Introduction
Lungenkrebs ist die häufigste Ursache für Krebstod in der ganzen Welt ein. Die Erforschung der Prävention, Früherkennung und Behandlung von Lungenkrebs ist noch nicht abgeschlossen in vielen Forschungszentren auf der ganzen Welt 2,3. Mehrere Tiermodelle für Lungenkrebs entwickelt wurden, und sie wurden in die Untersuchung der Mechanismen der Lunge Karzinogenese und der Zellursprungs, bei der Bestimmung des Vorhandenseins von Krebsstammzellen als nützlich erwiesen, und in 4 verschiedene neuartige Therapiestrategien untersucht. Frühere Modelle verlassen Karzinogen-induzierte Tumor Einleitung in empfindliche Stämme von Mäusen 5. Die Entwicklung von Knockout und transgenen Mausmodellen , bei denen Lungenkrebs spezifisch manipuliert genetische Läsionen als Folge entsteht hat unsere Fähigkeit zur Kontrolle der Tumorinduktion und Mimik verschiedene Aspekte der menschlichen Lungenkrebs 4 wesentlich verbessert. Jedoch ist eine große Herausforderung in der Verwendung von Lungenkrebs Tiermodell das Fehlen einer Echtzeit-Methodegenau zu identifizieren und die Entstehung und Entwicklung von Tumoren in Mauslungen überwachen und in ihrer Größe, wie ihr weiteres Wachstum oder Reduktion in Reaktion auf Behandlungen Eine spätere Änderung zu dokumentieren. Dies hat Forscher gezwungen, einige Zeit zu greifen, Mühe und ressourcenintensive Techniken, um die Tumoren zu identifizieren und ihre experimentelle Ergebnisse zu bewerten. Das Vorhandensein von inhärenten inter Maus Variation in Reaktion auf Tumorinduktion erfordert die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren in jeder Versuchsgruppe Daten Variabilität zu reduzieren. Die Unfähigkeit, das Tumorwachstum oder die Reaktion auf die Behandlung in Echtzeit zu beurteilen, hat Forscher gezwungen, blind Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten in längeren Versuchsprotokolle euthanize zu gewährleisten, dass sie die richtigen Daten zu sammeln wird, was in der Verschwendung von Ressourcen aus den Proben zu den Zeitpunkten gesammelt, die entweder zu früh oder zu spät sind.
In der vorliegenden Studie wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Kleintier-Mikro c auszunutzenomputed Tomographie (Mikro-CT) Scanner zur Erkennung und Follow-up-Lungentumoren bei Mäusen leben eingeführt wird. Wir haben unser vor kurzem beschrieben Sftpc-rtTA und Tre-FGF9-IRES-eGFP doppelt transgenen (DT) Mäuse , die schnell Lungenadenokarzinom mit 6,7 Doxycyclin nach Induktion zu entwickeln. Der Einsatz von Mikro-CT ermöglicht es uns, (unter anderem) ausschließen Mäuse mit anomalen Lungenanomalien vor der Induktion, bestätigen Entwicklung von Tumorknoten in der Lunge nach der Induktion und beobachten Veränderungen in Tumorknoten in Reaktion auf experimentelle Behandlungen. End-Punkt-Euthanasie von Mäusen und histologischen Beurteilung bestätigt die Richtigkeit der Echtzeit-Beurteilung mit Mikro-CT durchgeführt. Wir glauben, dass diese Technik den Weg für die Durchführung ebnen wird besser geplante Experimente Lungenkrebs Tiermodellen und gleichzeitig wertvolle Ressourcen zu sparen, Beobachtungszeit zu verkürzen und die Genauigkeit und das Verständnis der Ergebnisse zu erhöhen.
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Protocol
Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Keio-Universität genehmigt.
Hinweis: In dieser Studie verwendeten wir die Sftpc-rtTA und Tre-FGF9-IRES-EGFP DT Mäuse , in denen schnell Lungenadenokarzinom nach Induktion durch Einspeisen entwickelt Chow Doxycyclin enthält 6,7. Allerdings können alle Bewertungsverfahren zu anderen Lungenkrebs-Mausmodelle angewendet werden.
1. Experiment Outline:
- Identifizieren Sie den Status der Lunge an der Grundlinie:
- Vor Tumorinduktion, wenn die DT-Mäuse sind von 8 bis 12 Wochen alt, führen Sie das erste Mikro-CT-Scan (siehe Abschnitte 2 und 3 unten). Dies dient als Lunge Baseline-Scan, bestätigt die Abwesenheit von spontan entwickelt Knöllchen durch ein undichtes Transgen verursacht werden, und dokumentieren das Fehlen einer bestehenden Lungenpathologie vor Tumorinduktion.
- Initiieren Tumorinduktion:
- Schalten Sie die DT-Mäuse von regulären chow Doxycyclin Chow Fibroblast Growth Factor (FGF) 9 - Expression in den alveolaren Zellen zu induzieren und die Tumorentwicklung einzuleiten. Geben Sie Doxycyclin Futter (200 ppm) ad libitum.
- Bestätigen Sie die Entwicklung von Tumorknoten in der Mäuselunge:
- Durchführen einer Mikro-CT-Scan die Entwicklung von Tumorknötchen im Vergleich zum Vorinduktion Scan zu identifizieren.
- Beurteilen Sie Ansprechen auf die Behandlung:
- Um die Fähigkeit der Mikro-CT-Test auf Veränderungen in Tumorknoten in Reaktion auf die Behandlung erkennen, zur Verwaltung der FGF-Rezeptor (FGFR) Inhibitor AZD4547, führen dann zusätzliche Mikro-CT-Scans nach 5 und 10 Wochen.
- End-Punktbewertung:
- Euthanize alle Behandlungs- und Kontrollmäuse und Prozess Gewebe zur histologischen Auswertung (siehe Abschnitt 6).
2. Vorbereitung Mäuse für Mikro-CT-Bildaufnahme:
- Schalten Sie den Mikro-CT-Scanner und Computer.
- Click an der Software mit dem Namen "R_m CT2", dann klicken Sie auf "warm up".
- Entfernen Sie die Probe Bett, auf dem wird die Maus von der Mikro-CT-Kammer platziert werden. Wickeln Sie das Bett mit Plastikfolie.
- Stellen Sie die Narkoseeinleitung Feld von Isofluran zur Anästhesie Verdampfer bis zur markierten Ebene hinzufügen. Stellen Sie die Isofluran-Strömungsgeschwindigkeit bei 3 l / min.
- Öffnen Sie den Sauerstofftank den Sauerstofffluss in der Induktionsfeld zu starten und stellen Sie den Durchfluss bei 1 l / min.
- Platzieren Sie die Maus in der Narkoseeinleitung Feld und bestätigen, dass sie tief durch das Fehlen einer spontanen Bewegung und in Reaktion auf eine Haut Prise (eine sanfte Prise eine kleine Hautfalte, die nicht Gewebeschäden oder Hautbruch verursacht) betäubt.
- Tragen Sie eine Augen Schmiermittel Hornhauttrockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Öffnen Sie die Mikro-CT-Kammer und legen Sie die Maus mit der Rückenseite nach oben auf die Probe Bett. Halten Sie den Kopf der Maus und ziehen Sie den Körper nach unten von den unteren Extremitäten in order zu strecken und den Körper symmetrisch zu begradigen.
- Drehen Sie die Anästhesie Fluss zum Induktionsfeld aus und dann weiter in Richtung der Röhre, die der Mikro-CT-Kammer verbindet.
- Legen Sie die Anästhesie Schlauch in die Nase des Maus kontinuierlichen Anästhetikum zu verabreichen.
- Um die Maus in Position zu fixieren; wickeln Sie die Maus und die Probe Bett mit Plastikfolie.
Hinweis: Es ist wichtig, die Maus unter tiefer Narkose zu halten und auf die Probe Bett gewickelt, weil jede kleine Bewegung oder Verdrehung des Körpers während des Scans in verschwommenen Bildern und Schwierigkeiten bei der Auslegung führen. - Schließen Sie die Mikro-CT-Kammer.
- Stellen Sie die Mikro-CT-System auf 90 kV und 160 & mgr; A und die Scan-Zeit auf 4,5 min. Stellen Sie den Bildbereich 24 × 19 mm und die Voxel-Größe 50 × 50 × 50 & mgr; m. Verwenden Sie den Synchronmodus für Herzschläge.
- Machen Sie einen neuen Ordner in der "Datenbank", um neue Bilder in diesem Ordner zu speichern.
- Starten Sie den Scan.
- Nach Abschluss des Scans, die Maus in einen leeren Käfig bewegen und es zu beobachten, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt. Setzen Sie es nicht mit anderen Mäusen, bis sie vollständig von den Auswirkungen der Anästhesie erholt hat.
3. Vorinduktion Micro-CT-Bild Visualisierung und Analyse:
- Um die Mikro-CT - Bilder sichtbar zu machen , laden Sie die kostenlose ImageJ Software von der folgenden Website: http://imagej.nih.gov/ij/ . Hinweis: Jeder Mikro-CT-Datendatei ist ein Stapel von etwa 500 TIF-Dateien (.tif). Andere Bildbetrachtungssoftware kann ebenfalls verwendet werden.
- Öffnen Sie die serielle Mikro-CT-Bilddateien und blättern Sie durch alle Bilder jeder Maus aus dem Hals auf den Bauch oder umgekehrt.
- Mit Scans von naiven Wildtyp - Mäusen, zu identifizieren , die Dichte der einzelnen Bereiche und normalen anatomischen Strukturen in der Brust basierend auf der Kenntnis der Maus Anatomie (siehe 1A).
- Halten Sie den Cursor mit derComputer-Maus und nach oben, von der weißliche Baucheingeweide und Zwerchfell beginnt, durch die Brust und bis zum Hals.
- Identifizieren Sie die knöcherne Brustkorb Sehenswürdigkeiten (Brustbeins in der Front, Wirbel im Rücken und Rippen an den Seiten).
- Identifizieren Sie das Herz in der vor der Brust und die großen Blutgefäße in der Nähe des Herzens und im Mediastinum.
- Beachten Sie die Trachea Lumen (als kleiner dunkler Kreis auf der Ebene des Halses und des oberen Brustbereich), die in die rechte gabelt und linken Hauptbronchus dann weiter in immer kleinere Bronchien zu verzweigen. Man beachte , dass jede Bronchus eng mit zwei oder drei Blutgefäße (1A) verbunden ist.
- Starten Sie die Scans von nichtinduzierten DT Mäuse untersuchen und das Vorhandensein von Anomalien zu identifizieren.
- Ausschließen Mäuse mit abnormal Vorinduktion Lungenschatten (beispielsweise Knoten, emphysematous bullae, etc.) von weiteren Experimenten. (1C-E, G, H
4. Tumorinduktion:
- Um die Tumorentwicklung bei Versuchsmäusen, die zeigten, normale Lungenscans, wechseln ihre Nahrung aus regulärem Futter Doxycyclin haltigen Futter (200 ppm) zu induzieren.
5. Follow-up-Scans:
- Nach 10 Wochen führen eine zweite Mikro-CT - Scan aller Mäuse , die Entwicklung von Tumorknoten in der Lunge zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
- Split Mäuse in zwei Gruppen. Verwalten des FGFR blocker AZD4547 (125 & mgr; g / kg / Tag über eine Magensonde für 6 Tage / Woche für 10 Wochen) zu einer Gruppe und einem Placebo auf die andere Kontrollgruppe für 10 Wochen.
- Folgen Sie den Veränderungen in den knotigen Schatten um ein Drittel Scan 4 Durchführung - später 5 Wochen.
- Am Ende der 10 Wochen der Behandlung, führen eine vierte Abtastung.
- Euthanize alle Mäuse mit CO 2 Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / 200 ul Pentobarbital.
- Nachidentifizieren die dynamischen Veränderungen der Tumorknoten nach Induktion und in Reaktion auf die Behandlung, identifizieren ähnlichen Positionen in den seriellen Scan - Bilder der gleichen Maus auf zwei oder mehr verschiedenen Zeitpunkten dann für das Aussehen ist / Verschwinden jeglicher abnormaler Schatten (Abbildung 3 ).
- Um die Identifizierung der gleichen Ebene in der gleichen Maus, zu verschiedenen Zeitpunkten zu erleichtern, versuchen, die Ebene von Interesse mit anatomischen Landmarke Strukturen innerhalb der Maus-Brust zu assoziieren.
- Verwenden Sie Sehenswürdigkeiten wie die Trachea, seine Gabelung rechts und links Haupt Bronchien, Aorta, Zwerchfell, und großen Blutgefäße.
Hinweis: Brust Knochen, einschließlich der Brustwirbel, Rippen und Brustbein sind weniger nützlich als Positionierung der Sehenswürdigkeiten wegen gemeinsamen kleinere Verkippungen in Mauskörperausrichtung auf dem Probenbett, was die Möglichkeit einer Fehlinterpretation der Scan-Position zu erhöhen. In ähnlicher Weise ist die Bildseriennummer innerhalb der Scandatei unzuverlässig für l Ermittlungg die gleiche Position im Laufe der Zeit zu einer anderen aufgrund der Änderung in dem Mauskörperlänge von einem Zeitpunkt. Fehler oder Ungenauigkeiten in der gleichen Ebene zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu identifizieren in falsch positive / negative Interpretation der Ergebnisse führen kann.
- Verwenden Sie Sehenswürdigkeiten wie die Trachea, seine Gabelung rechts und links Haupt Bronchien, Aorta, Zwerchfell, und großen Blutgefäße.
6. Maus-Euthanasie und Lung Collection:
- Euthanize Mäuse mit CO 2 Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / 200 ul Pentobarbital.
- Setzen Sie die Baucheingeweide durch in Längsrichtung durch die Bauchwand zu schneiden. Entlüften Sie die Maus, um das Volumen des Blutes in der Lunge durch Sezieren der Bauchaorta zu reduzieren.
- Slit die Membran mit einer feinen Schere; Dies führt zum Verlust des Unterdrucks aus der Brusthöhle zur Folge haben, wodurch die Lungen kollabieren. Setzen Sie die Lungen und das Herz durch Schneiden und Teile der Rippen der vorderen Brustwand zu entfernen. Reinigen Sie den vorderen Teil des Halses durch die Haut und Weichgewebe Schneiden der Trache aussetzenein.
- Schneiden Sie das Herz und die Thymusdrüse entfernt. Einfügen Zange hinter der Luftröhre aus der Speiseröhre zu trennen.
- Kanülieren die Trachea mit einem G24 Kanüle dann sichern Sie sie an Ort und Stelle durch einen Faden um den eingeführten Teil anziehen.
- Aufpumpen und fixieren die Lunge mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) durch die Trachealkanüle eine 25 cm Spalte. Nehmen Sie die Kanüle ein und ziehen Sie den Faden PFA ein Auslaufen zu verhindern, dann schneiden Sie die oberen Luftröhre aus ihrer Befestigung an der Larynx.
- Ziehen Sie die Luftröhre aus dem Nähfaden und sezieren sie aus ihrer Befestigung, und weiter nach unten it en -Block mit der Lunge zu entfernen. Setzen Sie ihn in einen 15-ml-Röhrchen, die 5 ml 4% PFA. Lassen Sie die Lungen in PFA O / N vollständigen Gewebepenetration und Fixierung zu gewährleisten, verarbeiten dann das Gewebe in einem Standard - Paraffinblock 8.
- Schneiden Sie Paraffinblöcke in 6 um dicke Scheiben auf einem Mikrotom und Flecken mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardtechniken. 7. Histologische Bewertung:
- Schalten Sie die Dia-Scanner Gerät und Computer.
- Klicken Sie auf das "NDP-Scan" -Software.
- Wählen Sie den Scan-Modus "Batch von Dias" und "Semi-Auto-Modus" zum Abtasten einer Reihe von Dias.
Hinweis: Der Roboterarm, der die Folien während der sequentiellen Abtastung nimmt sehr empfindlich auf Unregelmäßigkeiten an den Kanten der Glasträger. - Ertasten Sie die Ränder aller Glasplättchen, bevor sie in die Maschine geladen werden. Wenn es einen Vorsprung des Deckglases oder getrocknet Eindeckmediums ist, reinigen Sie es mit einem Messer oder einem Skalpell aus.
- Legen Sie die Folien in eine Folie Kassette. Öffnen Sie die Probe Luke und schieben Sie die Kassette in die Position "Eins";. Schließe die Tür.
- Auf dem Computer-Software, geben kurze beschreibende Namen für alle Folien in ihrer entsprechenden Position in der Kassette dann auf die Schaltfläche "OK" klicken.
- Wählen Sie das Profil-Modus: "Hellfeld".
- Klicken Sie auf "Start Batch", um die vorläufige Scanvorgang zu starten.
Hinweis: Sobald die Maschine fertig ist das Scannen alle Folien, wird die Software automatisch erkennt Bereiche mit Gewebe auf alle Folien und schlägt sie als Region von Interesse. - Falls erforderlich, neu zu definieren, indem Sie die Region von Interesse, die linke Maustaste und ziehen Sie die Region Grenze.
Hinweis: Definieren von übermäßig großen Flächen der Folien, wie die Regionen von Interesse in eine viel längere Zykluszeit führt. - Sobald zufrieden mit den Regionen von Interesse auf alle Folien, klicken Sie auf "Scannen" Scannen aller Dias zu starten.
Hinweis: Die gescannten Dateien digital in niedriger und hoher Auflösung beobachtet werden können, und Bilder können als JPEG exportiert werdenDateien.
Hinweis: Obwohl die Verwendung einer "slide scanner" für digitale histologische Auswertung hier beschrieben wird, wird die Verwendung von regulären Mikroskopen und visuelle histologische Auswertung zur Beurteilung möglich ist.
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Representative Results
Identifizierung von Mäusen mit Lungenerkrankungen wurde zu Beginn der Studie durchgeführt. Vor Tumorinduktion, wenn die DT-Mäuse waren 8 bis 12 Wochen alt sind, werden die Lungen aller Mäuse wurden mit Mikro-CT gescannt. Überraschenderweise etwa 50% der Mäuse zeigten Anomalien, die uns gezwungen, um sie für die Aufnahme in die nachfolgende Studie ungeeignet erachten. Diese Anomalien wurden knötchen wie Schatten, große einzelne oder mehrere kleine emphysematous bullae und / oder lobar atelectasis (1A, C, DE, GH). Dann wurde das FGF9 Transgen und Tumorinduktion activated.Only Mäuse , die eine normale Lungen Scans zeigten (ohne Auffälligkeiten) von regulärem Futter zu Doxycyclin Futter umgestellt wurden FGF9 Ausdruck in alveolären Zellen und die anschließende Entwicklung von Tumoren zu induzieren. Um die Entwicklung von Tumorknoten in der Mäuselunge nach zehn Wochen ab der Einleitung der Tumorinduktion bestätigen, Follow-up-Mikro-CT-Scans wurden durchgeführt. Dies ergab die development mehrerer Knötchen von variablen Größen in allen Mäusen (Abbildung 2, vergleiche A nach B und D bis E). Micro-CT-Scans wurden durchgeführt, die Reaktion auf die Behandlung zu bewerten. Diese zeigten , dass Mäuse, die den FGFR - Inhibitor AZD4547 10 Wochen lang in der Tat zeigte Verschwinden oder Verringerung der Größe von Knötchen verabreicht wurden, die in den Vorbehandlungs Scans sichtbar waren (Abbildung 3, zu vergleichen , Pre-, Post-Induktion und Nachbehandlungen, AC , EG und IK). Auf der anderen Seite, Kontrollmäuse , die nicht den FGFR - Inhibitor gegeben wurden und Placebo statt zeigte keine Änderung, Zunahme der Knötchen Größe und Auftreten neuer Knoten (Abbildung 3, MO); bestätigt, daß die Abnahme der Größe in der Behandlungsgruppe beobachtet, ist eine echte Wirkung der therapeutischen Intervention.
(1B, F, I) zeigte. Mäuse nach 10 bis 12 Wochen nach der Induktion mit Doxycyclin: Mehrere Adenokarzinom Knötchen mit variablen Größen und Positionen wurden bei allen Tieren (2C, F) beobachtet. Mäuse nach 10 bis 12 Wochen nach der Induktion Doxycyclin , gefolgt von 10 bis 12 Wochen ein FGFR - Blocker: Knötchen waren viel weniger zahlreich und kleiner (3D, H, L) im Vergleich zu den beobachteten nach der Induktion. Mäuse nach 10 - 12 Wochen Doxycyclin - Induktion durch 10 gefolgt - 12 Wochen Placebo: Mehrere große Knötchen sind sichtbar (Abbildung 3P) ähnlich bei der Post-Induktions Zeitpunkt auf diese gesehen.
Abbildung 1. Micro-CT Identifiziert Vorinduktion Lung Abnormitäten. Alle Mäuse , die mit Mikro-CT vor der Einleitung von Doxycyclin Induktion untersucht wurden. Bei Lungenerkrankung festgestellt wurden, wurden die Mäuse für die histologische Bestätigung eingeschläfert. Repräsentative Mikro-CT - Scan - Bilder für (A) eine normale Lunge, (C) Lungen mit einem atelectatic Bereich; (DE) Lungen mit emphysematous bullae und (GH) Lungen mit einer abnormen knotige Schatten. Die histologische Auswertung bestätigt die Genauigkeit der Mikro-CT - Befund: (B) eine normale Lungen Histologie, (F) mehrere emphysematous Bereiche; und I) mehrere Tumorknötchen. Maßstabsbalken: 200 & mgr; m.53904fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Micro-CT Identifiziert die Entwicklung von Tumorknötchen nach Induktion. Die Mäuse , die eine saubere Vorinduktion zeigte Scan Doxycyclin Futter gefüttert wurden für 10 Wochen , dann neu bewertet mit Mikro-CT, wonach sie für die histologische Auswertung eingeschläfert wurden. Repräsentative Mikro-CT - Scan - Bilder von zwei verschiedenen Mäusen zeigen das Aussehen von mehreren knotige Schatten 10 Wochen nach Beginn der Doxycyclin Futter. (A, D) Vorinduktion saubere Lunge, (B, E) Same-Position Scanbilder zeigen die Entwicklung von multiple Knoten (rote Pfeile). Kleine gelbe Pfeile zeigen auf die anatomische Orientierungspunkte verwendet , um die gleiche Position zu verschiedenen Zeitpunkten zu identifizieren. (C, F) Knötchen in der Mikro-CT - Scan waren c gesehenin der Lunge histologischen Schnitten onfirmed. Maßstabsbalken:. 200 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Micro-CT Identifiziert Veränderungen der Tumorknötchen in Reaktion auf die Behandlung. Die Mäuse , die saubere Vorinduktion Scans zeigten , wurden Doxycyclin Futter für 10 Wochen gefüttert, und dann eine nach der Induktion Mikro-CT durchgeführt wurde. Als nächstes wurden sie den FGFR-Inhibitor AZD4547 für weitere 10 Wochen und neu bewertet mit Mikro-CT (Nachbehandlung) verabreicht. Kontrollmäuse wurden mit Placebo statt des FGFR-Inhibitor verabreicht, um die tatsächliche Wirkung der therapeutischen Intervention zu klären. Schließlich wurden die Mäuse für die histologische Auswertung euthanasiert.
Representative Mikro-CT - Scan - Bilder von vier verschiedenen Mäusen. (A, E, I, M) (B, F, J, N) Scans aus der gleichen Mäuse , nachdem sie über 10 Wochen mit Doxycyclin Futter induziert wurden. alle mehrere Knötchen zeigte (rote Pfeile, die rote oval umgibt einen Bereich, der vollständig abgeschattet von Knötchen worden war). (C, G, K) Scans aus der gleichen Mäusen nach weiteren 10 Wochen nach der Behandlung mit der FGFR - Inhibitors zeigt das vollständige Verschwinden oder deutliche Reduktion in der Größe von Knötchen. (O) Scannen von einer Kontrollmaus , die Kontrollgruppe dar , die ein Placebo statt des FGFR - Inhibitors zeigt Anstieg der Tumorknötchen 'Größe und Anzahl verabreicht wurde. Kleine gelbe Pfeile zeigen auf die anatomische Orientierungspunkte verwendet , um die gleiche Position zu verschiedenen Zeitpunkten zu identifizieren. (D, H, L) Histologische Schnitte , die deutliche Verringerung der Knötchengröße und Anzahl bestätigt (vergleiche 2 C und F auf Figur). (P) zeigt die Presence von mehreren Tumorknoten, wenn wurde Placebo verabreicht. Maßstabsbalken:. 200 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Mikro-CT-basierte Methode, die hier für die Echtzeit-Erkennung von Lungen Abnormalitäten und Überwachung der Entwicklung von Tumorknoten und dem Ansprechen auf die Behandlung von Lungenkrebs Tiermodelle beschrieben wird Wissenschaftlern ermöglichen, die Lungenkrebs bezogenen führen Versuche mehr zu planen präzise und effiziente Experimente während Zeit und Ressourcen zu sparen. Wir haben zuvor MRI für den gleichen Zweck 6 verwendet. Die Klarheit des Scan- und Schwelle für den Nachweis von Lungenknoten mit MRI waren schlechter als die mit den Mikro-CT - Scans in dieser Studie 6 beschrieben.
Frühere Studien , die ähnliche Lungenadenokarzinom Mäuse Modelle (mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und Tumorinduktion Methoden) hatte offenbar mehrere Nachteile, die hätte vermieden werden können oder verbessert hatten sie verwendet Mikro-CT - Scan 9,10. Sie hatten keine Mittel, keine Vorinduktion Lunge Anomalien oder Knötchen zu identifizieren, so riskieren verwirrendeihre Ergebnisse durch die Aufnahme ungeeigneter Tiere. Sie hatten auch keine Mittel, um die Entwicklung von Tumoren nach der Induktion oder nach ausbreitende Krebszellen in Wildtyp-Mäusen zu bestätigen (Sekundärtumoren zu induzieren), so mussten sie für 4-8 Monate warten, dann die Mäuse blind einschläfern für die histologische Identifizierung von Tumoren. Wenn diese Modelle wurden verwendet, um das therapeutische Potential eines Arzneimittels zu bewerten, hatten Forscher mehreren Gruppen zuzuordnen in einer chronologischen Reihenfolge eingeschläfert werden, um die Wirkung der Behandlungen auf die Tumorknötchen mit Histologie zu detektieren und den Zeitpunkt der maximalen Wirkung zu erkennen zu können 11.
Eine Beschränkung unseres Verfahrens ist jedoch das Auftreten von verschwommenen Schatten , die die Erkennung von Knötchen in den Lungen verdunkeln , wenn einige Fremdstoffe injiziert werden , intratracheal 7 (Daten nicht gezeigt). Einige Mäuse schien eine verlängerte Entzündungsreaktion auf das injizierte Substanz und den Schatten dieses Reacti zu entwickelnauf und Begleit die vorhandenen Knötchen interstitielle Ödeme maskiert. In solchen Fällen kann MRI als eine Alternative versucht werden.
Vor kurzem haben andere Bildgebungsverfahren eingeführt worden, um verschiedene Erkrankungen bei Kleintieren zu bewerten; wie Biolumineszenz - Bildgebung 12 und Positronen - Emissions - Tomographie (PET) -Scan 13. Unseres Wissens sind diese Abbildungssysteme noch nicht verwendet worden, Lungentumoren in Mäusen Modellen zu bewerten, so Vergleich der Detektionseffizienz und Bildklarheit mit Kleintier MRI und Mikro-CT-Bilder noch nicht möglich ist. Die Verfügbarkeit und die Kosten dieser Maschinen sind ein begrenzender Faktor für die weitverbreitete Anwendung.
Wir haben festgestellt Lungen Abnormalitäten in etwa 50% der Mäuse am Vorinduktion Screening und dementsprechend diese Mäuse wurden von weiteren Experimenten ausgeschlossen. Diese hohe Inzidenz von Anomalien könnten das Ergebnis eines "leaky" FGF9 Transgen in einigen Tieren in der Entwicklung von Tumorknoten resultierenden seins , noch bevor sie 14 induziert werden. Tatsächlich etwa die Hälfte der Tiere ausgeschlossen, wenn die Anwesenheit von mehreren kleinen Knötchen histologisch zeigte untersucht. Diese könnten auch durch eine aberrante Wirkung des eingesetzten Transgen auf den benachbarten Gene im Mausgenom 14 verursacht werden. Die Entwicklung dieser Art von Anomalien sind keineswegs spezifisch für die Sftpc-rtTA und Tre-FGF9-IRES-eGFP doppelt transgenen Mäusen und damit andere Lungenkrebs Modelle könnten von ähnlichen Situationen leiden. Diese hohe Inzidenz von Anomalien Highlights auch-mehr die Bedeutung der Pre-Aufnahme-Screening von Mäusen Mikro-CT. Naïve Wildtyp - Mäusen zeigte nie irgendwelche abnormen Schatten auf Mikro-CT (Abbildung 1A).
Zusammenfassend haben wir ein Verfahren beschrieben, das ein kleines Tier Mikro-CT-Gerät für die genaue Erfassung und Überwachung der Entwicklung von Tumorknoten in den Lungen eines Adenokarzinoms Mausmodell nutzt. Durchindem es Veränderungen in Knötchen über die Zeit zu überwachen, können genauere Daten gesammelt werden, und eine kostengünstige und zeitspar zeitlichen Verlauf angepasst werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss-in-Aid von JSPS KAKENHI für AEH (Grantnummer 25461196) und TB (Zuschuss-Nummern 23390218 und 15H04833) und National Institutes of Health Zuschuss HL111190 (DMO) unterstützt. Die Autoren möchten sich bei der Unterstützung mit Tier Genotypisierung und der Herstellung von histologischen Schnitten Miyuki Yamamoto für ihre Bemühungen anzuerkennen. Wir sind dankbar, dass die Collaborative Research Resources, School of Medicine, Universität Keio für den technischen Support und Reagenzien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
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