Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique<sup> haute</sup> Cellules souches adipeuses (CSA)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
La tige antigène de cellule 1 (SCA1 ou Ly6A / E) a d' abord été identifié comme un marqueur de surface cellulaire exprimée par hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses 5,6. La fraction stroma vasculaire (FSV) du tissu adipeux obtenu à partir de dépôts de graisse de la souris est une population hétérogène de cellules comprenant des macrophages, des fibroblastes, des cellules endothéliales vasculaires, les cellules neuronales et les cellules progénitrices adipocytaires 7. Les cellules progénitrices d'adipocytes ou cellules souches dérivées de tissu adipeux (ASC) sont des cellules non-lipidiques chargées qui résident dans la matrice extracellulaire périvasculaire riche en collagène (ECM) 8. Environ 50% de la SVF se composent de ASCs, qui sont caractérisés comme lignée négative (Lin -) et CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La plupart de ces cellules sont Sca1 +: CD24 – progéniteurs adipocytaires, qui sont capables de différenciation des adipocytes in vitro; cependant, seule une fraction des cellules (0,08% de SVF) constitue Sca1 <sup> +: CD24 + cellules qui sont parfaitement capables de proliférer et de se différencier en adipocytes dans les conditions in vivo 9. Malgré la mise en garde potentiel d'utilisation Sca1 + SVF sans discrimination des cellules CD24 + de CD24 – cellules, isolement Sca1 + ASCs de dépôts de graisse à l' aide de la séparation cellulaire immunomagnétique est une approche efficace et pratique pour déterminer le phénotype cellulaire autonome des cellules progénitrices d'adipocytes primaires.
Dans le domaine de l' obésité et le diabète, la fibrose des tissus et de l' inflammation joue un rôle essentiel dans le développement et l' entretien du diabète de type 2 3. Récemment, Tokunaga et al. ont montré que SCA1 élevé des cellules isolées de inguinale (ou sous – cutanée, SQ) et perigonadal (ou viscérale, VIS) C57BL6 / J dépôts de graisse présentent différentes signatures génétiques et ECM remodelage in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un élément prototypique de la membrane tmatrice ype métalloprotéinase (MMP) famille médiatise le développement du tissu adipeux blanc (WAT) à travers son activité collagénolytique 1.
Des exemples d'expériences qui peuvent être effectués avec les cellules isolées et enrichies par le protocole suivant comprennent la culture en trois dimensions, des études de différenciation, des essais de dégradation du collagène, et le séquençage de l' ARN 10,11. Des essais de dégradation doivent être menées avec le collagène acide extrait pour assurer la préservation de télopeptide 11,12. Le protocole suivant démontrera les méthodes pour isoler les cellules stromales vasculaires primaires de différents dépôts de graisse et d'enrichir les cellules progénitrices d'adipocytes en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique. La validité du tri cellulaire sera évaluée avec cytométrie en flux et par l' utilisation de Sca1-GFP souris qui expriment la GFP dans Sca1 + cellules, entraînée par un promoteur Sca1 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici , nous démontrons l'isolement et la séparation cellulaire immunomagnétique de ASCs souris provenant de différents tampons de graisse et leur utilisation pour des expériences in vitro. La méthode présentée est efficace pour l'isolement rapide d' un grand nombre de ASCs de SCA1 positif, ce qui est avantageux par rapport à l'isolement techniquement complexe et coûteux FACS médiée par des ASCs 9,14. A la différence FACS, la séparation cellulaire immunomagnétique ne perm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le NIH DK095137 (THC). Nous remercions les membres du laboratoire actuels et anciens qui ont contribué au développement et à la sophistication des méthodes décrites.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
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