Summary

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup> 높은</sup> 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

Published: August 11, 2016
doi:

Summary

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Abstract

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Introduction

세포 항원 1 (SCA1 또는 Ly6A / E)를 줄기 제 조혈 및 중간 엽 줄기 세포, 6으로 표시되는 세포 표면 마커로 확인되었다. 마우스 지방 저장소에서 얻은 지방 조직의 기질 혈관 분획 (SVF)는 섬유 아 세포, 대 식세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포 및 지방 세포의 전구 세포 (7)의 포함하는 세포의 이종 인구입니다. 지방 세포 전구 세포 또는 지방 – 유래 줄기 세포 (ASC를)는 풍부한 혈관 주위 콜라겐이 세포 외 기질 (ECM) (8)에있는 비 지질 함유 세포이다. CD34 + : SCA1 + 9 CD29 + 약 SVF의 50 %는 혈통 음 (린)와 같은 특징의 ASC,로 구성되어 있습니다. 시험관에서의 지방 세포 분화 할 수있는 지방 세포 전구 세포 CD24 : 이들 세포의 대부분은 SCA1 + 아르 그러나, 세포의 일부만 (SVF 0.08 %)의 구성을 SCA1 <s최대> + : 증식 및 생체 조건 9 지방 세포로 분화 완벽하게 할 수있는 CD24 + 세포. CD24에서 CD24 + 세포를 구별하지 않고 SCA1 + SVF를 사용한 전위주의에도 불구하고 면역 자기 세포 분리를 사용하여 지방 저장소로부터 SCA1 +의 ASC를 세포를 단리 차 지방 세포 전구 세포의 세포 자율 표현형을 결정하는 효율적이고 실용적인 접근 방식이다.

비만과 당뇨병, 조직의 섬유화와 염증의 분야에서 2 형 당뇨병 3의 개발과 유지에 중요한 역할을한다. 최근, 토쿠 나가 등. (VIS, 또는 내장) 서혜부 (또는 피하, SQ)과 perigonadal에서 분리 SCA1 높은 세포 C57BL6 / J 지방 저장소가 시험관 (10)의 서로 다른 유전자 서명과 ECM의 리모델링을 나타내는 것으로 나타났다. MMP14 (MT1-MMP), 막-t의 원형 회원YPE 매트릭스 메탈은 (MMP) 패밀리는 collagenolytic 활성 (1)을 백색 지방 조직 (WAT)의 개발을 매개한다.

다음 프로토콜을 통해 분리되고 농축 된 세포로 수행 될 수있다 실험 예는 삼차원 배양, 분화 연구, 콜라겐 분해 분석 및 RNA 서열 10, 11을 포함한다. 분해 분석은 텔로 펩타이드 (11, 12)의 보존을 보장하기 위해, 산 추출 콜라겐으로 수행되어야한다. 다음 프로토콜은 서로 다른 지방 저장소에서 주요 혈관 간질 세포를 분리 및 면역 자기 세포 분리를 이용하여 지방 세포의 전구 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 할 것이다. 셀 정렬의 유효성은 유동 세포 계측법으로하고 SCA1 프로모터 (13)에 의해 구동 SCA1 + 세포에서 GFP를 표현 SCA1-GFP 마우스를 사용을 통해 평가한다.

Protocol

윤리 정책 : 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA)은 (실험 동물 연구를위한 연구소, 국립 연구위원회)가 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 모든 방법과 프로토콜을 승인했다. 마우스는 미시간 대학의 동식물 사육장 유지하고, 음식과 물을 무료로 액세스 권한을 부여하고, 12 시간 어두운 / 라이트 사이클에 보관됩니다. 1. 준비 DMEM, 10 % FBS, 1 …

Representative Results

다른 지방 패드에서 SCA1 고의 ASC의 농축. SQ 지방 디스플레이와 같은 섬유 아세포로부터 단리 혈관 간질 세포 SCA1 발현 수준 (도 1a)에 관계없이 셀 형상 뻗어있다. VIS 한편, (EWAT이 유래) 높은 ​​SCA1 및 SCA1 낮은 세포는 세포 형태에 뚜렷한 차이를 보여줍니다. VIS SQ (iWAT 유래) SCA1 높은</s…

Discussion

여기에서 우리는 고립과 다른 지방 패드에서 쥐의 ASC의 면역 자기 세포 분리 및 체외 실험에 사용을 보여줍니다. 제시된 방법의 ASC 9,14의 기술적으로 복잡하고 비싼 FACS 매개 분리를 통해 유리하다 SCA1 양성의 ASC의 많은 수의 빠른 분리에 효과적이다. FACS 달리 면역 자기 세포 분리는 표적 세포 모집단의 확인을위한 여러 항원의 사용을 허용하지 않는다. 표면 항원은 잘 특성화되면 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 (THC에) NIH DK095137에 의해 지원됩니다. 우리는 기술 된 방법의 개발 및 고도화에 기여 현재 전 실험실 구성원 감사합니다.

Materials

Type 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004182 Tissue digestion
DMEM Gibco 11965-092 High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x) Gibco 10378-016 Media antibiotic
Anti-anti (100x) Gibco 15240-062 Media antifungal
FBS Gibco 16000-044
PBS (1x, pH 7.4) Gibco 10010-023
Trypsin (0.05%) Gibco 25300-054
Cell strainer BD Bioscience 352360 100-μm cell strainer
60mm plates BD Falcon 353004
Scissors FST 14001-12 Large
Scissors FST 14091-11 Fine, curved tip
Large Forceps FST 11000-12
Fine Forceps Any vendor
25G 5/8” needles BD 305122
22G 1.5” needles BD 305159
15 ml conical tubes BD Falcon 352097
50 ml conical tubes BD Falcon 352098
MACS separation columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC) Miltenyi Biotec 130-092-529 FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Blue chux pads Fisher 276-12424
Absorbent pads Fisher 19-165-621
Styrofoam board Use from 50ml tubes
70% ethanol
Isoflurane Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647 Invitrogen R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 Invitrogen MSCA21
Rat IgG2a R-PE Invitrogen R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE Invitrogen MF48004
Round-bottom tube BD Falcon 352058
HBSS (–Ca, –Mg) Gibco 14175-095
HBSS (+Ca, +Mg) Gibco 14025-092 For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid Prepare in house12
10x MEM Gibco 11430-030
1M HEPES Gibco 15630-080
0.34N NaOH Prepare in house
Cover slips Corning 2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers Invitrogen A-20004
0.89M NaHCO Gibco 25080-094

References

  1. Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
  2. Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
  3. Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
  4. Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
  5. Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  6. Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
  7. Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
  8. Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
  9. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  10. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
  11. Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
  12. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  13. Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
  14. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
  15. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
  16. Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
  17. Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).

Play Video

Cite This Article
Barnes II, R. H., Chun, T. Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs). J. Vis. Exp. (114), e53890, doi:10.3791/53890 (2016).

View Video