Introduction
Les plantes sont largement utilisées pour produire des produits alimentaires tels que les jus de fruits, mais ils peuvent aussi être développés comme des plates - formes pour la fabrication de plus forte valeur ajoutée des produits biopharmaceutiques 1-3. Dans les deux cas, le traitement en aval (DSP) commence souvent par l'extraction de liquides à partir de tissus tels que les feuilles ou les fruits, suivie par la clarification des extraits chargés de particules de 4,5. Pour la fabrication de produits biopharmaceutiques, les coûts de DSP peuvent représenter jusqu'à 80% des coûts de production globaux 6,7 et cela reflète en partie la forte charge des particules présentes dans des extraits préparés par des méthodes perturbatrices telles que l' homogénéisation à base de lame 8,9 . Bien que la sélection rationnelle des couches de filtre pour correspondre à la distribution des tailles de particules dans l'extrait peut augmenter la capacité de filtrage et de réduire les coûts 10,11, l'amélioration ne peut jamais dépasser la limite de capacité absolue définie par le nombre de particules qui doivent être retenues parunité de surface de filtre pour obtenir des éclaircissements.
Le plafond peut être levée si moins de particules atteignent la surface des meilleurs filtres dans le train de filtration, et ceci peut être réalisé que si les particules dispersées sont mélangées avec des polymères connus comme agents floculants qui favorisent l' agrégation pour former de grands floculats 12. Ces flocs peuvent être conservés plus en amont par des filtres grossiers et moins coûteux sac, ce qui réduit la charge de particules atteignant la plus fine et les filtres de profondeur plus chers. Les polymères doivent avoir des profils de sécurité adaptés à leurs applications, par exemple pour les produits biopharmaceutiques , ils doivent être conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), et généralement , ils doivent avoir une masse molaire> 100 kDa et peut être soit neutre ou chargé 13. Considérant que floculants neutres agissent généralement par réticulation des particules dispersées provoquant leur agrégation et la formation de flocs avec des diamètres> 1 mm 11, des polymères chargés de neutraliser la charge de dparticules ispersed, réduisant leur solubilité et provoquant ainsi la précipitation 14.
La floculation peut être améliorée en ajustant des paramètres tels que le pH du tampon ou de la conductivité et du type de polymère ou de concentration, en fonction des propriétés de l'extrait 15,16. Pour les extraits de tabac prétraités avec 0,5-5,0 g L -1 polyéthylènimine (PEI), une augmentation de plus de 2 fois la capacité de filtration en profondeur a été rapporté dans un processus à l' échelle pilote 100-L. Le coût de ce polymère est inférieure à 10 € kg -1 de sorte que son introduction dans le processus ont entraîné des économies de coûts d'environ € 6.000 pour les filtres et consommables par lot 16 ou encore plus lorsqu'il est combiné avec base de cellulose filtre aides 17. Même ainsi, les modèles prédictifs sont nécessaires pour évaluer les a priori des avantages économiques de floculants parce que leur inclusion peut nécessiter des étapes de maintien de 15-30 min 16,18, ce qui entraîne des coûts supplémentaires d'investissement pour le stockageles chars. Cependant, il n'y a pas de modèles mécanistes disponibles qui peuvent prédire les résultats de ces expériences en raison de la nature complexe de la floculation. Par conséquent, une expérience de conception de-plus appropriés (DoE) approche 19 a été développé comme décrit dans cet article. Un protocole pour la procédure générale DoE a récemment été publiée 20.
Dispositifs à petite échelle sont maintenant disponibles pour le criblage à haut débit des conditions de floculation 21. Toutefois, ces dispositifs ne peuvent pas simuler de façon réaliste les conditions au cours de la floculation des extraits de plantes, car les dimensions du récipient de réaction (~ 7 mm pour les puits sur une plaque à 96 puits) et les particules ou flocs peuvent être inférieur à un ordre de grandeur d'intervalle. Cela peut affecter le mélange des modèles et donc la puissance prédictive du modèle. En outre, il peut être difficile de réduire les processus impliquant la précipitation en raison de changements non linéaires dans la conduite de mélange et le précipité stabilité 22. Par conséquent, cet article décrit un système de criblage paillasse échelle avec un débit de 50-75 échantillons par jour, ce qui donne des résultats qui sont évolutives à partir du volume de réaction de 20 ml initiale à un processus à l'échelle pilote 100 L 16. Lorsqu'il est combiné avec une approche DoE, ce qui permet aux modèles prédictifs pour être utilisés pour l'optimisation des processus et de la documentation dans le cadre d'un concept de qualité par la conception.
La méthode décrite ci - dessous peut également être adapté aux produits biopharmaceutiques produites dans des procédés à base de culture cellulaire, où les floculants sont également considérés comme un outil de réduction des coûts 23. Il peut également être utilisé pour modéliser la précipitation des protéines cibles à partir d' un extrait brut dans le cadre d'une stratégie de purification, comme l'a démontré pour la β-glucuronidase produite dans le canola, le maïs et le soja 24,25. Une description détaillée des propriétés de floculant peut se trouver ailleurs 16,26 et il est important de veiller à ce que le polymère concentrations sont soit non toxique ou au- dessous des niveaux nocifs dans le produit final 11.
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Protocol
1. Élaborer une stratégie expérimentale adéquate
- Identifier les paramètres environnementaux et de processus qui sont pertinentes pour la procédure de floculation à établir ou optimisé, à savoir quels facteurs ont le plus d' effet sur la floculation. En règle générale, il existe plusieurs paramètres pour une approche DoE comme récemment décrit 20 est nécessaire en raison de l'absence de modèles mécanistes.
- Sélectionnez les paramètres (facteurs) sur la base de données de la littérature, 12 connaissance préalable et de l' expérience avec le système. Les facteurs typiques comprennent un tampon pH, la conductivité du tampon, le temps d'incubation et de la température ainsi que le type de polymère et la concentration 15,16,27.
- Utilisez les mêmes références (voir 1.1) pour définir des plages significatives pour chaque facteur numérique et les niveaux des facteurs catégoriques.
- Définir les résultats expérimentaux (réponses) à surveiller et utilisés pour évaluer l'efficacité de la floculation. Selon le système, cepeut être la turbidité du filtrat ou du surnageant, la vitesse de décantation, la taille des agrégats ou la capacité d'un filtre ultérieur 16,23,28-30.
- Vérifiez que les tests utilisés pour mesurer les réponses sont quantitatives, robuste et reproductible / reproductible de sorte que les données de haute qualité qui en résultent peuvent être complétées par des expériences réalisées plus tard, ou par un autre opérateur.
- Choisissez un type DoE convenant le nombre de facteurs à étudier et le degré de connaissances déjà accumulées sur le système. Utilisez la littérature disponible pour identifier un type de 20 appropriée DoE.
- Choisissez un modèle de dépistage s'il y a peu d'informations sur le système de floculation à étudier, un grand nombre de paramètres doit être projeté ou peu est connu sur les plages significatives pour les paramètres. conceptions de dépistage typiques sont les plans factoriels complets et fractionnaires. Inclure des points centraux dans la conception si les paramètres sont censés avoir un impact non linéaire, par exemple 19.
- Sélectionnez une méthodologie de surface de réponse (RSM), par exemple le centre de conception composite (CCD) 31 ou optimale 32,33, si seulement quelques facteurs avec des gammes bien connues doivent être caractérisés avec précision.
- Mettre en place le DoE avec un logiciel approprié, en veillant à un critère de qualité a priori tels que la fraction de l' espace de conception sont remplies 20.
2. Préparer les expériences floculation
Figure 1: échelle du procédé ( à gauche) et à l' échelle de paillasse ( à droite): flux de production extrait floculation usine. Après l'extraction de protéines avec des tampons aqueux, des particules dispersées de débris cellulaires sont regroupées par l'addition de floculants. Les agrégats sont ensuite éliminés par une cascade de sac et la filtration en profondeur et la capacité de ceux-cifiltres ainsi que les turbidités de filtrat peuvent être utilisés directement pour mesurer l'efficacité de la floculation.
- Développer un expérimental général de flux de travail (Figure 1).
- Utiliser un dispositif d'extraction qui aboutit à la même distribution de taille de particule attendue (ou déjà observé) à l'échelle de l' application finale, par exemple un homogénéiseur spécialisé. Si possible, la conception d' un modèle à échelle réduite de l'extracteur de la manière décrite pour l'homogénéisation de feuilles de tabac 10.
- Définir les volumes d'extraction utilisés lors des expériences de floculation (ici 20 ml). Sélectionner un volume qui permet un nombre représentatif de particules soit présente dans le récipient de réaction, par exemple , des expériences de floculation dans aliquotes de 20 ml ont donné des résultats reproductibles et adaptables pour les extraits de tabac contenant environ 7% [w / v] solides 34 et des tailles de particules de ~ 0,5 um à 3 mm ~ 16.
- Concevoir toutes les opérations de surveillance et de post-floculation de telle sorte que eey sont représentatifs de l'échelle de l' application finale, par exemple sélectionner des filtres avec le même comportement de rétention de particules que celles utilisées à l'échelle de production.
- Cultiver les plantes dont les extraits seront dérivés.
- Utilisez la même ligne de plante, ici Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, et les conditions de culture qui seront utilisés lors de la production , comme décrit précédemment 33.
- Si d' autres stocks d'alimentation seront traitées, la préparation de ces stocks d'aliments pour animaux afin qu'ils soient représentatifs de l'échelle de l' application finale, par exemple utiliser des tampons authentiques, prendre en compte toutes les étapes de dilution au cours du processus et le bâton du pH et de la conductivité prévue, ici pH 7,5 et conductivité 30 mS cm -1.
- Préparer Filtration Utilities, Dispositifs de turbidité-Surveillance et récipients d'échantillonnage.
- Couper les matériaux filtrants aux dimensions requises, ici 15 x 15 cm 2, si elles ne sont pas prêts à nousmodules e. Vérifiez que tous les dispositifs de surveillance et d'analyse sont fonctionnels et étiqueter tous les tubes d'échantillons.
- Même si ce sont des tâches simples, préparer ces articles à temps pour veiller à ce qu'ils ne seront pas provoquer des interruptions pendant les expériences de floculation réelles. Évitez les retards, car ils peuvent interférer avec les résultats, étant donné que la floculation est un processus dépendant du temps.
- Préparer Flocculant Solutions mères. ATTENTION: Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation des floculants, par exemple des gants. Les matériaux peuvent être dangereuses (étiquettes de danger selon l'Europe UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE comprennent N, Xi ou Xn). Évitez la poussière et consulter les fiches de données de sécurité. Travailler sous une hotte.
- Choisissez une concentration de stock pour chaque floculant, ici 80,0 g L -1 pour les deux floculants PEI qui ont été utilisés. Sélectionnez des concentrations aussi élevées que possible pour éviter la dilution des échantillons lors de l'ajout du floculant, ce qui réduirait concentra de particulestion et affectent ainsi l'efficacité floculation.
- Compte pour toute pré-dilution qui reflète la formulation du polymère du fabricant, par exemple si le polymère est déjà fourni en solution aqueuse à 50% [p / v] solution. solutions mères floculant de 4-8% [p / v] se sont révélés être le plus approprié à ce jour.
- Ayant à l'esprit les points évoqués ci-dessus, assurez-vous que la concentration de floculant ne génère pas une solution très visqueuse qui inhibe pipetage, causant potentiellement des erreurs parce que la concentration de floculant finale ne soit pas réglé correctement.
- Utilisez la même concentration en stock pour tous les floculants, si possible, parce que cela va faciliter la mise en place d'un système de pipetage (2,5), réduisant ainsi la probabilité d'erreurs.
- Ajuster le pH et la conductivité de chaque solution mère floculant pour correspondre aux conditions des extraits, ici pH 4-10 et 15-55 conductivité mS cm -1. Préparer des actions individuelles pour un seul floculant si mle minerai d'un ensemble de pH et / ou de conductivité conditions est testé pour ce polymère.
- Préparer des solutions de floculants fraîchement, pas plus de 48 h avant utilisation. Même si la floculation peut être induite avec des stocks de polymère stockées pendant plus de 4 semaines, l'efficacité peut diminuer en raison de l'hydrolyse du polymère à des valeurs élevées ou faibles pH. Consultez la documentation du fabricant pour plus de détails.
- Assurez - vous que les paramètres sélectionnés pour le DoE peuvent être ajustés avec précision pour chaque échantillon au cours de l'expérience, par exemple , assurer qu'il ya des bains de chauffage / refroidissement disponibles pour ajuster les températures d'incubation, ici 4 ° C, 20 ° C et 37 ° C. Si le mélange pendant la floculation fait partie de l'expérience, veiller à ce que le dispositif de mélange est représentatif de l'échelle de l'application finale en termes de paramètres critiques tels que l'entrée d'alimentation.
- Convertir le DoE annexe dans un schéma de pipetage.
- Convertir les différentes concentrations de floculants pour être tested en volumes de solution de réserve qui seront ajoutés aux échantillons d'extrait: diviser les concentrations de floculants finales par la concentration des stocks et multiplier par le volume d'échantillon utilisé dans les expériences de floculation. Identifier le plus grand volume final résultant, par exemple , si 20 ml d'échantillon est mélangé avec un maximum de 2 ml floculant solution mère ce sera 22 ml.
- Calculer les volumes de tampon nécessaire pour maintenir le même volume final dans tous les aliquotes de floculation sur la base du plus grand volume de floculant actions à ajouter, par exemple si 0,75 ml de stock floculant doit être ajouté à un échantillon , puis 1,25 ml de tampon est nécessaire pour maintenir la volume final de l'échantillon de 22 ml (2.5.1).
- Résumez les volumes de solution mère floculant pour chaque condition de polymère et la floculation pour calculer les volumes absolus de solution stock qui sont nécessaires pour le DoE.
- Récolte des feuilles de tabac et préparer l'extrait.
- Retirer les six premiers leafs (ou le plus grand nombre , comme indiqué par les instructions de process) à partir de plants de tabac d'un âge approprié, par exemple l' âge de 6 semaines, et le transfert à un dispositif d'extraction approprié , tel qu'un homogénéisateur ou presse à vis.
- Ajouter trois volumes de tampon d'extraction par gramme de biomasse, par exemple 300 ml pour 100 g, et mélanger pendant 8 min.
- Préparer des extraits individuels avec les tampons appropriés, si le pH et / ou des conductivités différentes sont testées. Ici, cela implique l' homogénéisation du matériel végétal pour 3 x 30 sec dans un mélangeur ou un pressoir 34.
- En variante, la préparation de l'extrait d'une manière qui est représentative du procédé objet de l'enquête.
- Aliquoter l'extrait et Ajouter de la mémoire tampon.
- Agiter manuellement et soigneusement l'extrait pendant toute la procédure pour garantir que les échantillons sont homogènes avec une répartition uniforme des particules.
- Distribuer avec précision l'extrait parmi les tubes de réaction de pré-marqués décante,ici 20 ml dans chaque récipient. Autoportant tubes de 50 ml de simplifier la manipulation et sont idéales pour 20 ml d'échantillons.
- Ajouter le volume de chaque tampon d'extraction nécessaire pour maintenir le volume final fixé pour chaque tube de réaction individuelle à l'aide d'une pipette appropriée.
3. floculer les extraits de plantes avec différents polymères
- Pipeter le volume requis de solution stock floculant, ici 0,1-2,0 ml, aux échantillons séquentiellement comme indiqué par l'ordre d'exécution aléatoire du DoE. Bien mélanger chaque échantillon immédiatement après l'addition de floculant par une intense agitation pendant manuel précisément 20 sec.
- Si nécessaire, ajuster la durée d'agitation pour d'autres stocks d'alimentation pour assurer un mélange complet, mais veiller strictement des temps de mélange uniformes pour tous les échantillons. Gardez à l'esprit que le mélange prolongé peut provoquer la rupture irréversible des flocs et incohérente force appliquée pendant l'agitation peut fausser les résultats de floculation.
- Facultatif: Modifiez la procédure décrite ci-dessus pour l'application simultanée de deux ou plusieurs floculants.
- Option 1: au lieu d'un seul polymère ajouter un mélange de deux ou plusieurs floculants, ici PEI et le chitosan. Utilisez les combinaisons de floculants définies dans le DoE. Incorporer le rapport et les concentrations absolues des polymères en tant que paramètres individuels lors de la configuration DoE (1.1).
- Option 2: ajouter deux ou plusieurs polymères séquentiellement à l'extrait.
- Utiliser les concentrations individuelles de polymère, leur type et le temps d'incubation entre chaque addition de l'extrait, en tant que facteurs supplémentaires lors de la configuration du DoE.
- Également utiliser cette approche pour tester si l'addition répétée d'un seul polymère peut améliorer la floculation. Utilisez une addition par étapes pour simuler la lente addition d'un floculant, par exemple quatre étapes, chacune ajoutant 0,25 ml 80 g L -1 floculant bouillon à 20 ml de volume de plus de 4 min peut imiter l'addition de floculant avecun débit de 0,25 ml min -1.
- Dans tous les cas, d'identifier un nouveau volume d'échantillon final maximal pour cette configuration en ajoutant les volumes maximaux de tous les floculants pour le volume d'échantillon, ici encore 22 ml, et recalculer les volumes requis de solutions et tampons d'achat d'actions floculants pour le réglage du volume si nécessaire.
- Incuber les échantillons pour les temps définis dans le DoE, typiquement 3-30 min, pour permettre la formation de floc. Assurez - vous que toutes les autres conditions d'incubation, par exemple la température, sont fixés selon le DoE.
- Observer et formation document de floc. Notez les progrès de la formation de floc selon les besoins, par exemple en mm de floc de décantation par minute en mesurant la hauteur des solides décantés. Le cas échéant, de prolonger la floculation pendant une période de temps prolongée par exemple la nuit.
- Filtrer l'extrait floculée.
- Utiliser les matériaux filtrants préparés précédemment (2.3) afin de clarifier l'extrait floculée après la appropriéele temps d'incubation en décantant les échantillons floculés à travers le matériau filtrant et dans un récipient de réaction ou tube propre.
- Ne pas remettre en suspension les flocs réglées avant filtration et appliquer l'extrait avec à un taux de ~ 300 ml min -1 au filtre, correspondant à 3-4 s pour un échantillon de 20 ml.
- Confirmer l'exécution de l'étape de filtration , si un autre matériau est utilisé dans les expériences de paillasse par rapport au processus final en termes de rétention de particules, par exemple en mesurant la distribution des tailles de particules dans les deux types d' échantillons 11.
- Analyser le filtrat en termes de turbidité et / ou la distribution de la taille des particules en utilisant des dispositifs appropriés nécessaires, par exemple un turbidimètre.
- Facultatif: répéter l'analyse après des temps d'incubation prolongée, par exemple 12-24 heures, pour étudier la formation ou reformation de flocs instables.
- Utiliser les matériaux filtrants préparés précédemment (2.3) afin de clarifier l'extrait floculée après la appropriéele temps d'incubation en décantant les échantillons floculés à travers le matériau filtrant et dans un récipient de réaction ou tube propre.
- Analyser les échantillons en termes de PrRéponses de e-défini (1.1.3).
- Prélever des échantillons à partir des filtrats et de les analyser pour les paramètres de réponse supplémentaires, par exemple , les concentrations de différentes protéines cibles ou des produits de valeur.
- Facultatif: Analyser le rétentat (principalement solides) pour les mêmes paramètres pour fermer le bilan massique du processus. En particulier, de quantifier l'effet de floculants sur la récupération de liquide en comparant les solides de masse restants après que les échantillons sont traités ou non traités avec floculant.
- Confirmer la qualité des données et transférer les résultats vers le logiciel DoE.
- Rechercher des valeurs extrêmes dans les données de réponse recueillies, par exemple des valeurs anormalement élevées.
- Veiller à ce que toutes les données de réponse sont correctement alignées avec leurs conditions expérimentales correspondantes.
- Transférer les résultats dans le logiciel DoE et assurez-vous que les ordres d'exécution standard et randomisés ne sont pas mélangés.
4. Évaluerle DoE
- Utilisez les outils d'analyse de données intégrées du logiciel DoE pour développer un modèle prédictif comme décrit précédemment 20.
- Sélectionnez un mode de transformation de données appropriée si nécessaire pour faciliter la construction modèle, ici log 10. Un rapport supérieur à 10 pour la plus grande la plus petite valeur de réponse par rapport indique qu'une transformation de données peut être requise. Identifier la transformation la plus appropriée à l' aide des outils statistiques appropriés, par exemple un terrain Box-Cox 35.
- Choisissez un modèle de base (i) Convient au DoE sélectionné (1.2) et (ii) est d' accord avec les connaissances antérieures sur le système visé par l' enquête sur la base de l'analyse de variance (Anova) Outils du logiciel DoE, par exemple un polynôme de second ordre adapte souvent mieux à l'effet observé du temps d'incubation d'un polynôme de premier ordre.
- Retirer les facteurs insignifiants du modèle, par exemple , p> 0,05, ou les interactions des facteurs itérativement en les désactivant, lereby la réduction de la complexité du modèle et en augmentant sa puissance prédictive.
- Vérifiez la qualité du modèle en comparant R 2, R 2 ajusté et prédit R 2 ainsi que le tracé de probabilité normale des résidus studentisés, résidus-vs-run, prédit-vs-réelle et Box-Cox 36 parcelles. Toutes les valeurs R 2 doivent être dans une fourchette de 0,2.
- Assurez - vous que le modèle final est d' accord avec les hypothèses de base de la physique et de la thermodynamique, par exemple , pas de concentrations négatives sont prédits.
- Utilisez le modèle pour prédire les conditions les plus favorables pour le système visé par l'enquête, voici une faible turbidité.
- Sélectionnez les réponses les plus importantes et leurs états préférés, par exemple la turbidité minimale. Combinez ces sélections en maximisant une fonction de désirabilité ou des outils similaires, qui sont intégrés dans les caractéristiques de plusieurs logiciels DoE 36.
- En fonction de l'application envisagée of le modèle, sélectionnez confirmation fonctionne pour vérifier les conditions optimales et / ou le pouvoir prédictif du modèle en général, par exemple , si les conditions prévus pour être le plus favorable ne faisaient pas partie de la première DoE sélectionnez - les comme des expériences de suivi.
5. Améliorer le modèle et vérifier la puissance prédictive
- Affinez l'espace de conception initiale à des conditions de fonctionnement les plus souhaitables, par exemple une faible turbidité dans la gamme 0-1000 unités néphélométriques de turbidité (NTU), basé sur les prédictions du modèle (4.2).
- Mettre en place un nouveau DoE dans ces gammes, notamment que les facteurs qui ont été identifiés comme significatifs ou pertinents (4.1.2)).
NOTE: Un facteur peut être important en termes d'analyse de modèle , mais sans importance pour un processus, à savoir son effet sur une réponse est <1% par rapport à celui d'autres facteurs. - Répétez les étapes 1-5.2 jusqu'à ce que la qualité des prédictions du modèle correspond aux requirements, par exemple l'écart type du modèle , comme indiqué par le logiciel est suffisante pour l'application envisagée. Modifier la stratégie expérimentale si nécessaire pour ces itérations, par exemple utiliser un seul floculant dans le raffinement.
- Transfert et confirmer les résultats du modèle à l'échelle vers le bas à l'échelle pilote ou à l'échelle de la production finale.
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Representative Results
Floculation de l'extrait de tabac avec différents polymères
Le procédé décrit ci - dessus a été utilisée avec succès pour développer un procédé pour la floculation des extraits de tabac lors de la fabrication d'un anticorps monoclonal (l'anticorps anti - VIH neutralisant 2G12) et une protéine fluorescente (DsRed) (figure 1) 16, et a depuis été transféré à d'autres protéines, y compris les lectines, les candidats vaccins contre le paludisme et les protéines de fusion (données non publiées). En règle générale, l'application de floculants a réduit la turbidité de l'extrait végétal de sac est filtré ~ 6000 NTU (10 000 NTU, après extraction) à ~ 1000 NTU. Dans une expérience de dépistage initial, une conception 91-run IV-optimal a été utilisé pour tester 18 polymères différents en trois concentrations différentes (parce que ce facteur affecte l' efficacité de floculation 13,27) et a observé la floculation sur une heure d' incubation paro ~ 12d (figure 2A et B). La longue période d'incubation peut être important d'identifier des délais significatifs pour le processus de floculation. Aussi des valeurs de pH de 4-8 ont été testés car ceux - ci peuvent être pertinents dans les processus futurs en raison des propriétés des protéines cibles spécifiques 13,25,27,37. Parmi les 18 polymères testés, six ont été trouvés pour réduire la turbidité extrait après le sac de filtration dans des extraits typiques avec une conductivité de 25 mS cm -1.
Le modèle a été raffiné par l' exclusion de tous les polymères inefficaces dans deux itérations et comprenant des paramètres de procédé supplémentaires, tels que la conductivité dans les 15-45 mS cm -1 gamme, un temps d'incubation de 5 à 75 min et des températures de 4-30 ° C, pour générer des modèles adaptés à un large éventail de conditions de traitement. Le pouvoir prédictif du modèle augmenté après chaque itération, ce qui entraîne un modèle très fiable (figure 3A). >
Après quatre itérations, cationique hautement chargée et polymère ramifié PEI a été trouvé pour être le plus efficace pour l'agrégation des particules dispersées dans des extraits de tabac. Cependant, l'efficacité de ce polymère a diminué avec l'augmentation de la conductivité extrait. Les propriétés de taille molécule, de charge, de la structure (linéaire ou ramifié), densité de charge et le degré de substitution amine (primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire) ont été testés en tant que facteurs dans un DoE et les deux derniers paramètres ont le plus grand effet. Les détails ont été signalés ailleurs 16. Sur la base de cette connaissance des propriétés des polymères à partir des résultats du DoE, cinq autres polymères ont été sélectionnés avec des caractéristiques moléculaires similaires à PEI (densité de charge> meq g -1 et amine quaternaire). L' un de ces cinq polymères ont démontré une plus grande efficacité de floculation à conductivités plus élevées (figure 3B) 11.
nt. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Dans le cadre de l'approche DoE, il a été confirmé qu'aucun des PEI affecté la récupération du produit dans l'une des conditions testées en effet la capacité des filtres de profondeur utilisé par la suite à retirer restant solides dispersés ont augmenté d'un facteur de 3,2-5,7, atteignant ~ 110 l m -2 selon le type de filtre. Ces résultats ont également été confirmés dans un processus à l'échelle pilote 100 l, dans pour lesquels l'application de floculants réduit la clarification les coûts de production par la PI> 50% et les coûts totaux de production de ~ 20%.
Figure 2: Efficacité des différents floculants dans des conditions de processus divers (A). échantillons d'extrait directement après floculation et sac de filtration peuvent encore apparaître turbide. (B) Après décantation pendant plusieurs heures, la turbidité de lamêmes échantillons peuvent être réduits de manière significative. Cependant, les valeurs de turbidité obtenues immédiatement après filtration sont souvent préférables parce que les temps de maintien prolongés peuvent ne pas être possible dans les procédés de fabrication à grande échelle. (C) de floculation est également efficace lorsqu'elle est appliquée à des extraits de plantes générées par une presse à vis au lieu d'un mélangeur comme indiqué par le liquide rouge clair au fond des tubes de 50 ml (la couleur rouge est due à la présence de la protéine fluorescente DsRed ). (D) des mélanges de différents floculants peuvent également induire la floculation.
Figure 3:. Modélisation floculation en utilisant une approche DoE (A) La précision du modèle prédictions ont augmenté le nombre de polymères dans le modèle a été réduit de dépistage initial au raffinement même si le nombre de paramètres de traitement est passé de two à cinq. (B) Changement de type de polymère (ici d'un PEI à l' autre) en raison d'un changement dans les paramètres du procédé (ici conductivité) maintient la floculation de particules efficace et à faible turbidité du filtrat correspondant par rapport à l' extrait de témoin non traité (ligne rouge solide). Les barres d'erreur dans A et B indiquent les écarts-types de prédictions du modèle. Lignes rouges pointillées indiquent les écarts - types de l'extrait non traité (n = 10). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Floculation de tabac extrait préparé avec une presse à vis
Les résultats de floculation ont également été transférés à partir d'extraits de tabac préparées avec un homogénéisateur à ceux préparés avec une presse à vis, ce qui produit moins de particules dispersées dans la gamme de taille mm mais plusdes particules dans la gamme de taille um. Dans un 29-run conception IV-optimale, il a été montré que PEI est également efficace pour ce type d'extrait dans une plage de concentration similaire et que la récupération des protéines cibles est pas affectée (figure 2C). Cela montre (i) que les conditions de floculation identifiées pour un type de charge d'alimentation peut être dans une certaine mesure transférée à d'autres stocks d'alimentation, un gain de temps au cours du développement du processus, et (ii) que la stratégie DoE peut être utilisée pour confirmer cette cessibilité non seulement pour conditions de processus individuels, mais sur l'espace de conception.
des expériences avec des mélanges de floculation floculants
Combinaisons de floculants peuvent être plus efficaces que les polymères simples, par exemple en raison de pontage plus renforcée entre les particules 12. Par conséquent, le procédé décrit ci-dessus a été adapté pour permettre l'addition de deux polymères (3.2) 26. Trois polymères non synthétiques ont été testés seuls, en combinaison les uns avec les autres ou combinés avec de la PEI. La floculation plus efficace des extraits de tabac a été réalisée avec de la PEI seule, mais une combinaison de la PEI et le chitosan ou les polyphosphates peut réduire la concentration de PEI nécessaire. En outre, l'approche DoE nous a permis d'identifier les combinaisons les polymères les plus efficaces lorsque l' omission PEI (avec ou sans chitosane et polyphosphates), contribuant ainsi à définir les conditions de floculation optimales dans les processus où PEI est incompatible avec la protéine cible, par exemple en raison des précipitations, comme rapporté pour βglucuronidase 24,25. En outre, le DoE a pu caractériser un espace de conception complexe pour laquelle aucun modèle mécaniste était disponible (figure 2D). En utilisant les outils ANOVA du logiciel DoE , il était possible de faire la distinction entre les modèles prédictifs fiables et homologues mal évalués (figure 4).
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Discussion
L'aspect le plus important à considérer lors de la mise en place d' un DoE pour caractériser la floculation des particules est que la conception doit en principe être en mesure de détecter et de décrire les effets prévus ou possibles 36,38, par exemple l'influence du pH, le type de polymère et la concentration de polymère 16. Par conséquent, il est important d'évaluer la fraction de l'espace de conception (FDS) avant de commencer les expériences réelles. Fds est la fraction de l'espace expérimental multidimensionnel (couvert par les facteurs de conception, par exemple le pH) à l' intérieur duquel il est possible de détecter des différences prédéfinies entre les deux résultats expérimentaux donnés d' un système de variation connue, par exemple la détection d' une différence de turbidité de 250 NTU donné une variabilité de 125 NTU. La FDS peut être augmentée en augmentant la conception avec des pistes supplémentaires et devrait être ≥0.95 pour les modèles destinés à guider le contrôle des processus 36. En outre, si le nombre de passages ne permet pas de til toute l'expérience à être effectuée en une seule journée, les blocs doivent être pré-définis dans le DoE pour tenir compte de lot à lot et de la variabilité au jour le jour. Lorsque l'on travaille avec du matériel végétal, l'inclusion d' une référence fonctionne dans chaque bloc (par exemple les contrôles non traités) aide à compenser la variabilité, ce qui permet la comparaison des données de plusieurs essais normalisés chacun à leur course de référence correspondante. Dans ce contexte, l'augmentation du nombre de passages répétés dans le DoE est également utile.
Quand un grand nombre de polymères sont sélectionnés, il est conseillé d'utiliser les propriétés individuelles de la floculants, la densité , par exemple de charge et de la masse moléculaire, en tant que facteurs numériques discrets plutôt que les polymères eux - mêmes des facteurs comme catégoriques. Cela réduit le nombre d'expériences, car les modèles expérimentaux ont souvent besoin d'être répliqué pour les facteurs catégoriques, alors que des niveaux supplémentaires de facteurs numériques seulement besoin d'un petit nombre de pistes supplémentaires. Les informations contente de l'expérience augmente et permet l'identification des propriétés des polymères qui améliorent la floculation, par exemple , une forte densité de charge que l'on trouve dans les expériences décrites ici aussi. CCD et RSM expérimentale dessins sont utiles pour établir des modèles avec une puissance prédictive élevée, permettant l'identification des conditions de traitement robustes (par exemple pour guider de commande de processus) et sont généralement utilisés pour le suivi des conceptions de dépistage. Si le nombre de facteurs et les facteurs niveaux sous résultats de l'enquête dans le DoE avec plus de 400 expériences individuelles, il peut être souhaitable de réduire le nombre de niveaux de facteurs ou de passer à d'autres types de conception parce que le nombre d'échantillons qui peut être facilement manipulé avec la technique présenté ici est limité à ~ 100 par jour.
D'un point de vue expérimental, les polymères doivent rester stables dans les conditions expérimentales choisies, par exemple , ils ne doivent pas dépolymériser à faible pH. Une préparation minutieuse du floculantles stocks en termes de concentration est également nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles et des modèles de haute qualité. Dans ce contexte, le floculant peut avoir besoin d'être prétraités, par exemple fois l' ajustement du pH ou de gonflement pour la chitine, pour assurer une solubilisation complète, et ainsi d'obtenir une solution homogène. Très visqueux actions doivent être évités car cela peut provoquer des erreurs de pipetage lors du transfert du polymère à l'extrait. De nombreux polymères peuvent avoir un effet tampon fort et les actions ont des valeurs de pH extrêmes, par exemple pH ~ 9,5 8% [p / v] PEI. Cela peut affecter le pH de l'extrait si les stocks ne sont pas pré-ajustées et fausser les résultats expérimentaux. Par exemple, si la floculation est plus efficace à pH élevé et un non-pH ajusté PEI stocks est utilisé alors un DoE pourrait suggérer que des concentrations élevées de PEI sont plus efficaces. Cependant, cet effet sera causé par le pH plus élevé causé par le plus grand volume de stock qui a été ajouté, et non pas par l'augmentation pe de concentration de polymèrer soi. Les concentrations d'actions utilisées doivent aussi ressembler à celles qui sont utilisées dans des applications à grande échelle afin d'éviter des effets différents de dilution entre les échelles qui peuvent affecter la concentration en particules et donc la floculation. Des floculants à base d' argile tels que le kaolin contiennent un grand nombre de fines particules elles - mêmes qui peuvent masquer l'effet de floculation, par exemple la réduction de la turbidité après la filtration initiale, et d' autres réponses doivent être choisies pour évaluer l'efficacité de ces substances, par exemple , la capacité du filtre en aval.
Pour l' analyse des données , il est important d'évaluer les résultats recueillis en termes de valeurs extrêmes, les désalignements et la cohérence générale, par exemple , les valeurs extrêmes peuvent indiquer une erreur de copier-coller, un changement dans la virgule ou un dysfonctionnement des dispositifs d' analyse de l' équipement /. Une analyse approfondie fera en sorte que seules les données de haute qualité sont utilisés pour la construction de modèles. Au cours de la construction du modèle, il est important d'évaluer en permanence ee large ensemble d'indicateurs de qualité fournis par le logiciel DoE. Les critères les plus élémentaires sont les R 2, ajustée R 2 et prédit R 2 valeurs, mais les résidus normaux, résidus-vs-course et réelle-vs-prédits parcelles (Figure 4) sont encore plus importants car ils fournissent des informations sur chaque parcours en une expérience plutôt que d'un paramètre de somme. En outre, il faut toujours étudié la cohérence du modèle final et ses prédictions avec les mécanismes connus de floculation. Les principaux écarts entre les prévisions et les attentes scientifiques peuvent se produire parce que les modèles DoE ne sont descriptives plutôt que mécaniste, par exemple , les modèles peuvent prédire les valeurs extrêmes sur les bords d'un espace de conception reflétant l'utilisation d'algorithmes d' ajustement de polynômes.
Figure 4:. Les indicateurs de qualité des modèles DoE Le pasparcelle rmal des résidus studentisés devrait ressembler à une ligne droite aussi près que possible (A) avec seulement des écarts mineurs (flèches vertes) acceptables pour les modèles de haute qualité. Une apparence courbe (C) avec des écarts forts (flèches rouges) de la ligne idéale (rouge) indique un mauvais modèle, par exemple , en raison du manque des facteurs importants. En fin de compte, le prédit et les valeurs expérimentales (réelles) doit correspondre (B) et à nouveau suivre une ligne droite. Déviations de la ligne idéale (cercle rouge et une ligne pointillée) indiquent les prévisions des modèles pauvres (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'approche DoE peut aider à caractériser la floculation des stocks d'alimentation complexes tels que les extraits de plantes, même s'il n'y a pas de données existantes. La floculation des extraits de tabac a été optimisé avec une charge de travail de 2 nouseks et consommables coûts de ~ 500 €. Cela réduit le nombre de filtres de profondeur requis pour un seul lot à l'échelle pilote impliquant ~ 800 L d'extrait de plante de 60%, qui a réalisé une réduction correspondante des coûts de consommables.
Les floculants ont également été appliqués aux différents extraits de plantes et d'homogénats de culture cellulaire. Bien que le même agent floculant est efficace pour toutes ces charges d'alimentation, la concentration en polymère doit être ajustée afin de tenir compte des différentes concentrations de particules dispersées. En outre, une fois qu'un polymère efficace a été identifié, peuvent devoir être ajustés pour correspondre à la distribution des tailles de particules différentes 11 la filtration et / ou centrifugation étapes.
La méthode décrite ici peut facilement être adapté à d'autres stocks d'alimentation et est donc également pertinente pour les scientifiques et les ingénieurs en développement de stratégies de clarification pour les cultures de cellules de mammifères et des processus de production alimentaire / aliments pour animaux. Especially processus à base de plantes bénéficieront des volumes d'échantillons intermédiaires suggéré ici parce que des extraits de plantes peuvent contenir des particules jusqu'à 1 mm de diamètre qui sont incompatibles avec les formats de microplaques 21, par exemple parce que la dynamique de mélange diffèrent en raison d'un diamètre de particule rapport de la cuve de diamètre est pas représentatif de l'échelle du procédé.
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Disclosures
L'auteur n'a aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
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