We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
स्टेम सेल प्रतिजन 1 (Sca1, या Ly6A / ई) पहली बार एक कोशिका की सतह मार्कर hematopoietic और mesenchymal स्टेम सेल 5,6 द्वारा व्यक्त के रूप में पहचान की थी। माउस वसा डिपो से प्राप्त वसा ऊतकों के stromal संवहनी अंश (SVF) fibroblasts, मैक्रोफेज, संवहनी endothelial कोशिकाओं, neuronal कोशिकाओं, और वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं 7 के शामिल कोशिकाओं की एक विषम आबादी है। वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं, या वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs) गैर लिपिड से लदी कोशिकाओं है कि कोलेजन युक्त परिवाहकीय बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 8 में निवास कर रहे हैं। CD34 +: Sca1 + 9 और CD29 + – लगभग SVF का 50% ASCs, जो वंश नकारात्मक (लिन) के रूप में की विशेषता है से मिलकर बनता है। ; वसाकोशिका पूर्वज है, जो इन विट्रो में वसाकोशिका भेदभाव करने में सक्षम हैं – CD24: इन कोशिकाओं के अधिकांश Sca1 + हैं हालांकि, केवल कोशिकाओं का एक अंश (SVF का 0.08%) Sca1 का गठन किया <sअप> +: CD24 + कोशिकाओं कि proliferating और इन विवो की स्थिति 9 में adipocytes में फर्क के लिए पूरी तरह से सक्षम हैं। CD24 से CD24 + कोशिकाओं भेदभाव के बिना Sca1 + SVF का उपयोग करने का संभावित चेतावनी के बावजूद – immunomagnetic सेल जुदाई का उपयोग वसा डिपो से, कोशिकाओं को अलग-थलग Sca1 + ASCs एक कुशल और व्यावहारिक दृष्टिकोण प्राथमिक वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं की सेल स्वायत्त phenotype निर्धारित करने के लिए है।
मोटापा और मधुमेह, ऊतक फाइब्रोसिस और सूजन के क्षेत्र में विकास और टाइप -2 मधुमेह 3 रखरखाव करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल ही में, Tokunaga एट अल। पता चला है कि Sca1 उच्च वंक्षण (या चमड़े के नीचे, वर्ग) और perigonadal (या आंत, तुलना) से अलग कक्षों C57BL6 / जम्मू वसा डिपो विट्रो 10 में विभिन्न जीन हस्ताक्षर और ईसीएम remodeling दिखा रहे हैं। MMP14 (MT1-एमएमपी), झिल्ली-टी के एक प्रोटोटाइप सदस्यype मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) परिवार अपने कोलेजनोलिटिक गतिविधि के माध्यम से 1 सफेद वसा ऊतकों (वाट) के विकास मध्यस्थता करता है।
प्रयोगों के उदाहरण है कि अलग-थलग और निम्नलिखित प्रोटोकॉल के माध्यम से समृद्ध कोशिकाओं के साथ आयोजित किया जा सकता तीन आयामी संस्कृति, भेदभाव अध्ययन, कोलेजन गिरावट assays, और आरएनए अनुक्रमण 10,11 शामिल हैं। गिरावट assays telopeptide 11,12 का संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए एसिड निकाले कोलेजन के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अलग वसा डिपो से प्राथमिक संवहनी stromal कोशिकाओं को अलग और immunomagnetic सेल जुदाई का उपयोग वसाकोशिका पूर्वज कोशिकाओं को समृद्ध करने के तरीकों का प्रदर्शन करेंगे। सेल छँटाई की वैधता से फ्लो के साथ और Sca1-GFP चूहों कि Sca1 + कोशिकाओं में व्यक्त GFP, एक Sca1 प्रमोटर 13 के द्वारा संचालित का उपयोग कर के माध्यम से मूल्यांकन किया जाएगा।
इस के साथ साथ हम अलगाव और विभिन्न वसा पैड से murine ASCs के immunomagnetic सेल जुदाई और इन विट्रो प्रयोगों के लिए उनके उपयोग प्रदर्शित करता है। प्रस्तुत विधि Sca1 पॉजिटिव ASCs की बड़ी संख्या है, जो ASCs 9,14 की तकनीकी रूप से …
The authors have nothing to disclose.
यह काम (THC के लिए) एनआईएच DK095137 द्वारा समर्थित है। हम वर्तमान और पूर्व प्रयोगशाला सदस्यों को जो विकास और वर्णित विधि का परिष्कार करने के लिए योगदान धन्यवाद।
Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
Scissors | FST | 14001-12 | Large |
Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
Large Forceps | FST | 11000-12 | |
Fine Forceps | Any vendor | ||
25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
70% ethanol | |||
Isoflurane | Any vendor | ||
Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
0.34N NaOH | Prepare in house | ||
Cover slips | Corning | 2870-22 | |
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |