La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup> alta</sup> Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
Antígeno de células 1 (Sca1, o Ly6A / E) del tallo fue identificado por primera vez como un marcador de superficie celular expresada por hematopoyéticas y mesenquimales células 5,6. La fracción vascular del estroma (SVF) de tejido adiposo obtenido de los depósitos de grasa del ratón es una población heterogénea de células que comprenden de fibroblastos, macrófagos, células endoteliales vasculares, células neuronales y células progenitoras de los adipocitos 7. Las células progenitoras de los adipocitos o células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son células no cargadas de lípidos que residen en la matriz extracelular rica en colágeno perivascular (ECM) 8. Aproximadamente el 50% de la SVF constan de ASC, que se caracterizan como linaje negativo (Lin -) y CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La mayoría de estas células se Sca1 +: CD24 – progenitores de adipocitos, que son capaces de diferenciación de adipocitos in vitro; sin embargo, sólo una fracción de células (0,08% de SVF) constituye Sca1 <sarriba> +: CD24 + células que son plenamente capaces de proliferar y diferenciarse en adipocitos en las condiciones in vivo 9. A pesar de la advertencia potencial del uso de Sca1 + SVF sin discriminar las células CD24 + CD24 de – células, aislar Sca1 + ASC de los depósitos de grasa utilizando la separación celular inmunomagnética es un método eficaz y práctico para determinar el fenotipo de células autónomas de las células progenitoras de los adipocitos primaria.
En el campo de la obesidad y la diabetes, fibrosis tisular y la inflamación juega un papel crítico en el desarrollo y mantenimiento de la diabetes de tipo 2 3. Recientemente, Tokunaga et al. mostraron que las células aisladas de alto Sca1 inguinal (o subcutánea, SQ) y perigonadal (o visceral, VIS) los depósitos de grasa C57BL6 / J exhiben diferentes firmas de genes y la remodelación de ECM in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un miembro prototípico de la membrana-tmetaloproteinasa de matriz ipo (MMP) de la familia media en el desarrollo del tejido adiposo blanco (WAT) a través de su actividad colagenolítica 1.
Los ejemplos de experimentos que pueden llevarse a cabo con las células aisladas y enriquecidas a través de la siguiente protocolo incluyen cultivo en tres dimensiones, los estudios de diferenciación, los ensayos de degradación de colágeno, y la secuenciación de ARN 10,11. Ensayos de degradación deben llevarse a cabo con el colágeno extraído con ácido para asegurar la preservación de telopéptido 11,12. El siguiente protocolo demostrará los métodos para aislar células del estroma vascular primarias de diferentes depósitos de grasa y enriquecer las células progenitoras de los adipocitos mediante separación celular inmunomagnética. La validez de la clasificación de células se evaluó con citometría de flujo y mediante el uso de ratones Sca1-GFP que expresan GFP en células Sca1 +, dirigido por un promotor Sca1 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento se demuestra el aislamiento y separación de células inmunomagnética de ASC murinos de diferentes almohadillas de grasa y su uso para experimentos in vitro. El método presentado es eficaz para el aislamiento rápido de gran número de ASC Sca1-positivo, que es ventajoso con respecto a los técnicamente complejo y costoso aislamiento FACS mediada de ASC 9,14. A diferencia de FACS, separación celular inmunomagnética no permite el uso de antígeno múltiple para la identificación…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el NIH DK095137 (THC). Agradecemos a los miembros del laboratorio actuales y anteriores que han contribuido al desarrollo y sofisticación de los métodos descritos.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
