGFR -targeted drug reaktioner korrekt i overensstemmelse med biomarkør status som vist ved sammenligning af lunge carcinoma cellelinier HCC827 (EGFR -mutated, KRAS vildtype) og A549 (EGFR vildtype, KRAS - muteret) behandlet med tyrosin-kinase-inhibitor (TKI) gefitinib. For at undersøge drug reaktioner af mere avancerede tumorceller, vi induceret EMT ved langtidsbehandling med TGF-beta-1 som vurderet ved vimentin / pan-cytokeratin immunfluorescensfarvning. En strøm-bioreaktor blev anvendt til at justere kultur til fysiologiske betingelser, hvilket forbedrede væv generation. Desuden viser vi integrationen af narkotika reaktioner på gefitinib behandling eller TGF-beta-1 stimulation - apoptose, spredning indeks og EMT - ind i en boolesk i silico model. Desuden har vi forklare, hvordan narkotika reaktioner af tumorceller med en bestemt mutations baggrund og tællererstrategies mod modstand kan forudsiges. Vi er overbeviste om, at vores 3D in vitro tilgang især med sin i silico udvidelse giver en ekstra værdi for præklinisk narkotika-test i mere realistiske forhold end i 2D cellekultur.

Introduction

Den farmaceutiske industri står over for høje opgivelsesprocent på op til 95% inden for kræftbehandling i det kliniske fase forårsager enorme omkostninger 1-5. En af grundene til dette underskud er, at i øjeblikket effekten af ​​potentielle nye forbindelser vurderes i store screeninger på 2D cellekulturer af kræft cellelinjer eller i dyremodeller. Dyremodeller har en højere kompleksitet, men der er afgørende forskelle mellem mus og mænd 6,7. I det sidste årti, har 3D kræftmodeller ved hjælp af forskellige metoder er genereret til at bygge bro mellem 2D kultur cancer cellelinjer og en kompleks in vivo tumor 6,8,9. Virkningen af 3D-miljø på celledifferentiering og også på signalering er blevet vist i adskillige undersøgelser år siden (f.eks. Ved Mina Bissell) 10,11. I dag, mange 3D-cellekultur modeller er til rådighed, såsom kugleformede kulturer, hydrogeler eller mikrofluide chips 12-16. Selvom THESe modeller øge kompleksiteten sammenlignet med konventionelle 2D dyrkningssystemer, de for det meste mangler et væv mikromiljø, der vides at have tumor-understøttende påvirkninger samt påvirkninger lægemiddeleffektivitet.

For at løse dette problem, vi genereret en 3D-tumor model baseret på en biologisk stillads kaldet SISmuc (lille-tarm-submucosa + slimhinde), der er afledt af en decellulariseret porcin jejunum. Derved vævsarkitekturen og vigtige bestanddele af ECM såsom forskellige kollagener samt basalmembranen struktur bevares 17. Denne unikke egenskab er afgørende for tumormodel generation af karcinomer, der opstår fra epitel og omfatter omkring 80% af faste tumorer. Endvidere er proliferationshastighed i vores væv-manipuleret tumormodel reduceret i forhold til de kunstigt høje opnået i 2D kultur. Som spredning er en vigtig parameter i vurderingen af ​​narkotika effekt, er narkotika testning aktiveret i vores model i mere ensbetingelser til in vivo tumorer 17.

For at vurdere potentialet i vores model til at forudsige biomarkør-afhængige narkotika effekt korrekt, vi her præsentere data for to forskellige lungekræft cellelinier, der adskiller sig i deres EGFR -biomarker status. Denne mutationsstatus er begyndt at blive bestemt rutinemæssigt i NSCLC patienter. Målrettede behandlinger med TKI'er såsom EGFR inhibitor gefitinib mod tumorer, der bærer en aktiverende EGFR mutation viser overlegne resultater sammenlignet med dem med platinbaseret kemoterapi 18-21.

Vi har etableret flere read-out teknikker, der er relevante for at vurdere sammensatte effekt. Desuden efter TGF-beta-1 stimulation er vi i stand til at undersøge sammensatte handlinger i tumorceller, der startede EMT proces, der menes at være et vigtigt skridt i malign transformation 22,23, og som er forbundet til narkotika resistance 24.

3D tumor model tillader overvågning celle-specifikke reaktioner på målrettede behandlinger, kemoterapi eller narkotika kombinationer med gode kontraster. For yderligere at styrke og fremskynde lægemiddel-screening og at møde modstand, dette suppleret med en i silico simulering. Baseret på et par eksperimenter, kan tumorrespons forudsiges i silico om resultatet for en bred vifte af lægemidler og deres kombinationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. To-dimensional (2D) Celledyrkning

  1. Kommercielt få tumorcellelinie HCC827 (DSMZ). Kultur lungen adenocarcinomacellelinie HCC827 (EGFR muteret, KRAS vildtype) i RPMI-1640 suppleret med 20% FCS. Skift medium hver 2 - 3 dage. Split cellerne to gange om ugen. Celler anvendes indtil passagen 20 er nået.
  2. Kommercielt få tumorcellelinie A549 (DSMZ). Kultur den lungecarcinom-cellelinje A549 (EGFR vildtype, KRAS muteret) i RPMI-1640 suppleret med 10% FCS. Udfør kulturen som anført ovenfor. Celler anvendes indtil passagen 20 er nået.
  3. Test cellerne regelmæssigt (hver 4 - 6 uger) for forureninger såsom mycoplasma forureninger.
  4. Dyrkning A549 eller HCC827 celler på dækglas
    1. Placer 1 steril dækglas i hver brønd i en plade med 24 brønde under anvendelse af en pincet.
    2. Seed 50.000 tumorceller af begge cellelinier i et volumen på 500 pi i brøndene medde dækglas, hhv.
    3. Dyrke cellerne indtil de når en konfluens på 70% under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C; 5% CO2). I løbet af denne tid, aspireres den gamle medium under anvendelse af en Pasteur-pipette og tilsæt 500 pi frisk medium hver 2 - 3 dages dyrkning.

2. generation af Tumor Test Systems på en biologisk Collagen Scaffold

  1. Statiske dyrkningsbetingelser
    1. Generer decellulariserede små-tarm-submucosa + slimhinder (SISmuc) og ordne det mellem to metalringe, de såkaldte celle kroner, som beskrevet i en tidligere publikation 25.
    2. Seed 100.000 celler af enten HCC827 eller A549-celler i et totalt volumen på 500 pi på siden af ​​de tidligere tarmens lumen fastsat i celle kroner.
    3. Tillad tumorceller at adhærere i 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Tilsæt 1 ml medium inde i cellen krone og 1 ml udenfor.
    4. Kultur tumorenmodel under statiske betingelser ved 37 ° C, 5% CO2 i inkubatoren i 14 dage. Skift dyrkningsmediet hver 2 - 3 dage. Derfor aspireres mediet ved anvendelse af en Pasteur pipette og pipette 1 ml frisk RPMI med den passende mængde af FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) inde i cellen krone og 1,5 ml af det samme medium uden for.
  2. Dynamiske kultur Betingelser
    1. Opsætning tumor testsystem med decellulariserede matrix inde i cellen kroner og celle såning som beskrevet under underafsnit 2.1.1 til 2.1.3.
    2. Kultur tumor model under statiske betingelser 37 ° C, 5% CO2 i inkubatoren i 3 dage.
    3. Saml autoklaverede bioreaktor og indsæt seedede SISmuc som tidligere 25 offentliggjort.
    4. Afpipetteres 45 ml RPMI med den passende mængde af FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) til kolben og forbinder den nålefri prøveudtagningsindretning til rørsystemet mellem bioreaktoren ogmedium kolbe.
    5. Placer bioreaktoren i inkubatoren, slutte den til pumpen og kultur tumor model for yderligere 14 dage med en konstant mediestrøm (3 ml / min) ved 37 ° C, 5% CO2.
    6. Ændre hele dyrkningsmediet efter 7 dage. For at flytte bioreaktoren fra inkubatoren under en laminær strømning. Aspirer mediet i medierne kolbe under anvendelse af en Pasteur-pipette. Løft bioreaktoren mens opsugning at slippe af mediet i rørsystemet. Afpipetteres 45 ml frisk medium i kolben. Placer bioreaktor tilbage i inkubatoren og tilslut den til pumpen.

3. Behandling af Static Tumor Model med Gefitinib

  1. Kultur tumor model som beskrevet i afsnit 2.1.
  2. På dag 11 i kultur, forberede RPMI / FCS med 1 pM gefitinib (2,5 ml for hver celle krone). Aspirer gamle medium fra brønde med en Pasteur-pipette og tilsæt 1 ml forberedt RPMI / FCS / gefitinib inde than celle krone og 1,5 ml af det samme medium uden for.
    BEMÆRK: Den optøede gefitinib stamopløsning kan opbevares ved 4 ° C i en uge.
  3. Skift mediet på dag 13 som beskrevet i underpunkt 3.2.

4. Stimulering af Static Tumor Model med TGF-beta-1 for EMT induktion

  1. Kultur tumor model som beskrevet i afsnit 2.1.
  2. På dag 3 af kultur, forberede RPMI / FCS med 2 ng / ml TGF-beta-1 med bærer (2,5 ml for hver celle krone). Aspirer gamle medium fra brønde med en Pasteur-pipette og der tilsættes 1 ml af tilberedt RPMI / FCS / TGF-beta-1 inde i cellen krone og 1,5 ml af det samme medium uden for. Skift medium suppleret med TGF-beta-1 hver 2 - 3 dage indtil dag 14, som beskrevet under 4.2.

5. Læs-outs

  1. Tager Prøver for ELISA Målinger
    1. Tag prøver fra supernatanter af statisk (afsnit 2.1) og dynamisk (afsnit 2.2) kultur underbehandling med gefitinib (afsnit 3) på dag 11-14 af kultur som angivet i figur 2. Derudover tager en prøve før behandling (T0).
    2. Under statiske dyrkningsbetingelser, tage 100 pi prøve fra indersiden af ​​cellen krone. Under dynamiske dyrkningsbetingelser, skru sprøjten på prøveudtagningsanordningen og tage 1 ml medium ud af bioreaktorsystemet. Opbevar alle indsamlede supernatanter ved -80 ° C, indtil ELISA udføres.
  2. M30-ELISA for apoptose Kvantificering
    1. At kvantificere apoptose i supernatanterne udføre celledød assay ifølge producentens anvisninger. Lad alle reagenser nå RT før udførelse af analysen.
    2. Vortex alle reagenser. Opløs vask tablet i 500 ml frisk deioniseret vand. Fortynd HRP konjugat med 9,2 ml konjugat fortyndingsbuffer og blandes. Pipette 25 pi standard eller prøve per brønd.
    3. Tilføj 75 pi af den fortyndede HRP Conjugate opløsning per brønd. Dæk pladen og inkuber det på et rysteapparat i 4 timer ved stuetemperatur. Vask pladen manuelt, 5 gange med 250 pi forberedt vaskeopløsning.
    4. Tilsæt 200 pi 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) substrat til hver brønd. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 20 minutter. Tilsæt 50 ul stop-løsning til hver brønd. Ryst mikropladen i 10 sek og forlade mikropladen i 5 minutter før aflæsning af absorbansen. Bestem absorbansen ved 450 nm i en mikropladelæser. Beregn standardkurven og koncentrationerne i prøverne ved hjælp af et passende program til håndtering af ELISA typen data såsom Origin.
  3. Prøve Farvning
    1. Fastsættelse, Paraffin-indlejring og afsnit Forberedelse af 3D-model
      1. Fastgør seedede SISmuc med 2,5 ml 4% paraformaldehyd (PFA) per celle krone i 2 timer, og integrere det i paraffin
      2. Forbered 3 um vævssnit for farvning som tidligere offentliggjort25.
    2. Fastsættelse af celler dyrket i 2D kultur Betingelser
      1. Når 70% konfluens er nået, vaske celler dyrket på dækglas i 24-brønds plade gang med PBS og fikseres med 500 pi 4% PFA / brønd i 10 min.
      2. Fjern PFA og gemme dækglas i brønden-plade dækket med PBS ved 4 ° C indtil farvning udføres.
    3. H & E farvning
      1. Farv de rehydrerede sektioner med hematoxylin / eosin som en oversigt farvning ifølge standard protokoller.
    4. Immunfluorescensfarvning af 3D model
      1. For immunfluorescensfarvning, udføre et antigen hentning ved at placere afparaffinerede og rehydrerede slides i en dampkoger med forvarmet citratbuffer (pH 6,0) i 20 min.
        BEMÆRK: Se tabel af materiale og udstyr er til at forberede af citratbuffer.
      2. Overfør diastil vaskebuffer (0,5 M PBS-buffer + 0,5% Tween), til cirkelsektioner med PAP pen minimere det nødvendige volumen for farvningsopløsninger og placere objektglassene i et fugtighedskammer.
      3. Blokere vævssnit med 5% serum fra værten arter af de sekundære antistoffer anvendt i underpunkt 5.3.4.6 i 20 minutter ved stuetemperatur.
      4. Fjern blokering serum ved forsigtigt at banke objektglassene til en papirserviet og anvende det primære antistof til det indkredsede afsnit i en fortynding ifølge producentens anvisninger (kanin-anti Ki67 1: 100, kanin-anti vimentin 1: 100, muse anti pan-cytokeratin 1 : 100). Inkuber O / N ved 4 ° C. For dobbelt-farvning, skal primære antistoffer fra forskellige værtsarter anvendes.
      5. vaske forsigtigt ubundet antistof med vaskebuffer tre gange i 5 min.
      6. Til påvisning af specifikke antigen-antistof bindinger, anvende sekundære antistoffer i fortyndingen 1: 400 til afsnittene og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
      7. Vask UNBound antistof med vaskebuffer tre gange i 5 min.
      8. Monter dias med et vandigt medium, der indeholder DAPI at kontrastfarve kerner og lad dem tørre O / N.
    5. Immunfluorescensfarvning af 2D dyrkede celler
      1. Fjern PBS og dække seedede dækglas med 0,2% Triton-X100 i PBS i 5 min for permeabilisering. Vask dækglas med vaskebuffer (0,5 M PBS-buffer + 0,5% Tween) i 5 min.
      2. Udfør trin 5.3.4.3 til 5.3.4.7. Udfør alle trin i godt pladen på en vuggende platform og fjern reagenser ved at vende pladen.
      3. Til montering, øje på en dråbe af vandigt medium, der indeholder DAPI at kontrastfarve kerner på en ubestrøget glasplade og overføre dækglasset til det med de celler, står over for montering medium med pincet. Lad det tørre, før billeddannelse.
  4. Bestemmelse af spredning Indeks
    1. Udfør immunfluorescentfarvning mod Ki67 ifølge afsnit 5.3.4. eller 5,3 5.
    2. Tag fluorescerende billeder af vævssnit eller 2D dyrkede celler med et inverteret mikroskop. Brug forskellige filtre til at tage billeder af DAPI farvninger og Ki67 farvninger. For kvantificering, bruge 10 billeder af 3D sektioner eller 5 billeder af 2D kulturer (forstørrelse 20x) af hver betingelse fra ikke-overlappende dele af prøven.
    3. Bestem antal kerner og antal kerner positive for Ki67 i 2D
      1. Count Ki67 positive kerner manuelt ved hjælp af plugin celletalsmåleren af softwaren Fiji 26. Derfor åbne billedet og klik på "Plugins" → "Analyser" → "Cell Counter". Tryk på "Initialiser", og vælg en tæller type. Klik på hvert Ki67 positive kerne. Antallet af klik vises ved siden af ​​den valgte tæller type.
      2. For automatisk celletælling af det samlede antal kerner oprette en makro ved hjælp Fiji 27,28. Adjust makroen for hver farvning og cellelinie. Efter, se et eksempel, hvordan du opretter en makro.
        1. Start makro-optager. Åbn et DAPI-billede og konvertere det til 8 bit format ved at klikke på "Image" → "Type" → "8-bit". Klik på "Forbedre kontrast", sæt 'mættet' som "1" og "normalisere".
        2. Indstil "uskarp maske" at skærpe billedet. Brug en "radius" af "1" og en "maske" af "0,60". Klik på "auto tærskel", vælge metode "RenyiEntropy" med "hvide objekter på sort baggrund 'at binarise billedet.
        3. Klik på "Plugins" → "BioVoxxel" → "vendepunkt uregelmæssige funktioner" med en udhuling radius af "5" til at adskille cellerne. Klik på "Analyser" → "Analyser Partikler", og indstil "størrelse" til "0,02-Infinity".
          BEMÆRK: Antallet af partikler / celler ervist i den sammenfattende tabel som tæller.
        4. Klik på "Opret" for at gemme makro til analyse af yderligere billeder.
    4. Bestem antal kerner og antallet af kerner positive for Ki67 i 3D manuelt som beskrevet i underafsnit 5.4.3.1.
    5. Beregne middelværdien proliferation index (PI) efter følgende formel:
      ligning1
      n = antallet af billeder (3D: 10, 2D: 5)

6. I Silico Tumor Model Generation og Simulering af Anti- EGFR Therapy i HCC827 Cells

  1. Network Generation hjælp af en Network Analysis Software
    1. Brug forskellige kendte databaser til at generere tumor netværk baseret på de vigtige eksperimentelle read-out parametre og den mutations baggrund af HCC827 cellelinje.
    2. Åbn netværket analyse software 21 at visualiserenetværk.
      1. Klik på "File" → "Ny" → typen 'JoVE_tumor modellernes → klik på "OK" for at generere et nyt netværk. Klik på "Square nærbillede North" → "OK" for at visualisere receptoren i en dobbelt membran. Klik på "Generisk Protein" at visualisere knuder (= proteiner) som rektangler → typen 'EGFR "→ klik på" OK "; gentage dette for hvert knudepunkt i netværket.
      2. Mærk noder i netværket: Højreklik → "Skift farve & form ..." → vælg for noder EGFR og (EGF-EGFR) farvekode "255,0,0" (farve rød); for noder c-MET og (c-MET) farvekode "0,255,0" (farve grøn); for gefitinib farvekode "255,255,0" (farve gul); for PI3K-Inh farvekode "204.204.204" (farve lysegrå); for MEK-Inh farvekode "102.102.102" (farve mørkegrå); for alle andre knudepunkter i netværket vælge farvekode4; 255.255.255 "(farve hvid).
      3. Klik på "fænotype" til at visualisere read-out parametre som sekskanter → typen 'spredning' → klik på "OK" → Højreklik → "Skift farve & form ..." → vælg farvekode "255.204.204" (farve laks); Gentag dette for parameter apoptose → vælg farve kode "255,51,204" (farve violet).
      4. Visualiser Edges (= interaktioner): Klik på "State Transition" for aktiveringer (pile), Klik på "Hæmning" for hæmninger (afrundede pile); Gentag dette for hver interaktion i netværket.
    3. Klik på "File" → "Gem som ..." → typen 'JoVE_tumor models.xml "→ klik på" Gem "for at gemme den genererede signalering netværk som .xml format.
  2. I Silico Simulering hjælp SQUAD
    BEMÆRK: SQUAD repræsenterer the netværkstopologi som en diskret logisk Boolean-system (AND, OR, NOT) og udfører en steady state analyse. Steady state analyse afspejler systemets ligevægt og ansvar ved signalering stimuli (f.eks., Narkotika ansøgning eller mutation).
    1. Åbent SQUAD 17 software, Klik på "Load Netværk" → upload 'JoVE_tumor models.xml' fil. Klik på "Kør analyse":
      BEMÆRK: Dernæst SQUAD anvender eksponentiel funktion at interpolere den booleske netværksforbindelse, som giver mulighed for dynamisk simulering af netværket adfærd over tid (farvede sigmoid aktivitet kurver).
    2. Klik på "Avanceret" → "perturbatoren" at skrive en simulering protokol. Simuler anti EGFR modstand: Klik på "Rediger protokollen"
      1. Klik på "forstyrrelse" → bruge standard "initialstate = SS-4" (steady state 4) → Klik på "Tilføj" for at tilføje "nye Constant Pulse '→ SeLect parameter "tilstand" → Vælg target "FLIP" → Vælg tidspunkt "0" → Vælg værdi "0,4" → Klik på "OK".
      2. Gentag dette: Klik på "Tilføj" → Vælg parameter "stat" → Vælg mål "c-MET" → Vælg tidspunkt "0" → Vælg værdi "0,4" → Klik på "OK"; Klik på "Tilføj" → Vælg parameter "stat" → Vælg target "gefitinib" → Vælg tidspunkt "0" → Vælg værdien "1" → Klik på "OK".
      3. Sæt en tilstand værdi til aktiv node (EGF-EGFR): Klik på "activenode" → Klik på "Rediger" → Vælg tilstand "0,8" → Klik på "OK"; for alle andre knuder: Klik på "Rediger" → Vælg tilstand "0" → Klik på "OK". Klik på "OK" for at gemme protokollen.
      4. Display specifikke kurver: Gå til panel "Options" → Vælg "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspaser", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "spredning", "MEK-Inh" og "PI3K-Inh" for grafisk gengivelse. Klik på "Initialiser" → "Kør" for at starte en fuldstændig simulering af systemets respons. Klik på "Reset" for at starte en ny simulering.
    3. Simuler kombineret PI3K og MEK-inhibitor behandling: Klik på "Rediger protokollen"
      1. Brug samme node parameter som beskrevet under 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Klik på "forstyrrelse" → Klik på "Tilføj" for at tilføje "nye Constant Pulse '→ Vælg parameter" stat "→ Vælg target" PI3K-Inh "→ Vælg tidspunkt" 0 "→ Vælg værdien" 1 "→ Klik på" OK "; Klik på "Tilføj"at tilføje 'nye Constant Pulse' → Vælg parameter "stat" → Vælg target "MEK-Inh" → Vælg tidspunkt "0" → Vælg værdien "1" → Klik på "OK".
      2. Klik på "OK" for at gemme protokollen. Gå til panel "Indstillinger": Brug samme knudepunkter for grafisk gengivelse som beskrevet under 6.2.2.4. Klik på "Initialiser" → "Kør" for at starte en fuldstændig simulering af systemets respons. Klik på "Reset" for at afslutte simuleringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grundlag af den SISmuc scaffold (figur 2A til C), vi etableret et standardiseret operativsystem protokol for produktion, stimulering og behandling af en 3D tumor testsystem (figur 2D). Denne model muliggør bestemmelse af proliferationsindekset og kvantificering af apoptose ved hjælp af M30-ELISA som vist i figur 1 og figur 3. Figur 3 viser repræsentative H & E farvning af A549 og HCC827 modeller og en repræsentant apoptose måling med gefitinib. Den her præsenterede model er designet ved hjælp af eksemplet med EGFR -mutated NSCLC, som med held behandles med målrettede inhibitorer i klinikken. Tilsvarende kun EGFR -mutated HCC827 celler og ikke de A549-celler reagerer på EGFR inhibering med TKI gefitinib i vores model som vurderet ved forøgelsen af apoptose. Figur 4 figur 5C og D. Også under dynamiske dyrkningsbetingelser gefitinib har en stærk effekt på EGFR -mutated HCC827 (figur 5D).

Figur 6 viser netværkstopologien (figur 6A) og detaljeret i silico simuleringer af anti EGFR terapi resistens i HCC827 celler (figur 6b, C). Signaleringsnetværket blev genereret ved anvendelse af kendte litteraturdatabaser såsom HPRD, Kegg og QIAGEN (Genes & Pathways), hvilket resulterer i en topologi af 42 knuder og 55 kanter, visualiseret med CellDesigner software 26. Simuleringen af kendte driver mutation EGFR (i rødt) og c-MET co-aktivering (i grøn, værdi omkring 0,7) viser en forøget Proliferation rate (laks kurve) og en nedsat apoptose sats (violet kurve) over tid afspejler gefitinib (i gult) modstand i HCC827 celler går sammen med en aktivering af MEK og PI3K (figur 6B, mørk grøn og cyan). Modellering af kombineret PI3K og MEK-inhibitor (mørk og lys grå kurver) resulterer i en tilbagevenden af anti EGFR modstand virkning, reducerer proliferation og inducerer apoptose (figur 6C).

figur 1
Figur 1. Proliferation nedsættes i 3D Sammenlignet med 2D Cell Culture. Ki67-positive HCC827 celler (rød i A og B) blev farvet i 2D cellekultur (A) og 3D cellekultur på SISmuc (B). HCC827 celler og A549-celler blev talt og spredning indeks (procentdelen af Ki67-positive celler) blev bestemt (C </ Strong>, en repræsentant optælling ud af fem). Scale barer i A og B:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. SISmuc Scaffold Morfologi og behandlingstabel med TKI Gefitinib Celler podes på SISmuc som består af tyndtarmen submucosa (SIS) + mucosa (A:. Lysfelt, B: DAPI farvede celler på toppen af SISmuc, C: overlay af A og B) og er fastgjort i celle kroner på dag 0. ordningen behandlingen er vist i D: Medium ændringer (MC) er udført hver 2 til 3 dage. På dag 11 behandlingen starter. Supernatanter opsamles og bruges til M30-ELISA med henblik på at kvantificere apoptose over tid (blå pile og kasser). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Gefitinib Behandling Ændringer cellevækst på SISmuc og inducerer apoptose i HCC827, men ikke i A549 3D tumormodeller. Uden nogen behandling, begge cellelinier danner et monolag på SISmuc (A og B) og også afvikle tidligere crypt strukturer. Mens væksten mønster af A549-celler ikke ændres efter behandling med gefitinib (C), er antallet af HCC827 celler reduceret ledsaget af en ændring af en aflang celleform (D). Apoptose er fremkaldt af gefitinibs i HCC827 modeller som set af M30-ELISA målinger fra kultursupernatanterne (E D:. 100 um for A til D Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. TGF-beta-1 inducerer EMT i HCC827 Celler på SISmuc. HCC827 celler dyrket i 3D viser samlet udtryk for pan-cytokeratin (PCK) (grøn i A, a1), men kun enkelte celler udtrykker vimentin (rød i A, a2). Efter TGF-beta-1 stimulation, celler ændrer deres morfologi til en aflang form og udtryk for vimentin er stærkt forøget (rød i B, b2), mens ekspressionen af PCK opretholdes (grøn i B, B1). Scale bar i B: 100 um for A B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Dynamisk Cell Culture Forbedrer Tissue Generation. Ved dyrkning under 3D forhold i en bioreaktor (B), monolaget fra den statiske model (A, H & E-farvning) skifter fra et monolag (A) til et flerlaget væv (C, H & E-farvning ). HCC827 celler udviser en stærk lægemiddelrespons ved gefitinib behandling (D, H & E-farvning). Scale bar i D:. 100 um for A, C og D Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Fig. 6. I Silico Tumor Model Generation og Simulering af Anti- EGFR Therapy Resistance. Network topologi af en tumor celle med centrale signalering knudepunkter i rød (EGFR vejen) og grøn (c-MET) og deres downstream noder. Den karakteristiske tumor udlæsning parametre proliferation (i laks) og apoptose (i violet) er repræsenteret som sekskant. Pile angiver aktivering, stumpe pile inhibering. Terapeutiske mål er repræsenteret ved mørke og lyse grå rektangler er inhibering med gefitinib vist i gul (A). Dynamisk simulering af e-funktioner (farvede kurver) interpolere den booleske netværksforbindelse (AND, OR, NOT). EGFR og c-MET co-ekspression forårsager gefitinib modstand som indikeret af en stigning i proliferation (laks kurve) og adecrease af apoptose (violet kurve) efter ca vilkårlige tidspunkt 8 (B). Potentielle terapi tackler både PI3K og MEK af inhibitorer (under gule kurve, samme aktivering, se protokol). (C) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har etableret en kombineret in vitro / in silico tumor testsystem til biomarkør-styret behandling forudsigelser. In vitro model evaluerer forskellige vigtige aspekter af sammensatte handlinger såsom ændringer af tumorcelleproliferation og apoptose på en specifik mutationel baggrund, der også kan simuleres i silico 17. Her præsenteres den standardiserede protokol for 3D tumor model generation og sammensatte test herunder kvantificering af proliferation og apoptose og etablering af en prædiktiv i silico model. 3D tumor-modellen er baseret på tumorcellelinjer bærer specifikke mutationer. Celler dyrkes på en decellulariseret vævsmatrix i celle kroner. Matrix decellularization, fiksering mellem de to metalringe (celle kroner), samling af bioreaktoren system samt såning af stilladset er blevet visualiseret i JOVE før 25.

In vitro 3D Tumor Model
Oversættelsen af ​​de her opnåede resultater i klinikken kræver en omhyggelig udvælgelse af egnede tumorceller, der bærer mutationer af interesse for at klassificere patienter i henhold til biomarkører for udvalgte målrettede lægemidler. For stratificeret medicin, identifikation af druggable driver mutationer af næste generation sekventering er et stort problem, især i NSCLC og vil forhåbentlig afsløre nye genetiske markører i fremtiden 29. Til in vitro test, bør forbindelsen af interesse målrette et websted, der er meget aktiv i den valgte cellelinje eller i primære celler. Her blev det cellelinier HCC827 og A549 valgt på grund af deres forskel i EGFR mutation status og rapporteret overfølsomhed (HCC827 celler) og mellemprodukt følsomhed (A549-celler) mod TKI gefitinib i 2D kultur 30-32. I det første trin af 3D tumormodel generation, celleantal og dyrkningsperiode på den valgte tumor skal adju cellertake place hvis der anvendes celler forskellige fra den her nævnte. At finde den optimale forbindelseskoncentration, er det tilrådeligt at bestemme IC50-værdien ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt levedygtighedsassay i 2D. Baseret på denne test, bør forbindelsen anvendes i IC50 koncentrationen og den næste højere koncentration i 3D-modeller. Vi har valgt tre dages behandling på den ene side for at få resultater inden for to til tre uger, og til nem sammenligning med 2D tumor testsystemer på den anden side. Dog kan behandlingsperioder forlænges til at undersøge langvarig effekt. Ikke desto mindre bør det tages i betragtning, at langvarig behandling eller høje doser af den testede forbindelse kan forårsage fuldstændig celletab derved forhindre evalueringen af ​​proliferation eller andre immunhistokemiske markører.

For pålidelig signalering netværksanalyse, tumor respons ved behandling med en bestemt forbindelse skal analyseres skelne mellem spredning og apoptose. Disse udlæsninger er forskelligt tilsluttet i signalering netværk. Således karakteristisk analyse af begge parametre giver en bedre forståelse af narkotika handling og efterfølgende mål forudsigelse. Som nævnt før, er spredning af tumorceller reduceret i vores 3D-model i forhold til 2D dyrkningsbetingelser og dermed, bør reducere falsk-positive resultater af testede cytostatiske forbindelser. Til bestemmelse af udbredelsen indeks, det samlede antal kerner og antallet af kerner positive for Ki67-farvning skal kvantificeres ved hjælp af softwaren Fiji f.eks. Dette kan forenkles ved brugen af ​​makroer i 2D kulturer af tumorceller, der er imidlertid ikke muligt, hvis celler danner tætte aggregater da dette resulterer i lavere eller højere antal kerner, henholdsvis. I alle tilfælde skal de makroindstillinger skal justeres omhyggeligt for hver cellelinie og farvning. Apoptose kan kvantificeres ikke-invasivt fra supernatanterne måling caspase-spaltet cytokeratin 18, which er begrænset til celler med epitelceller egenskaber og forsynet med M30-ELISA. Dette har flere fordele: I) Den tillader at overvåge behandlingen effektivitet over tid og at identificere udgangspunktet for effektiv behandling. Ii) prøver er ikke ødelagt og kan anvendes til andre udlæste teknikker. III) epitelcelle apoptose kan skelnes fra mesenchymal apoptose, som er optimal i co-kultur indstillinger. Denne teknik, kunne imidlertid være upassende for tumorceller, der undergik EMT, og derved mister deres epitelial fænotype. Således bør ekspressionen af ​​cytokeratin 18 i hver tumorcellelinie anvendes verificeres ved immunohistokemiske farvninger før denne teknik anvendes. Afprøvning af forbindelser kan også udføres på en mere tumor stamcelle-lignende fænotype. Normalt i test af lægemidler forskellige invasive stadier er forsømt selv om de fleste af de målrettede lægemidler, såsom TKI'er, anvendes i mere avancerede tumor stadier. Vores model muliggør undersøgelse af invasive eller ingenn-invasiv tumorceller, på grund af den bevarede basalmembranen 17, som cellerne skal passere under invasion proces. Et afgørende skridt i retning af celle motilitet og invasionsevne er EMT, der kan induceres i forskellige lungecancer modeller ved stimulering med TGF-beta-1 17,33. Dette reducerer imidlertid spredning og dermed celletal på stilladset. Denne negative bivirkning kan omgås ved anvendelse af dynamiske dyrkningsbetingelser, som stærkt øger tumorceller tæthed i de 3D-modeller. Selvom bioreaktoren justerer kultur til fysiologiske forhold, skal det overvejes, at celle egenskaber og signalering kan påvirkes af eksponeringen for forskydningsspænding 25.

Brug simulation Simuleringer at fremskynde Cell-line-specifikke Drug Testing
Selvom kun semikvantitativ, er hændelsesforløbet korrekt modelleret af vores i silico model ved plejefuldt overvejer mutationer kendt for hver specifik cellelinje. Dette omfatter cellelinje specifikke modifikationer af de forskellige receptor aktiveringsniveauer, i hvilket omfang involveret kinaser aktiveres og hvornår og hvor længe netværk output såsom apoptose eller proliferation kan forventes. For eksempel kan man betragte klinisk kendte c-met amplifikationer, der menes at forekomme i ca. 20% af erhvervet anti EGFR terapi modstand 30. Efterfølgende den i silico modellen beregner den tilsvarende netværk adfærd over tid, f.eks., Gefitinib resistensudvikling repræsenteret ved øget proliferation og nedsat apoptose. I vores model, identificerede vi MEK og PI3K som de mest lovende mål kandidater. Derfor ny potentiel terapeutisk kombination kan hurtigt forhånd vurderes simulation, der tjener som grundlag for yderligere in vitro-test. Desuden output data fra in vitro-forsøg kananvendes til at forfine in silico systemet ved netværks justeringer, der passer de eksperimentelle resultater bedst. Semi-kvantitativ i silico strategier har nogle begrænsninger vedrørende netværk størrelse (ca. 100 protein-protein interaktioner kan betragtes). Desuden er det vigtigt at integrere alle væsentlige proteinkilder knudepunkter i nettet topologi for at give realistiske resultater. Den i silico modellen giver således kun en tilnærmelse af det eksisterende netværk i den levende tumorceller. Men denne fokuserede opfattelse giver os mulighed for at simulere specifikke ændringer af interesse, f.eks., Effekten af narkotika kombinationer på forskellige mutationsmønstre baggrunde i cellen-line. Dette hjælper os til systematisk forstå kompleksiteten af ​​sådanne kræft signalering netværk samt udlede nye terapeutiske strategier.

Afslutningsvis er vi overbeviste om, at vi har udviklet en hjælpsom manipuleret væv in vitro værktøj, der let kunne integreres i preclinisk afprøvning på effekten af ​​enkelte narkotika forbindelser og deres kombinationer. For at reducere omkostningerne og tid i testning, er denne tumor model desuden suppleret med en i silico forudsigelse værktøj gør det muligt at udvide de indsamlede data til en celletypespecifik forudsigelse af narkotika og narkotika kombinationseffekter herunder klinik-orienterede målrettede behandlinger eller nye spillere til at overveje (f.eks., miRNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev sponsoreret af Center for Tværgående Clinical Research (IZKF, tilskud BD247) fra University Hospital i Würzburg og Bayern Fit-programmet (tildelt Heike Walles).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Tags

Bioengineering Tissue Engineering 3D tumor model boolesk lungecancer biologisk stillads flow bioreaktor proliferationsindeks gefitinib apoptose TGF-beta-1 EMT
En kombineret 3D manipuleret væv<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lunge Tumor Model for Forudsigelse Drug Effektivitet i specifikke mutations baggrunde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Göttlich, C., Müller, L.… More

Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter