지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup> 높은</sup> 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
세포 항원 1 (SCA1 또는 Ly6A / E)를 줄기 제 조혈 및 중간 엽 줄기 세포, 6으로 표시되는 세포 표면 마커로 확인되었다. 마우스 지방 저장소에서 얻은 지방 조직의 기질 혈관 분획 (SVF)는 섬유 아 세포, 대 식세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포 및 지방 세포의 전구 세포 (7)의 포함하는 세포의 이종 인구입니다. 지방 세포 전구 세포 또는 지방 – 유래 줄기 세포 (ASC를)는 풍부한 혈관 주위 콜라겐이 세포 외 기질 (ECM) (8)에있는 비 지질 함유 세포이다. CD34 + : SCA1 + 9 CD29 + – 약 SVF의 50 %는 혈통 음 (린)와 같은 특징의 ASC,로 구성되어 있습니다. 시험관에서의 지방 세포 분화 할 수있는 지방 세포 전구 세포 – CD24 : 이들 세포의 대부분은 SCA1 + 아르 그러나, 세포의 일부만 (SVF 0.08 %)의 구성을 SCA1 <s최대> + : 증식 및 생체 조건 9 지방 세포로 분화 완벽하게 할 수있는 CD24 + 세포. CD24에서 CD24 + 세포를 구별하지 않고 SCA1 + SVF를 사용한 전위주의에도 불구하고 – 면역 자기 세포 분리를 사용하여 지방 저장소로부터 SCA1 +의 ASC를 세포를 단리 차 지방 세포 전구 세포의 세포 자율 표현형을 결정하는 효율적이고 실용적인 접근 방식이다.
비만과 당뇨병, 조직의 섬유화와 염증의 분야에서 2 형 당뇨병 3의 개발과 유지에 중요한 역할을한다. 최근, 토쿠 나가 등. (VIS, 또는 내장) 서혜부 (또는 피하, SQ)과 perigonadal에서 분리 SCA1 높은 세포 C57BL6 / J 지방 저장소가 시험관 (10)의 서로 다른 유전자 서명과 ECM의 리모델링을 나타내는 것으로 나타났다. MMP14 (MT1-MMP), 막-t의 원형 회원YPE 매트릭스 메탈은 (MMP) 패밀리는 collagenolytic 활성 (1)을 백색 지방 조직 (WAT)의 개발을 매개한다.
다음 프로토콜을 통해 분리되고 농축 된 세포로 수행 될 수있다 실험 예는 삼차원 배양, 분화 연구, 콜라겐 분해 분석 및 RNA 서열 10, 11을 포함한다. 분해 분석은 텔로 펩타이드 (11, 12)의 보존을 보장하기 위해, 산 추출 콜라겐으로 수행되어야한다. 다음 프로토콜은 서로 다른 지방 저장소에서 주요 혈관 간질 세포를 분리 및 면역 자기 세포 분리를 이용하여 지방 세포의 전구 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 할 것이다. 셀 정렬의 유효성은 유동 세포 계측법으로하고 SCA1 프로모터 (13)에 의해 구동 SCA1 + 세포에서 GFP를 표현 SCA1-GFP 마우스를 사용을 통해 평가한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 고립과 다른 지방 패드에서 쥐의 ASC의 면역 자기 세포 분리 및 체외 실험에 사용을 보여줍니다. 제시된 방법의 ASC 9,14의 기술적으로 복잡하고 비싼 FACS 매개 분리를 통해 유리하다 SCA1 양성의 ASC의 많은 수의 빠른 분리에 효과적이다. FACS 달리 면역 자기 세포 분리는 표적 세포 모집단의 확인을위한 여러 항원의 사용을 허용하지 않는다. 표면 항원은 잘 특성화되면 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (THC에) NIH DK095137에 의해 지원됩니다. 우리는 기술 된 방법의 개발 및 고도화에 기여 현재 전 실험실 구성원 감사합니다.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
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