Immunomagnetiska separation av fett Depot specifika Sca1<sup> hög</sup> Fetthärledda stamceller (ASC: er)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Stamcells antigen en (Sca1 eller Ly6A / E) först identifierades som en cellyta markör som uttrycks av hematopoetiska och mesenkymala stamceller 5,6. Den stromala kärlfraktionen (SVF) av fettvävnad erhållen från mus fettdepåer är en heterogen population av celler som består av fibroblaster, makrofager, vaskulära endotelceller, nervceller och fettceller progenitorceller 7. Adipocyt progenitorceller, eller adipösa-härledda stamceller (ASC: er) är icke-lipid-laden celler som uppehåller sig i det kollagenrika perivaskulära extracellulär matrix (ECM) 8. Cirka 50% av den SVF bestå av ASC: er, som karaktäriseras som lineage-negativ (Lin -) och CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. De flesta av dessa celler är Sca1 +: CD24 – adipocyt stamceller, vilka har förmåga att adipocytdifferentiering in vitro; dock endast en bråkdel av celler (0,08% av SVF) utgör Sca1 <supp> +: CD24 + celler som är fullt kapabel att prolifererande och differentiera till adipocyter i in vivo-förhållanden 9. Trots den potentiella nackdel med att använda Sca1 + SVF utan diskriminering CD24 + celler från CD24 – celler, isolera Sca1 + DSKer från fettdepåer med hjälp av immunmagnetisk cellseparation är ett effektivt och praktiskt sätt att bestämma cellautonoma fenotyp av primär fettceller stamceller.
När det gäller fetma och diabetes, vävnadsfibros och inflammation spelar en avgörande roll i utvecklingen och underhållet av typ-2-diabetes tre. Nyligen Tokunaga et al. visade att Sca1 höga celler isolerade från ljumsk (eller subkutan, SQ) och perigonadal (eller visceral, VIS) C57BL6 / J fettdepåer uppvisar olika gen signaturer och ECM remodeling in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), en proto medlem av membran typ matrismetalloproteinas (MMP) familjen förmedlar utvecklingen av vit fettvävnad (WAT) genom dess kollagenolytisk aktivitet 1.
Exempel på experiment som kan utföras med celler som isolerats och berikas genom följande protokoll inkluderar tredimensionella kultur, differentieringsstudier, kollagen nedbrytningsanalyser, och RNA-sekvensering 10,11. Nedbrytnings analyser bör utföras med syraextraherat kollagen för att säkerställa bevarandet av telopeptiden 11,12. Följande protokoll kommer att visa metoder för att isolera primära vaskulära stromaceller från olika fettdepåer och berika fettceller progenitorceller med hjälp av immunmagnetisk cellseparation. Giltigheten av cellsortering kommer att bedömas med flödescytometri och genom att använda Sca1-GFP möss som uttrycker GFP i Sca1 + celler, som drivs av en Sca1 promotor 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri visar vi isolering och immunmagnetisk cellseparation av murina DSK: er från olika fettkuddar och deras användning för in vitro-experiment. Denna metod är effektiv för snabb isolering av stora antalet Sca1 positiva DSKer, vilket är fördelaktigt över den tekniskt komplicerade och dyra FACS-medierad isolering av ASC: er 9,14. Till skillnad från FACS, betyder immunomagnetisk cellseparation inte tillåta användning av multipel antigen för identifieringen av en målcellpopulation. Men om y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH DK095137 (THC). Vi tackar nuvarande och tidigare lab medlemmar som bidragit till utvecklingen och förfining av de beskrivna metoderna.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
